Механическое раздражение Стволовые клетки Использование Циклические одноосной деформации

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это широко известно, что механические силы в организме может влиять на дифференциации и пролиферации клеток. Здесь мы представляем видео-протокол, демонстрирующие использование заказных биореактор для доставки одноосной деформации растяжения циклических со стволовыми клетками, культивируемые на гибких подложках micropatterned.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kurpinski, K., Li, S. Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain. J. Vis. Exp. (6), e242, doi:10.3791/242 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Роль механических сил в развитие и поддержание биологической ткани хорошо документирована, в том числе несколько механически регулируемые такие явления, как костного ремоделирования, мышечной гипертрофии, пластичность и гладкой мышечной клетки. Однако силы, участвующие зачастую крайне сложным и трудным для мониторинга и контроля в естественных условиях. Для того чтобы лучше изучить влияние механических сил на клетки, мы разработали в пробирке способ применения одноосной деформации растяжения циклические к прилипшие клетки культивировали на упругие мембраны. Этот метод использует специально разработанный биореактор с моторизованной камеры ротора система применить желаемую силу. Здесь мы представляем шаг за шагом, видео-демонстрации того, как протокол для сборки различных компонентов каждого "растянуть камера", в том числе, в данном случае, силиконовая мембрана с micropatterned топографии ориентироваться клеток с направлением деформации. Мы также описываем процедуры стерилизации камеры, посев клеток на мембране, фиксации камеры в биореакторе, а также настройка механических параметров (например, величины и скорости деформации). Процедуры, изложенные в данном протоколе, специфичные для посева мезенхимальных стволовых клеток человека на силиконовой мембраны с 10 мкм широкие каналы ориентированы параллельно направлению деформации. Тем не менее, методы и материалы, представленные в этой системе являются достаточно гибкими, чтобы приспособить количество вариаций на эту тему: скорости деформации, величины, продолжительности, типа клеток, мембран топографии, мембранного покрытия и т.д. могут быть адаптированы к нужного приложения или результат. Это надежный метод исследования эффектов одноосной деформации растяжения, примененных к ячейкам в пробирке.

Protocol

День 0 - Стерилизация до дня эксперимента

  1. Положите материалов в пластиковые ванны и стерилизовать 70% спиртом в течение 2 часов:
    • Палатах
    • Крышки
    • Рамки (все 3 штуки)
    • Винты
    • Резиновые прокладки
    • Щипцы
    • Ножницы
    • Шестигранные ключи
  2. Чистая мембран с Aquet мыла и дистиллированной воды.
  3. Разрушать ультразвуком мембран в 70% спирте в течение 10 минут.
  4. Место чистой мембраны в пластиковые квадратные блюда. При использовании узорной мембран, убедитесь, что узорной сторона лицевой стороной вверх (спрей алкоголя на одну сторону мембраны и следить за жидкость стекать канавки).
  5. Оставьте мембраны покрыты 70% спирта в течение 2 часов.
  6. Пакет перчатки в алюминиевую фольгу для автоклавирования завтра утром.
  7. Сделайте 2% (вес / объем) раствора желатина (2g/100mL) в дистиллированной воде для автоклавирования завтра.
  8. После 2 часов стерилизации в 70% спиртом, поместите все полимерных материалов и мембран (не автоклавируемый материалов) в капоте для ночного УФ:
    • Палатах
    • Крышки
    • Рамки (все 3 штуки)
    • Мембраны
  9. Остальные обновления материалов в автоклавируемый мешок:
    • Винты
    • Резиновые прокладки
    • Щипцы
    • Ножницы
    • Шестигранные ключи

