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अलगाव और वयस्क माउस तंत्रिका स्टेम सेल के विस्तार Neurosphere परख का उपयोग

Neuroscience

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Summary

यह वीडियो प्रोटोकॉल neurosphere परख करने के लिए पैदा करते हैं और वयस्क माउस periventricular क्षेत्र से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार विधि दर्शाता है, और तकनीकी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है सुनिश्चित करने के लिए के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य neurosphere संस्कृतियों प्राप्त कर सकते हैं.

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Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393, doi:10.3791/2393 (2010).

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Abstract

अलगाव और ख्यात वयस्क murine मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के विस्तार के पहले रेनॉल्ड्स और Weiss द्वारा वर्णित किया गया था 1992 में एक रासायनिक परिभाषित सीरम मुक्त संस्कृति neurosphere परख (एनएसए) के रूप में जाना जाता है प्रणाली को रोजगार. इस परख में, विभेदित सेल प्रकार के बहुमत संस्कृति के कुछ दिनों के भीतर मर जाते हैं, लेकिन वृद्धि कारक उत्तरदायी अग्रदूत साबित कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी epidermal वृद्धि कारक (EGF) और / बुनियादी fibroblastic वृद्धि कारक (bFGF) की उपस्थिति में सक्रिय प्रसार से गुजरना. इन कोशिकाओं undifferentiated neurospheres नामक कोशिकाओं, जो बारी में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के पूल का विस्तार subcultured किया जा सकता है की कालोनियों के रूप में. इसके अलावा, कोशिकाओं के लिए अंतर प्रेरित किया जा सकता है, सीएनएस यानी न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes के तीन प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं पैदा. इस परख के लिए एक सुसंगत, undifferentiated सीएनएस व्यापारियों, जो इन विट्रो अध्ययन में और भी उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के अक्षय स्रोत की आपूर्ति के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है.

यह वीडियो एनएसए उत्पन्न करने के लिए और वयस्क माउस periventricular क्षेत्र से एनएससी का विस्तार विधि को दर्शाता है, और तकनीकी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है सुनिश्चित करने के लिए के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य neurosphere संस्कृतियों प्राप्त कर सकते हैं. प्रक्रिया वयस्क माउस, periventricular क्षेत्र के सूक्ष्म - विच्छेदन, ऊतक तैयारी में एनएसए और संस्कृति से मस्तिष्क संचयन शामिल हैं. पहले काटा ऊतक रासायनिक एनएससी माध्यम trypsin - EDTA और तो यंत्रवत् अलग उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन को प्राप्त करने और अंत में एनएसए में चढ़ाया पचा. संस्कृति में 7-10 दिनों के बाद, जिसके परिणामस्वरूप प्राथमिक neurospheres subculture के लिए भविष्य के प्रयोगों के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा तक पहुँचने के लिए तैयार हैं.

Protocol

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Discussion

neurosphere 2 परख अलगाव और 4-5 सीएनएस से एनएससी के अध्ययन के लिए न केवल, लेकिन यह भी कई ऊतकों से ख्यात स्टेम 6 स्तन और 7 दिल जैसे, कोशिकाओं के अन्य प्रकार के अलगाव के लिए अनुसंधान समुदाय में व्यापक ध्यान प्राप्त किया है और मस्तिष्क, स्तन, और बृहदान्त्र ट्यूमर स्टेम 8-9 सुझाव है कि इस संस्कृति प्रणाली दैहिक और पूरे शरीर में ट्यूमर के अग्रदूत सेल आबादी के एक नंबर के लिए लागू किया जा सकता है कोशिकाओं की पहचान के लिए. इस विधि के लाभ में से कुछ अपनी सादगी, reproducibility और ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा या भी एक रासायनिक परिभाषित सीरम मुक्त माध्यम में कक्षों की एक छोटी संख्या से कोशिकाओं के अनिश्चित संख्या के उत्पादन में शामिल हैं.

यह जोर दिया जाना है कि संस्कृति में neurospheres की संख्या स्टेम कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रतिनिधित्व नहीं neurospheres सदाशयी स्टेम कोशिकाओं से या तो या अधिक प्रतिबंधित पूर्वज 10 कोशिकाओं से व्युत्पन्न किया जा सकता है चाहिए. इस संबंध में एक परख के लिए सही ढंग से संस्कृति में 11 एनएससी एन्यूमरेट करने के लिए विकसित किया गया है.

विभिन्न तरीकों के लिए एकल कक्ष निलंबन में यांत्रिक और enzymatic तरीकों सहित neurospheres को अलग कर देना करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि यांत्रिक विधि मूल neurosphere हदबंदी 2 विधि है, यह अनुभव का एक बहुत आवश्यकता है और अपनी दक्षता ऑपरेटर पर निर्भर करता है . इस विधि भी महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु और नुकसान का कारण अगर एक अनुभवहीन व्यक्ति है, जो assays कि neurosphere हदबंदी तीन पर भरोसा करते हैं की सटीकता को कम कर सकते हैं द्वारा लागू हो सकता है. Trypsin - EDTA enzymatic पृथक्करण भी कुछ फायदे और नुकसान है. Neurospheres के enzymatic पृथक्करण, कुशल आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है अगर समय की उचित लंबाई के लिए और सही आकार neurospheres पर प्रदर्शन किया. यद्यपि वहाँ पक्ष neurosphere हदबंदी के इन दो विधियों के प्रभाव की तुलना अध्ययन द्वारा कोई पक्ष हैं, हमारे अनुभव से पता चलता है कि neurospheres (3-5 मिनट) के एक संक्षिप्त (250 सुक्ष्ममापी) के साथ एक कुशल हदबंदी में trypsin EDTA परिणाम ऊष्मायन उनके व्यवहार्यता, प्रसार, और भेदभाव क्षमताओं को परेशान किए बिना. दूसरी ओर, neurospheres की लंबी जोखिम trypsin - EDTA के लिए (विशेष रूप से बड़े ऊंचा हो गया neurospheres) कोशिका की सतह रिसेप्टर्स, सेल पाचन और संभवतः कोशिका मृत्यु को गंभीर क्षति का कारण हो सकता है. Trypsin - EDTA के लिए overexposure भी क्षेत्र का गठन और कारण कोशिकाओं के साथ हस्तक्षेप करने के लिए सब्सट्रेट करने के लिए देते हैं और अंतर हो सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम Overstreet फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701
%0.05 trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
*MEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4034 HEM component
*Distilled water Reagent GIBCO, by Life Technologies 15230-147
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

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References

  1. Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
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  10. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  11. Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. (2008).

Comments

1 Comment

  1. Please email me at azari.hassan@gmail.com if you have any questions regarding this assay.

    Reply
    Posted by: Hassan A.
    May 13, 2011 - 6:59 PM

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