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 JoVE Neuroscience

Combinant colorant lipophile, In situ, immunohistochimie et l'histologie

1, 1, 2, 1

1Department of Biology, University of Iowa, 2Molecular Targeting Technologies, Inc.

Article
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    Summary

    Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

    Date Published: 3/17/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2451

    Cite this Article

    Duncan, J., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology. J. Vis. Exp. (49), e2451, doi:10.3791/2451 (2011).

    Abstract

    Au-delà de la fonction du gène simple de couper profondément dans les réseaux de régulation génétique nécessite de multiples mutations combinées dans un seul animal. Une telle analyse de deux ou plusieurs gènes doit être complétée par hybridation in situ d'autres gènes, ou immunohistochimie de leurs protéines, en tout monté organes en développement ou des sections pour la résolution détaillée des altérations de l'expression cellulaire et tissulaire. Combinant des altérations de gènes multiples nécessite l'utilisation de la CRE ou au conditionnel flipase supprimer les gènes et d'éviter la létalité embryonnaire. Les schémas de sélection requis améliorer considérablement les efforts et le coût proportionnel au nombre de gènes mutés, avec un résultat de très peu d'animaux avec le répertoire complet des modifications génétiques souhaitées. Amortir la vaste quantité d'efforts et de temps pour obtenir ces quelques spécimens précieux, qui sont porteuses de mutations multiples nécessite l'optimisation des tissus. Par ailleurs, une enquête sur un seul animal avec des techniques multiples, il est plus facile de mettre en corrélation des défauts délétion du gène avec des profils d'expression. Nous avons développé une technique pour obtenir une analyse plus approfondie d'un animal donné, avec la capacité d'analyser plusieurs structures histologiquement identifiable ainsi que l'expression des gènes et des protéines tout à partir du même échantillon dans les deux organes tout monté et sections. Bien que les souris ont été utilisés pour démontrer l'efficacité de cette technique, il peut être appliqué à un large éventail d'animaux. Pour ce faire, nous combinons lipophiles colorant de traçage, monter toute l'hybridation in situ, immunohistochimie et l'histologie pour extraire la quantité maximale possible de données.

    Protocol

    1. Lipophiles injection de colorant

    Préparation des tissus:

    Tous les dissections des tissus et des manipulations sont réalisées sur des animaux fixés dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) par perfusion transcardial utilisant des pompes péristaltiques avec des aiguilles de taille appropriée. Les tissus peuvent être stockés dans 4% PFA dans le réfrigérateur pendant jusqu'à 6 mois. Toutes les préparations et les manipulations sont effectuées dans 0,4% ou plus PFA jusqu'au montage avec le glycérol pour l'imagerie. Ce montant de PFA élimine efficacement RNases et préserve l'ARN pour l'hybridation in situ.

    Stockage Dye:

    Tous les colorants doivent être stockés dans un compartiment sombre et fermé pour minimiser la circulation d'air et l'exposition à lumière du jour, comme ils sont photosensibles. Pour éviter la contamination croisée, un ensemble distinct d'instruments devraient être utilisés pour traiter chaque colorant.

    1. Tout d'abord, un site d'application pour le colorant doit être choisie et tissus étrangers extraite afin de confirmer visuellement l'emplacement choisi, et l'accès pour le placement de la teinture. Choisir le site d'application est l'étape la plus importante dans ce processus. Choisir un bon site pour l'étiquette de la population neuronale en cours d'examen et non les structures extérieures peuvent être difficiles. La précision du placement dans un tube donné sous contrôle visuel dans le champ de dissection exige un certain niveau de compréhension de la neuroanatomie en question. Dye peut être soit placé au centre ou en périphérie d'étiqueter les projections périphérique ou central, respectivement, au besoin pour un projet donné (cerveau-dire, les nerfs périphériques, des oreilles, des yeux). Colorants Lipophic se diffuse dans tous les processus appartenant à un neurone donné, à la fois rétrograde et anterogradely, en remplissant un neurone donné ou tous les neurones projetant dans une piste donnée.
    2. NeuroVue colorant de MTTI est livré pré-chargé sur les bandes de filtrage pour une application facile. Dye peut également être dissous dans 100% de DMSO (travail sous le capot) et les cheveux minces peuvent être trempés dans cette solution et ensuite séchés pour les petites applications. La teinture du papier filtre préchargé est coupé en morceaux de taille appropriée triangulaire avec microciseaux. La taille de la teinture va dépendre de la taille de l'échantillon, la taille de la structure étant étiquetées, et nombre de couleurs utilisées simultanément. Veillez à couper le plus petit d'une pièce que possible pour éviter l'étiquetage d'autres structures. Après avoir utilisé microsissors pour la coupe et pince pour manipuler le colorant agiter les instruments dans l'alcool pour enlever tout résidu de teinture, puis sécher à l'air complètement, ou tamponner avec du papier. C'est pour éviter de contaminer l'échantillon avec de la teinture résiduels sur les instruments qui peuvent l'étiquette des structures indésirables.
    3. Pour l'insertion dans les tissus mous comme le cerveau, le filtre peut être inséré directement en utilisant un point du triangle de filtre pour percer le tissu. Pour plus de tissus rigides faire une incision pour permettre une insertion plus facile de colorant. Ne pas utiliser une aiguille à dissection pour pousser filtre en tissu. Cela peut causer de placement imprécis et perturbations du tissu. Insérer des longueurs d'onde suppléant de NeuroVue colorant comme nécessaire pour l'étiquetage des populations neuronales supplémentaires.
    4. Après avoir inséré le colorant, et en vérifiant sa position, des spécimens sont placés dans un flacon hermétiquement clos avec 4% PFA et incubées à 36 ° C dans l'obscurité pendant 2-14 jours en fonction de l'âge et la distance de diffusion pour être couverts (environ 2 mm par jours à 36 ° C).
    5. Un microscope à dissection avec epiflouresence peuvent être utilisés pour évaluer si le colorant a diffusé à l'endroit désiré, et l'échantillon peut être replacé dans la pépinière si la diffusion est jugée insuffisante. L'utilisation d'un champ normal, sans dissection epifluorescene pour détecter la diffusion sera sous-estimer la longueur réelle du colorant diffuse. Aussi, si la concentration de colorant est suffisamment élevée pour évaluer visuellement il peut causer l'absorption de trempe en utilisant la fluorescence émise.
    6. Le tissu désiré d'intérêt est disséqué et tout monté sur une lame avec le glycérol et lamelle pour l'imagerie avec un microscope confocal. Paramètres confocale sont décrites dans 1, 2. Si la taille des tissus inhibe toute fixation sur une lame, coupes sériées est nécessaire (voir ci-dessous). Plus de détails sur la préparation des tissus pour l'imagerie et de teinture des propriétés spectrales sont disponibles à: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf

    Figure 1
    Figure 1. Vue schématique d'expérience. L'oreille est exposée pour permettre la visualisation de toutes les structures. Colorant lipophile est ensuite injecté et a permis de diffuser. Après la diffusion des populations distinctes de neurones peut être vu étiquetés par différents colorants. Ensuite, l'hybridation in situ (Sox2) est effectuée sur l'oreille et l'expression des ARNm des étiquettes. L'immunohistochimie est ensuite réalisée(Myo7, la tubuline) pour visualiser l'expression des protéines. Suivi par les coupes histologiques dans lequel les deux hybridation in situ et immunohistochimie peuvent être visualisées.

    2. Hybridation in situ

    Dans le cas où vous voulez commencer par hybridation in situ (après quoi le traçage avec des colorants lipophiles sera impossible), se reporter à la préparation des tissus dans la partie 1. Chaque lavage, sauf si indiqué, est réalisée avec 2 ml de solution à température ambiante sur un onduleur / mixeur. Être sûr de travailler dans un endroit propre, RNase environnement libre.

    1. Déshydrater puis réhydrater les échantillons à travers une série de méthanol classés.
      1. 100% 1 heure pour la nuit à 4 ° C (en option: conserver les échantillons à -20 ° C dans du méthanol à 100%)
      2. 75% x 5 min. @ 4 ° C
      3. 50% x 5 min. @ 4 ° C
      4. 25% x 15 min. @ 4 ° C (ou jusqu'à ce que les puits de tissus)
      5. Transfert des échantillons à un tube Eppendorf de 2 ml (RNase).
    2. Laver trois fois dans du PBS (PBS 1x) et éteindre le four d'hybridation sur pour une utilisation future (60 ° C).
      1. PBS x 5 min.
      2. PBS x 5 min.
      3. PBS x 5 min.
    3. Tissus Digest avec 2 pi de 20mg / ml protéinase K stocks (Cat # Ambion AM2546) dans 2,0 ml de PBS frais.
      Réels temps de digestion PK dépend de l'âge de l'embryon. Ce qui suit est une estimation approximative du temps. Digestion doivent être étroitement surveillés que déprotéinisation est une étape critique. Sous-digestion se traduira par la pénétration de la sonde pauvres tout en sur-la digestion se traduira par une perte d'intégrité structurale. Un bon indicateur de la digestion est un changement dans le tissu de l'opaque à presque claire.
      Tableau 1. Temps de la digestion protéinase K sur le tissu de la souris.
      AGE (jour embryonnaire) Temps (minutes)
      E8.5 6
      E9.5 10
      E10.5 13
      E11.5 15
      E12.5 17
      E14.5 18
      E16.5 + 20 +
    4. Arrêtez la digestion par l'incubation des échantillons dans 4% des PFA pendant 5 min.
    5. Laver dans du PBS.
      1. PBS x 1 min.
      2. PBS x 5 min.
      3. PBS x 5 min.
      4. PBS x 5 min.
    6. Jeter PBS accordant une attention particulière afin d'éliminer autant que possible.
    7. Prehybridize échantillons: Incuber à 60 ° C sur l'onduleur dans 1,8 ml mélange d'hybridation pendant au moins 1 heure. Set bloc chauffant ISOTEMP à 85 ° C pour une utilisation future.
      1. Qu'une heure approche, dénaturer l'ADN de sperme de saumon (Invitrogen Cat n ​​° 15632-011) par incubation à 85 ° C pendant 10 min. Situé sur la glace jusqu'à utilisation.
    8. Après au moins 1 heure de préhybridation, ajouter 200 uL ADNss dénaturé et environ 100 ng de DIG-étiquetés ribosonde à chaque échantillon. Hybrider une nuit à 60 ° C dans un four à hybridation.
    9. Remplacer mélange d'hybridation avec 2 ml SSC 2X. Réglez les blocs de la chaleur ISOTEMP à 37 ° C et 70 ° C pour une utilisation future.
      1. Laver avec 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C dans un four à hybridation.
      2. Laver avec 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C dans un four à hybridation.
      3. Laver avec 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C dans un four à hybridation.
      4. Laver avec du SSC 2X x 60 min. @ 70 ° C dans le bloc thermique ISOTEMP.
      70 ° C supprime toute activité alcaline phosphatase endogène. C'est peut-être l'étape la plus importante vers la réduction de fond. La partie (d) peut être divisé en deux 30 minutes. lave afin de minimiser les dommages aux tissus.
    10. Laver avec du PBS x 5 min. Dégel RNase A enzyme sur la glace pour une utilisation future.
    11. Remplacer PBS et ajouter 1,0 ul de RNase A enzymatique (Fermentas EN0531 10mg / mL) x 60 min. @ 37 ° C dans le bloc thermique ISOTEMP (a 90 min. Période d'incubation est préférable si la sonde est très concentré).
    12. Jeter PBS / RNase A et laver 4 fois.
      1. Solution de lavage 1X x 10 min.
      2. Solution de lavage 1X x 10 min.
      3. Solution de lavage 1X x 10 min.
      4. Solution de lavage 1X x 60 min. @ 70 ° C dans le bloc thermique ISOTEMP.
    13. Incuber dans 1X tampon de blocage pendant 1 heure.
      1. A cette époque, préparer 2,0 ml de tampon de bloc et 1 ul (1:2000) anticorps anti-digoxigénine par échantillon. Inverser brièvement et laisser reposer à 4 ° C jusqu'à utilisation.
    14. Après une heure de tampon de bloc jeter et ajoutez 2,0 ml de tampon de bloc pré-absorbé + anticorps à des échantillons.
    15. Incuber une nuit.
    16. Jeter la solution bloc.
    17. Laver avec un tampon de lavage 1X.
      1. Tampon de lavage 1X x 5 min.
      2. Tampon de lavage 1X x 5 min.
      3. 1X tampon de lavage pendant 1 heure x 5-6 changements.
    18. Laver avec un tampon de lavage 1X nuit.
    19. Rincer à l'1X detectiobuffer n pendant 10 min.
    20. Transfert des échantillons dans le tampon de détection à l'assiette bien.
    21. Retirer du tampon et de détecter avec BM Violet (Roche 11442074001) jusqu'à ce que la force du signal désiré est obtenu (avec les sondes plus longues, cela peut signifier la nuit). BM violet est la lumière couvre sensibles avec du papier ou une boîte.
      • Mix Violet BM avant l'utilisation.
      • Assurez-vous que les échantillons sont flottement libre et non bloqué aux puits.
      • Vérifier le signal après 1 heure.
    22. Rincer les échantillons avec le tampon de détection 1X en x puits 5 min.
    23. Image ou conserver les échantillons dans 4% des PFA à 4 ° C.

    * Les échantillons peuvent être imagées à ce stade et / ou après l'étape de l'immunohistochimie est ajouté (partie 3 ci-dessous).

    Solutions:

    • Nucléase sans eau: Mélanger 1 ml DEPC (Sigma) avec 1L d'eau ultrapure stérile. Autoclave.
    • PBS 1X: Mélangez 1 paquet de PBS (Sigma) dans 1L nucléase sans eau et stériliser par filtration.
    • Solution de lavage 1X: Mélanger 450 ml d'eau nucléase gratuite + 50 ml de solution de lavage 10X et stériliser par filtration.
    • Mélange d'hybridation: formamide à 50% en volume (25 ml), 50% en volume SSC 2X (25 ml), 6% de sulfate de dextrane en masse (3G).
    • 1X tampon de détection: Mélangez 50 ml de tampon de détection 10X avec 450 ml d'eau nucléase libre et stériliser par filtration.
    • Bloc tampon 1X: 5 ml de tampon 10X acide maléique (Roche tampon définie); 40 ml d'eau nucléase libres; 5 ml de tampon bloc 10X.
    • 2X SSC: Mélanger 50 ml 20X SSC avec 450 ml d'eau nucléase libre et stériliser par filtration.
    • Méthanol Graded: Diluer méthanol à 100% par la nucléase l'eau libre de 75%, 50%, et les concentrations de 25%.

    3. L'immunohistochimie

    Les étapes 1 et 2 peuvent être omis si la partie 2 a été achevée. Dans ce cas, assurez-vous que tous glycérol ou tout autre support de montage est lavé. Notez que tous les anticorps seront toujours en mesure de détecter leur épitope après la protéinase K digestion. Nous avons une courte liste des anticorps qui peuvent être utilisés en combinaison avec l'hybridation in situ dans les tissus des mammifères car ils conservent leur spécificité (voir tableau 2).

    1. Bains successifs d'éthanol à débarrasser les tissus des colorants lipophiles (s'il n'est pas terminé à l'effet de la partie 2):.. 5min 50% d'éthanol, 70% d'éthanol 5 min, de l'éthanol à 95-100% pendant la nuit ou au besoin jusqu'à l'effet désiré, l'éthanol à 70% 5 min., 5min 50% d'éthanol.
    2. Réhydrater par incrémentale en ajoutant du PBS en 5-10 minutes.
    3. Bloc de tissu pendant 1 heure dans 2,5% sérum normal de chèvre (NGS) et 0,5% de Triton X-100 @ RT sur agitateur.
      (1:1 END 5%: 1,0% TritonX-100 dans du PBS 1X)
    4. Incuber avec l'anticorps primaire (s) dilué dans une solution de bloc 48-72 heures à 4 ° C sur agitateur.
    5. Laver avec du PBS pendant 1 heure x 3 changements.
    6. Bloquer comme à l'étape 3.
    7. Incuber avec l'anticorps secondaire (s) dilué dans une solution de bloquer pendant 12-24h à 4 ° C sur agitateur (Alexa Fluor ® colorants d'Invitrogen ont été utilisés).
    8. Laver comme à l'étape 5. (Option:.. Contre tache avec Hoechst colorant nucléaire tant que premier lavage diluée 10mg / ml dans le PBS stock de 1:2000 Suivez avec 1 hr lavages en PBS x 2-3 changements @ RT sur agitateur)
    9. Imagerie: Les échantillons peuvent être visualisés à cette étape à la fois avec la transmission et la microscopie à épifluorescence, préférentiellement en utilisant un système d'imagerie confocale pour la résolution ajouté. Pour ce faire nous avons l'habitude oreilles monter l'ensemble dans de la glycérine en utilisant des lamelles d'entretoises pour éviter de trop la compression des tissus. En plus ou au lieu de cette imagerie toute monture, les spécimens peuvent être inclus dans une résine époxy et des coupes sériées ajouté des détails histologiques. Pour bénéficier de l'ensemble combiné mount / section d'analyse, d'éviter le blanchiment du signal fluorescent lors de l'étape d'imagerie confocale.

    Solutions

    • Solutions d'éthanol: Diluer 100% d'éthanol dans l'eau distillée à une concentration finale de 50% et 70%.
    • Solution de bloc: 01:01 NGS dilution de 5%: 1,0% TritonX-100 dans du PBS 1X (concentrations finales de travail: NGS 2,5%, 0,5% TritonX-100).
    • PBS 1X: Mélangez 1 paquet de PBS (Sigma) dans 1L d'eau distillée.
    • 5% de NGS: Décongeler 2,5 ml NGS et mélanger avec 47,5 ml de PBS 1x. Conserver à 4 ° C.
    • 1,0% TritonX-100: Mix 49,5 ml 1x PBS avec 0,5 mL TritonX-100 (laisser sur agitateur @ RT à mélanger pendant 1 heure). Conserver à 4 ° C.
    • Solution de Hoechst stock de tache: Dissoudre 10mg colorant Hoechst par millilitre de PBS 1x.
    Tableau 2. Les anticorps qui travaillent avec la protéinase K tissu digéré.
    Cat # Item Vendeur
    25-6790 Anti-myosine VIIA polyclonaux Proteus Biosciences
    25-6791 Anti-myosine-VI polyclonaux Proteus Biosciences
    9661 Clivée Caspase-3 polyclonaux Signalisation cellulaire
    T7451 Monoclon anti-tubuline acétyléeal Sigma
    PRB-238C Prox1 polyclonaux Covance

    4. Histologie

    Histologie peut être introduit après la partie 1 pour augmenter la résolution du colorant lipophile traçage dans épaisses montures entiers tels que le cerveau juvénile ou après la fin des parties 2 ou 3. Pour des coupes de cerveau de série, nous recommandons l'Compresstome VF-700 microtome (Precisionary Instruments Inc, Greenville, Caroline du Nord) pour obtenir une épaisseur uniforme de la section. Des sections congelées sont moins optimales en raison de fuites de colorant plus grande pendant le processus de coupe 3. Préparation des coupes sériées et de montage dans la glycérine 4 est la méthode préférée de préparation des tissus où se monte tout ou montages en surface ne permet pas une bonne visualisation des régions tissu d'intérêt. Les tissus peuvent ensuite également être incorporé dans une résine époxy et de réduire à 1-2 um d'épaisseur à l'aide de couteaux de verre ou de diamant pour TEM. Lorsque vous utilisez cette technique la plus immunofluorescence restera et qui est encore plus stable après inclusion plastique, cependant, tous lipophiles traçage sera entièrement perdu à ce stade car ils se dissolvent dans une résine époxy et de l'alcool. Prenez des précautions que des échantillons seront sensibles à la lumière jusqu'à ce qu'ils soient embarqués.

    Pour Compresstome VF-700 de sectionnement microtome, suivez les recommandations de Precisionary Instruments Inc

    Époxy Embedding / sectionnement:

    1. Fixation: 2,5% glutaraldéhyde / 1% de la PFA en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) 1h à une nuit.
    2. Dans un échantillon de tissu de verre déshydrater flacon: 30% d'éthanol (5 mn), 50% d'éthanol (5 mn), 70% d'éthanol (à 5 mn de la nuit), 95% d'éthanol (10min 5x chacun.), Et l'éthanol absolu (10min 5x . chacun).
    3. Transition solvants: 01:01 éthanol absolu: l'oxyde de propylène (PO) pendant 5 min.
    4. Solvants: PO 10min seulement 5x. chacun d'eux.
    5. Infiltration avec de la résine:
      1. 01:01 PO: la nuit de résine sur agitateur.
      2. Verser la solution d'échantillon (s) dans un moule plat et laissez intégration sur le comptoir 4-6 heures de s'évaporer PO. Sinon, retirez le bouchon du flacon et laisser sur vibreur pendant 4 heures (fonctionne bien avec plus de tissu).
      3. Transfert des échantillons à 100% de résine pendant 4 heures.
    6. Intégrer dans de la résine dans le moule finale avec l'étiquette. Polymériser par incubation à 60 ° C pendant 24-48 heures.
    7. Couper bloc avec une lame de rasoir au besoin de minimiser la résine étrangers. Couper 1-2 um coupes sériées sur un Ultramicrotome (E Ultracut Reichert-Jung a été utilisé). Mont et de l'image en utilisant la microscopie à épifluorescence.
      En option: Stain une partie des sections avec des taches histologiques (bleu-dire Stevenel a) si désiré (réalisation d'immunofluorescence ne sera pas soutenu dans ces sections).

    Solutions

    • Solutions d'éthanol: Diluer 100% d'éthanol dans l'eau distillée à 30%, 50%, 70% et 95% des concentrations.
    • Solution de fixation: Mélanger 2,5 mL glutaraldéhyde à 50%, 5 ml paraformaldéhyde 10%, et 42,5 ml 0,1 M tampon phosphate pH 7,4 (concentrations finales: glutaraldéhyde 2,5%, 4% PFA). Conserver à 4 ° C.
    • Résine Epoxy: Faire conformément aux instructions fournies avec Poly / Lit 812 Embedding Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc # 08792-1). Conserver à -20 ° C.

    5. Les résultats représentatifs

    Figure 2
    Figure 2. Lipophiles de placement de colorant et d'imagerie dans un embryon de souris. Trois colorants longueur d'onde différente lipophiles ont été injectés et incubé pour permettre la visualisation du nerf trijumeau (TN), nerf glossopharyngien (GN), et du nerf vague (VN) les projections centrales. A) Placement colorant lipophile dans les parties périphériques de trois nerfs crâniens pour permettre la diffusion au tronc cérébral pour la visualisation de leurs processus centraux. Le TN est étiqueté avec NeuroVue Rouge, GN: Maroon NeurVue, et VN: Jade NeuroVue. B) la même souris que dans (A) après incubation. Certains de diffusion peuvent être vus en microscopie fond clair. C) même souris que dans (A et B). Le cerveau postérieur a été disséquée et plat monté. Certains d'étiquetage des processus centraux des trois nerfs marqué peut être vus en microscopie fond clair. D) l'image confocale de (C). Avec l'utilisation des neurones spécifiques confocale peut être vu, et l'utilisation de trois colorants différents permet l'évaluation de la distribution de chaque population par rapport aux autres. Colorants ont été imagées séquentiellement. Jade NeuroVue a été imagée à une excitation de 488 nm et d'émission 500-550 nm. NeuroVue Rouge a été imagée à une excitation de 535 nm et une émission de 550 à 600 nm. Maroon NeuroVue a été imagée à une excitation de 643 nm et émission à 650-700 nm.

    Figure 3
    Figure 3. Aperçu schématique de l'expérimentation. L'oreille est exposée pour permettre la visualisation de toutes les structures. Colorant lipophile estensuite injecté et a permis de diffuser. Après la diffusion des populations distinctes de neurones peut être vu étiquetés par différents colorants. Ensuite, l'hybridation in situ (Sox2) est effectuée sur l'oreille et l'expression des ARNm des étiquettes. L'immunohistochimie est ensuite réalisée (Myo7, la tubuline) pour visualiser l'expression des protéines. Suivi par les coupes histologiques dans lequel les deux hybridation in situ et immunohistochimie peuvent être visualisées.

    Discussion

    Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour combiner quatre techniques en vue de maximiser la collecte des données et la cohésion en corrélant les données au sein d'un animal donné (figure 3). Cette approche permettra de réduire le montant de l'élevage et donc du temps nécessaire pour obtenir des données publiables, tout en améliorant l'information sur la co-localisation et des effets corrélatifs de mutants. Bien que les souris embryonnaires ont été utilisées dans cette vidéo, souris adultes ainsi que d'autres animaux comme le poulet, xénope, poisson zèbre et peuvent être analysés en utilisant ces techniques aussi bien. Lors de l'utilisation d'autres espèces protéinase K digestion peut être nécessaire de modifier. Ici, nous utilisons différents colorants fluorescents NeuroVue spécifiquement l'étiquette jusqu'à trois populations de neurones d'intérêt. L'avantage de ces colorants est qu'elles peuvent être utilisées dans des souris mutantes, qui peut être problématique lorsque s'appuyant uniquement sur ​​l'immunohistochimie qui peuvent ou peuvent ne pas être affectés par les mutations à analyser, et ils l'étiquette neurones rétrograde et anterogradely 5. Une étude récente a également augmenté le nombre de populations de neurones qui peuvent être étiquetés simultanément à six 2. Après, le colorant lipophile traçage du même tissu d'intérêt peuvent alors être analysés en utilisant l'hybridation in situ, pour l'analyse de la transcription du gène et peuvent être ensuite analysées par immunohistochimie pour la distribution des protéines. Cette dernière analyse peut être complétée par l'histologie détaillée qui peut ajouter à la caractérisation phénotypique 6. Cette analyse multifactorielle a le potentiel d'acquérir de nouvelles connaissances à travers l'analyse corrélative au sein du même animal qui pourrait autrement être improbable ou moins dans le besoin de protocoles plus vaste et la reproduction de la souris.

    Disclosures

    Souris tissus ont été recueillis en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université de l'Iowa Soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (ACURF 0804066).

    Acknowledgements

    Confocale images ont été obtenues à l'Université de l'Iowa Carver Centre d'Imagerie. Le financement a été fourni par une subvention SBIR (MH079805) à BF soutien supplémentaire pour la reproduction des souris pour ce projet a été fourni par NIDCD (5R01DC00559007) au BF

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    in situ Hybridization:
    PC DIG wash + block buffer set Roche Group 1585762
    Premix 20x SSC Buffer Roche Group 1666681
    Proteinase K 20mg/ml Ambion AM2546
    Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) Research Products International Corp. D43060
    Formamide Sigma-Aldrich F9037
    Dextran Sulfate Research Products International Corp. D20020
    BM Purple Roche Group 11442074001
    Anti-Dig-AP Fab fragments Roche Group 11093274910
    RNase A enzyme 10mg/ml Fermentas EN0531
    RNase Away Research Products International Corp. 7003
    Salmon Sperm DNA 10mg/ml Invitrogen 15632-011
    Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml EMD Millipore SCGVU05RE
    Filter Discs 0.2μm; 25mm Whatman, GE Healthcare 6780-2502
    Phosphate buffered saline PH 7.4 packets Sigma-Aldrich P-5368
    Immunohistochemistry:
    Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
    Triton X-100 Sigma-Aldrich T8532
    H–chst Dye Polysciences, Inc. 9460
    Histology:
    Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit Polysciences, Inc. 08792-1
    Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205
    Gluteraldehyde Solution 50% Fisher Scientific G151
    DPX Mountant Fluka 44581
    Rocker MidSci 55D1114
    Heat Block Fisher Scientific 11-715-125D
    Rotator Thermo Fisher Scientific, Inc. 400110Q
    Incubator set to 60° Fisher Scientific 11-690-625D
    Dye tracing:
    Microscissors Geuder G-19775
    Fine Forceps E.M.S 72680-F
    NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade MTTI FS-100(1,2,6)
    1X phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
    Dissecting scope Leica Microsystems M205 FA
    Incubator set to 36° Fisher Scientific 11-690-506DQ
    Confocal Microscope Leica Microsystems LSM 510
    Slides Surgipath 00240
    Coverslips Surgipath 00106
    RPI Glycerol G22025-0.5
    Paraformaldehyde (4% and 0.4%) Fisher Scientific T353-500

    References

    1. Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
    2. Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. (2010).
    3. Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
    4. Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
    5. Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
    6. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).

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