День 1 - Монтаж натяжных камер

  1. Автоклав щипцы, ножницы, шестнадцатеричные ключи, болты, прокладки, перчатки, и желатин с использованием малых автоклаве при температуре 240 ° F в течение 20 минут общего
  2. Удалить мембран от УФ и обработать плазмой O 2 (узорные стороной вверх) для ~ 1 минуту.
  3. В капоте ТС, крышка узорной области плазмы рассматривается мембран с желатином. Пальто 30 минуты под УФ.
  4. Промыть каждую мембрану с PBS 2X. После второго мытья, оставить некоторые PBS на мембранах, чтобы держать их скользкими, для облегчения сборки в камерах. (Если использовать эту PBS для смазки прокладок для облегчения сборки).
  5. Соберите мембран в камеры (износ автоклавного перчатки во время сборки)
    1. Подключение двух основных частей каркаса с помощью одного винта.
    2. Флип кадр снова и место мембраны на вершине, так что желатин покрытием боковых поверхностей к раме (узорные области должны быть в центре).
    3. Безопасные мембраны раме с помощью прокладки на каждой стороне.
    4. Пресс прокладки, используя нежные, даже давление, чтобы не разорвать мембрану.
  6. Прикрепите собранный кадр T-бар.
  7. Флип кадра и поместить в камеру с ног на голову. УФ стороне задней раме и мембраны в течение 30 минут
  8. Флип кадр еще раз, и винт на камеры (без изменений для управления камерой, но для натяжных камеры, необходимо использовать два винта, чтобы прикрепить конец кусок кадра на дно камеры, и необходимо удалить одним винтом, который проведение двух частей кадра вместе). УФ-лицевую сторону в течение 30 мин. Убедитесь, что мембраны полностью высохнуть, прежде чем переходить к следующему шагу, иначе клетка решение может соскользнуть во время посева.
  9. Семенной клеток. Площадь 1 пластина = 3 Площадь мембраны, так что используйте 1 / 3 от сливной пластины в мембране. Используйте 1 мл клеточной раствора на мембране. Любой более 1,5 мл будет трудно сохранять раствор далее. Положите клетка решение только на узорной области, а также использовать пипетки распространять решения вокруг. Обложка камер и пусть клетки приложить на 30 минут РТ в капюшон.
  10. Перемещение камеры в инкубатор и пусть клетки прикрепите еще 1 час. Будьте очень осторожны, движущихся камер, чтобы избежать позволяя клетка решение соскользнуть! Клеток в том, что камера будет разрушен, если решение падает в этой точке.
  11. Вернуться к камере капот и добавить 20 мл СМИ.
  12. Место камер в спиртовой ванне очищают, которая покрыта алюминиевой фольгой (также распыляются с алкоголем). Перемещение камеры, чтобы растянуть инкубатора (10% CO 2).
  13. Безопасные камер в растянуть машину. Давайте клетки дальнейшем приложите на ночь, и начать растягивать на следующий день. (Примечание: при вводе в камерах растянуть машину, не забудьте заблокировать машину в «нулевой» позиции перед размещением камер и затяните резинкой вокруг передач Не забудьте разблокировать передач перед запуском машины.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Бэйнс и соавт. первые сообщили об использовании системы для механической стимуляции клеток в пробирке с помощью гибкой подложке эластомерных доставить механической силы к клеткам 1. Начиная с этого времени, много вариаций на эту дизайна были задуманы и реализованы. Несколько механических систем растянуть имеются в продаже под названием "Flexercell" (Flexcell Международная корпорация), в то время как некоторые лаборатории использования заказных устройств. В этом видео протокола мы описали установку и использование одной из таких устройств в нашей лаборатории.

На заказ "растянуть машину", изображенная на этом протоколе была использована в различных исследований для изучения влияния одноосной деформации циклических на разных типах клеток 2,3. Эта машина представляет собой универсальный аппарат с несколькими регулируемыми параметрами, которые могут быть использованы для различных механических исследований штамма. Установка изображенного здесь представляет собой уникальный и надежный способ доставки одноосной деформации на циклическую прилипшие клетки в культуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fungizone Reagent Lonza Inc. 17-836R aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C.
Kanamycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15160-054 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C.
Gentamicin Reagent Lonza Inc. 17-518Z 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C.
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122 1% final. (Also available from other companies)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Reagent GIBCO, by Life Technologies 11966-025
Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
  2. Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
  3. Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).

Comments

4 Comments

  1. very nice - thought you might find this article of interest: Winter LC, Annals of Biomedical Engineering, 30:1²4², ²00²   by the way - what were the conditions (gas, time, temp) of your plasma treatment - cheers JŒl D. Bumgardner, PhD, Associate Professor (jbmgrdnr@memphis.edu)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2008 - 9:33 AM
  2. The treatment was oxygen plasma for 1 minute. Unfortunately, I don't know the precise temperature because there's no thermocouple inside the chamber, and it's not under any sort of temperature control. The unit starts at room temp and definitely increases as time gŒs on, but I don't know the exact range that occurs within that minute of treatment. However, if you need this additional information, the manufactuer might be able to assist you. We used a "Plasma-Prep II" unit from SPI Supplies. Hope this helps! Kyle Kurpinski, PhD Candidate, UCSF/UCB Joint Graduate Group in BiŒngineering P.S. Thanks for the article. Very interesting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2008 - 2:31 PM
  3. Hi thank you for your nice design for stretching device. I appreciate if you inform me about material of chamber and frames.   we have made a device for cell membarne stretching with possibility of tuning strain parameters such as frequency, amplitude and etc. do you see that useful for cell studies?   Mohsen

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 5:42 PM
  4. Hi Moshen, We used polysulfone to make the chambers. It's easily machined and it's relatively thermostable. The setup described in this video is also tunable in terms of frequency and amplitude of strain, and yes, we have found the controllability of these parameters to be quite useful in our studies. Thanks for the comments! Kyle Kurpinski, PhD Candidate, UCSF/UCB Joint Graduate Group in BiŒngineering

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 23, 2008 - 2:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics