Микротитровальные Блюдо образование биопленки Пробирной

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Анализ описывает быстрый способ для измерения раннего образования биопленки у бактерий и грибков. Этот метод использует планшет в качестве субстрата для микробной образование биопленки и биопленки визуализируется использованием штамма кристаллический фиолетовый. Препарат обеспечивает либо качественных или количественных тест для раннего образования биопленки.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437, doi:10.3791/2437 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Рост биопленки

  1. Рост культуры дикого типа синегнойной палочки или мутантный штамм в течение ночи в богатой среде (т.е. LB)
  2. Развести более 1:100 культуры ночь в свежую среду для биопленки анализов. Стандартной среде анализа биопленки для P. палочки М63 является минимальным среде, дополненной сульфата магния, глюкозы и casamino кислот (см. таблицу). В качестве альтернативы биопленки способствующих среда, которая стимулирует рост менее планктонных и более надежные биопленки, глюкозу и кислоты casamino может быть заменен на аргинин в качестве единственного источником углерода и энергии.
  3. Добавить 100 мкл разведения на лунку в 96-блюдо. Для количественного анализов, мы обычно используем 4-8 повторить скважин для каждой процедуры.
  4. Инкубируйте планшет в течение 4-24 часов при 37 ° C.

2. Окрашивание биопленки

  1. После инкубации дампа клетки, поворачивая пластину снова и вытряхивая жидкости.
  2. Осторожно погрузите пластину в небольшой ванной воды (то есть использование дне пипетки коробки наконечник для P1000 pipetmen как ванна). Вытряхните воды. Повторите эту процедуру второй раз. Этот шаг поможет удалить одиноких клеток и СМИ компоненты, которые могут быть окрашены в следующем шаге, а также значительно снижает фоновый окрашивания.
  3. Добавить 125 мкл 0,1% раствора кристаллического фиолетового в воде в каждую лунку планшета. Надевайте перчатки и халат, делая решение. Соблюдайте осторожность при взвешивания резюме в порошок гигроскопичны и легко пятна одежды, кожи и т.д.
  4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
  5. Промыть пластины 3-4 раза водой путем погружения в ванну с водой, как указано выше, вытряхнуть и промокните энергично на стопку бумажных полотенцах, чтобы избавиться пластина все лишние клетки и красителя.
  6. Включите планшет с ног на голову и высушить в течение нескольких часов или на ночь.
  7. Для качественного анализов, скважин можно сфотографироваться в сухом состоянии.

3. Количественная биопленки

  1. Добавить 125 мкл 30% уксусной кислоты в воде в каждую лунку планшета для растворения резюме.
  2. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
  3. Передача 125 мкл солюбилизированного резюме на новое блюдо с плоским дном микротитровальных.
  4. Количественная поглощения в ридер при 550 нм с использованием 30% уксусной кислоты в воде, как пустой.

4. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Показывает, представитель результат для образования биопленки анализов проводится для синегнойной палочки, Pseudomonas флуоресцирующей и золотистый стафилококк. (А) вид сбоку и с биопленки П. палочки (8 часов, 37 ° С). (B), вид сбоку и с биопленки П. Циогезсепз (6 часов, 30 ° С). (C) сверху вниз из биопленки образуются С. золотистый в плоскодонных планшет (две скважины, 24 часа, 37 ° С). P. палочки и P. Циогезсепз оба подвижных организмов и форме биопленки на поверхности раздела воздух-жидкость. Золотистого стафилококка является неподвижные и формы биопленки на дне колодца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот метод может быть модифицирована для использования в самых разнообразных видов микроорганизмов. Подвижные микробы обычно придерживаются стен и / или днища колодцев, в то время как неподвижные микроорганизмы обычно придерживаются на дно скважины. Оптимальные условия для образования биопленки (т.е. ростовой среды, температуры, времени инкубации) должны быть определены эмпирически для каждого микроба. Я рекомендую выполнять несколько повторяет для каждого штамма или состояния (4-8), в том числе и положительного контроля, и, если возможно, отрицательный контроль на каждой пластине.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Спасибо Шерри Кучма, Пит Ньюэлл и Роберт Шанкс для обеспечения изображения на рисунке 1. Эта работа была поддержана NIH грант R01AI083256 в ГАО

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X M63 Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
K2HPO4 Fisher Scientific P288-500
(NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A5132
Magnesium sulfate Fisher Scientific M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose Fisher Scientific D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids BD Biosciences 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine Sigma-Aldrich A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates BD Biosciences 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids BD Biosciences 353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet Sigma-Aldrich 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  2. O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
  3. Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  4. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
  5. Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
  6. Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
  7. Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
  8. Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
  9. Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
  10. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  11. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).

Comments

2 Comments

  1. Please advise me on the subscribtion as my librarian tried to do the subscribtion but she failed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 21, 2011 - 7:23 PM
  2. Hello Najla - What school you attend and whom is your librarian? If they are attempting to subscribe I can absolutely assist them in doing so.

    Best wishes,

    Ward Parry
    Director of Library Relations

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 10:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics