أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx. J. Vis. Exp. (6), e244, doi:10.3791/244 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نحن لشرح التقنيات الأساسية لتسجيل التصحيح قبل المشبكي المشبك في الكأس لهيلد ، الثدييات النظام العصبي المركزي العصب الطرفي. التسجيلات الكهربائية من المحطة قبل المشبكي يسمح للقياس إمكانات العمل ، والتيارات قناة الكالسيوم ، والانصهار الحويصلة (إيماس) واللاحقة امتصاص غشاء (الإلتقام). اندماج الحويصلات التي تحتوي على ناقل عصبي يسبب غشاء الحويصلة تضاف إلى غشاء الخلية من الكأس. وتقاس هذه الزيادة في كمية من غشاء الخلية وزيادة في السعة. تخفيض لاحق في السعة يشير الإلتقام ، وعملية امتصاص أو إزالة غشاء من غشاء الكأس. الإلتقام ، أمر ضروري للحفاظ على هيكل الكأس وإنما هو أيضا ضروري لتكوين الحويصلات التي ستكون مليئة العصبي للأحداث إيماس المستقبل. وقد التسجيلات السعة في الكأس لالمعقودة من الممكن قياس مباشرة وبسرعة الافراج الحويصلي والإلتقام لاحقة في محطة الثدييات العصبية الجهاز العصبي المركزي. بالإضافة ، يمكن قياس النشاط بعد المشبكي المقابلة في وقت واحد باستخدام التسجيلات المقترنة. وبالتالي تكوين صورة كاملة عن النشاط الكهربائي قبل المشبكي وبعد المشبكي في المشبك الجهاز العصبي المركزي يمكن تحقيقه باستخدام هذا الإعداد. هنا ، تعرض طرق تحضير شريحة ، معالم شكلية لتحديد من الكؤوس المعقودة ، وتقنيات التصحيح الأساسية لقط ، وأمثلة من التسجيلات لقياس السعة وإيماس الإلتقام.

Protocol

التصحيح المشبك الإعداد :

البصريات : البصريات ومهمة جدا للعثور على خلية جيدة ، وإنشاء موقف منه.

في محاولة للحصول على صورة واضحة من الخلايا : حواف حادة ، لينة يبحث الخلية.

مسح الحقل بالكامل للبحث عن الخلايا الرئيسية MNTB جيدة مع الكأس المرفقة. تدوير الطبق للبحث عن الكؤوس من زوايا مختلفة. في البداية ، وأنه موافق على محطة لممارسة شكل بالون.

اختيار الخلية على سطح شريحة ، أو في الطبقة الثانية والخلية 2. الهدف الأول 1 / 3 الثالث من الزنازين مع ماصة

تحديد Calyxes : لغشاء مزدوجة (انظر الشكل 1) انظر ، وتناوب على طبق شريحة لرؤيتها من زوايا مختلفة للمساعدة على تأكيد أنها الكأس.

الشكل 1
الشكل 1

عمق كاليكس : كاليكس ينبغي أن يكون على السطح أو على مقربة من سطح ممكن.

السطحية المتاحة من أجل التصحيح : استخدام مقبض غرامة التركيز على المجهر لتحديد كيفية "واسعة / العميق" من الكأس هو. على سبيل المثال ، سوف ~ 10 ٪ من كامل بدوره على التركيز غرامة تعطيك أكثر من مساحة كافية لرأب الصدع على.

الختم على خلية قبل المشبكي : للوصول إلى خلية المرفقة ، والبحث عن تشوه "صغير" على سطح الخلايا نتيجة للضغط على نقاط البيع (~ 0.15psi) في ماصة ، واستخدام مناور ماصة لتشغيل أعلى والأسفل وعبر ، وحتى في سطح محطة presyn للحصول على تشوه جيدة ، ثم حرر الضغط والشفط تطبيق ، إذا لزم الأمر.

PULSE ، وبيانات حيازة برنامج :

الحاجة إلى زيادة حجم المخزن المؤقت قبل الاستخدام لأول مرة ، وكلما لزمت بواسطة القدرة أخذ العينات.

تحتاج إلى تحميل وحدات الماكرو تعديل في كل مرة.

تقاطع السائلة المحتملة : الحل هو تسجيل Presyn - 11mV (11mV سلبية).

Presyn : Cslow = ~ 15 PF

روبية للشركات presyn : 10 μsec ، 65 ٪ (أكثر التعويض قد أمكن ث / خارج التذبذبات)

قبل تسجيل السعة : اختبار الاسترخاء الحالية (10 فولت و 10 مللي ثانية القفزة) لمعرفة ما إذا كان هو الاسترخاء monoexponential ، أي ما إذا كان يمكن أن تكون على غرار مصطلح presyn حجرة واحدة.

مرشحات : تعيين في 30 كيلوهرتز و 10 كيلوهرتز (بسل تصفية 1 و 2 على التوالي) خلال قياس الاسترخاء ، للتأكد من عدم ضياع سريع مكون من جرا.

خلال التسجيلات صغيرة ، وتستخدم شين شنغ 10 كيلوهرتز و5kHz. طلب مني أن LGW فقط استخدام تصفية مجموعة 1 في 30 كيلوهرتز للتأكد من أننا يمكن قياس الارتفاع مرة وصغيرة.

تسمية الملفات : 7 أرقام 000mmxx ، حيث mm هو الشهر (أو الشهر والسنة) وxx هو عدد الخلايا.

تنظيف خطوط الحل : تتبع خطوط تنظيفها في نهاية التجربة مع 20 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 M بواسطة ddH2O 200 مل.

يتم تدوير الحلول الخارجية ، وسرعة المضخة 20-30 دورة في الدقيقة.

(حل عودته من غرفة حمام تدفقات العودة إلى الاسطوانة).

إنشاء 3 خطوط المنتهية ولايته لضمان امتصاص كافية.

ماصة الحل تسجيل قبل المشبكي : ~ 310 ملي Osmolar

Presyn الحل يجب أن يكون 310 ~ mOsm لمنع وصول R - الزيادة خلال التجربة.

Presyn ماصة حل يختلف postsyn ماصة الحل (ATP & Presyn وقد GTP لالسابقين).

TTX الشاي محلول (كاليفورنيا لعزل التيارات) :

  • محاولة تطبيق بعد الختم ، أو حتى ترميم ، على الخلية ، والشاي في كتل حل K - القنوات وdepolarizes الخلية. هذا ليس جيدا بالنسبة للخلية. للسبب نفسه ، فإنه قد لا يكون من الممكن إعادة استخدام شريحة بعد تطبيق TTX.
  • قارن الاستجابة الأولى والأخيرة للخلية ، أو شريحة للتحقق من أي تأثير الاستقطاب لفترات طويلة.
  • يستخدم TTX في 1 ميكرومتر بدلا من 0.5 ميكرومتر حتى تأثير أسرع. في حاجة إلى الانتظار وقتا أقل بعد تغيير الحلول.

قطع شرائح

ضبط Vibratome :

  • 70Hz الاهتزازات الوحشي
  • السعة : 1.0 ملم
  • سرعة إلى الأمام 0،01-0،02 مم / ثانية ، بينما قطع شرائح مع الكأس ، 0.1 سمك خلاف ذلك : 180 ميكرون (~ 150ميكرومتر في الحيوانات الاكبر سنا)

شرائح احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (ويشمل وقت القطع) ، أي ترك في الحمام بعد قطع 15-20 دقيقة.

ماصات :

Presyn : 3،5-4،5 MΩ في البداية ، 3،0-3،5 MΩ عندما تشعر بمزيد من الثقة

دليل استخدام مجتذب لضبط الإعدادات. استخدام ميزة تأخير بسبب الزجاج السميك (التأخير من 200 أو 1 العمل)

نوع الزجاج : البورسليكات ، ومعيار الجدار ، أي خيوط

القطر الخارجي : 2.0 ملم

القطر الداخلي 1.16 مم

مدة العرض : 7.5 سم

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics