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 JoVE Neuroscience

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

1, 1, 2, 1

1Department of Biology, University of Iowa, 2Molecular Targeting Technologies, Inc.

Article
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    Summary

    Eine Kombination verschiedener Techniken, um die Datenerfassung von der Maus Gewebe zu maximieren wird vorgestellt.

    Date Published: 3/17/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2451

    Cite this Article

    Duncan, J., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology. J. Vis. Exp. (49), e2451, doi:10.3791/2451 (2011).

    Abstract

    Jenseits einzelnes Gen-Funktion, um tiefer Schnitt in Genregulationsnetzwerken erfordert mehrere Mutationen in einem einzigen Tier zusammen. Eine solche Analyse von zwei oder mehreren Genen muss mit in-situ-Hybridisierung von anderen Genen oder Immunhistochemie ihrer Proteine ​​ergänzt werden, sowohl im Ganzen montiert entwickeln Organe oder Abschnitte für detaillierte Auflösung der zellulären und Gewebe Ausdruck Veränderungen. Kombinieren mehrerer Genveränderungen erfordert den Einsatz von cre oder flipase bedingt löschen Genen und zur Vermeidung von embryonaler Letalität. Erforderliche Zuchtprogramme drastisch verbessern Aufwand und die Kosten proportional zu der Anzahl der Gene mutiert, mit einem Ergebnis von sehr wenigen Tieren, die mit dem vollen Repertoire an genetischen Veränderungen gewünscht. Amortizing die große Menge an Aufwand und Zeit, diese wenigen kostbaren Exemplare, die Durchführung mehrerer Mutationen zu erhalten erfordert Gewebe-Optimierung. Darüber hinaus untersucht ein einzelnes Tier mit mehreren Techniken macht es einfacher, Gendeletion Defekte mit Expressionsprofile zu korrelieren. Wir haben eine Technik, um eine gründlichere Analyse eines bestimmten Tieres zu erhalten entwickelt, mit der Fähigkeit, mehrere verschiedene histologisch erkennbare Strukturen sowie Gen-und Protein-Expression aller analysieren aus der gleichen Probe in beiden ganze montiert Organe und Abschnitte. Obwohl Mäuse verwendet worden sind, um die Wirksamkeit dieser Technik demonstrieren kann es zu einer Vielzahl von Tieren angewendet werden. Dazu kombinieren wir lipophilen Farbstoff Tracing, whole mount in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie, um die maximal mögliche Menge an Daten zu extrahieren.

    Protocol

    1. Lipophile Dye Injection

    Tissue Zubereitung:

    Alle Gewebe Dissektionen und Manipulationen sind in Tiere in 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) durch transcardial Perfusion mit Schlauchpumpen mit entsprechend dimensionierten Nadeln fixiert durchgeführt. Gewebe kann in 4% PFA in den Kühlschrank gelagert werden für bis zu 6 Monaten. Alle Vorbereitungen und Manipulationen sind in 0,4% oder höher PFA bis Montage mit Glycerin für die Bildgebung durchgeführt. Diese Menge an PFA effektiv eliminiert RNasen und schont die RNA in situ Hybridisierung.

    Dye Lagerung:

    Alle Farbstoffe sollten in einem dunklen geschlossenes Fach gelagert werden, um die Luftzirkulation und der Exposition gegenüber hellem Tageslicht zu minimieren, da sie lichtempfindliche sind. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen sollte ein separates Set von Instrumenten verwendet werden, um jeden Farbstoff zu behandeln.

    1. Zunächst muss eine Anwendung vor Ort für den Farbstoff ausgewählt und fremde Gewebe extrahiert, um visuell bestätigen den gewählten Standort und der Zugang für die Platzierung des Farbstoffes. Die Wahl der Anwendung vor Ort ist der wichtigste Schritt in diesem Prozess. Die Wahl eines guten Ort, um die neuronalen Population unter Berücksichtigung Label und nicht fremde Strukturen kann eine Herausforderung sein. Die Genauigkeit der Platzierung in einem bestimmten Trakt unter visueller Kontrolle in der Binokular erfordert ein gewisses Maß an Verständnis für die Neuroanatomie in Frage. Farbstoff kann entweder zentral oder peripher platziert werden, um peripheren oder zentralen Projektionen jeweils für ein bestimmtes Projekt (dh Gehirn, periphere Nerven, Ohr, Auge) benötigt Etikett. Lipophic Farbstoffe wird in allen Prozessen der Zugehörigkeit zu einer bestimmten Neuron diffuse, sowohl retrograd und anterograd, Besetzung einer bestimmten Neuron oder alle Neuronen projizieren in einer bestimmten Strecke.
    2. NeuroVue Farbstoff aus MTTI kommt vorinstalliert auf Filterpapier Streifen für eine einfache Anwendung. Dye können auch in 100% DMSO aufgelöst werden (Arbeit unter der Haube) und dünnes Haar kann in dieser Lösung getränkt und anschließend für kleinere Anwendungen getrocknet. Die vorinstallierte Filterpapier Farbstoff wird in geeigneter Größe dreieckige Stücke mit Mikroschere geschnitten. Die Größe des Farbstoffes hängt von der Größe der Probe, die Größe der Struktur abgestempelt zu werden, und die Anzahl der Farben, die gleichzeitig abhängen. Achten Sie darauf, wie klein ein Stück wie möglich geschnitten, um zu vermeiden Kennzeichnung anderen Strukturen. Nach der Verwendung microsissors zum Schneiden und Zangen für den Umgang mit dem Farbstoff agitieren die Instrumente in Alkohol zu jedem Farbstoff Rückstände zu entfernen, anschließend an der Luft trocknen oder tupfen Sie mit Papier. Dies ist zu vermeiden Kontamination der Probe mit Restfarbstoff auf Instrumenten, die unerwünschte Strukturen Etikett kann.
    3. Zum Einsetzen in weichem Gewebe wie Gehirn der Filter können direkt eingefügt werden mit einem Punkt des Filters Dreieck zu durchdringen das Gewebe. Für weitere starre Gewebe einen Einschnitt, um ein leichteres Einsetzen des Farbstoffs zu ermöglichen. Verwenden Sie keine Präpariernadel zu filtern in das Gewebe zu drücken. Dies kann dazu führen, ungenaue Platzierung und Störungen des Gewebes. Legen Sie alternative Wellenlängen NeuroVue Farbstoff als für die Kennzeichnung von zusätzlichen neuronaler Populationen nötig.
    4. Nach dem Einlegen der Farbstoff und die Überprüfung seiner Position, sind Proben in einem sicher verschlossenen Flasche mit 4% PFA gelegt und über Nacht bei 36 ° C im Dunkeln für 2-14 Tage je nach Alter und Diffusion zurückzulegende Strecke (ca. 2 mm pro werden Tag bei 36 ° C).
    5. Ein Binokular mit epiflouresence kann verwendet werden, um festzustellen, ob der Farbstoff an die gewünschte Stelle verbreitet hat, und die Probe kann wieder in den Brutschrank gestellt werden, wenn die Diffusion als unzureichend sein. Mit einem normalen Binokular ohne epifluorescene Diffusion erkennen wird unterschätzt die wahre Länge der Farbstoff diffundiert. Auch, wenn Farbstoffkonzentration hoch genug zu bewerten, optisch kann es zu Absorption Abschrecken bei der Verwendung von emittierten Fluoreszenz.
    6. Die gewünschte Gewebe von Interesse erfolgt und seziert ganze montiert auf einem Objektträger mit Glycerin und Deckglas für die Belichtung mit einem konfokalen Mikroskop. Konfokale Einstellungen sind wie in 1, 2 beschrieben. Wenn Gewebe Größe hemmt gesamte Montage auf einer Folie, ist die serielle Schnitte erforderlich (siehe unten). Weitere Details über die Vorbereitung des Gewebes für die Bildgebung und Farbstoff spektralen Eigenschaften sind verfügbar unter: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Schematische Übersicht des Experiments. Das Ohr ist ausgesetzt für die Visualisierung aller Strukturen zu ermöglichen. Lipophiler Farbstoff wird dann injiziert und man ließ sie diffus. Nach der Diffusion unterschiedliche neuronale Populationen zu sehen gekennzeichnet durch die unterschiedlichen Farbstoffe werden. Als nächstes werden in-situ-Hybridisierung (Sox2) ist auf dem Ohr und Etiketten-mRNA-Expression durchgeführt. Die Immunhistochemie ist dann durchgeführt(Myo7, Tubulin), um die Proteinexpression zu visualisieren. Gefolgt von histologischen Schnitten, in denen beide in situ Hybridisierung und Immunhistochemie visualisiert werden können.

    2. In-situ-Hybridisierung

    Falls Sie mit in-situ-Hybridisierung Start (nach dem Tracing mit lipophilen Farbstoffen wird es unmöglich sein) wollen, um Gewebe Vorbereitung verweisen in Teil 1. Jeder waschen, sofern nichts anderes angegeben, wird mit 2 mL der Lösung bei Raumtemperatur durchgeführt auf einem Wechselrichter / mixer. Achten Sie darauf, in eine saubere, RNase freie Umgebung zu arbeiten.

    1. Entwässern und dann rehydrieren Proben durch ein abgestuftes Methanol-Serie.
      1. 100% 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C (optional: Lagerung von Proben bei -20 ° C in 100% Methanol)
      2. 75% x 5 min. @ 4 ° C
      3. 50% x 5 min. @ 4 ° C
      4. 25% x 15 min. @ 4 ° C (oder bis Gewebes sinkt)
      5. Transfer-Proben auf ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen (RNase frei).
    2. Dreimal in PBS (1x PBS) und biegen Hybridisierungsofen auf für die zukünftige Verwendung (60 ° C).
      1. PBS x 5 min.
      2. PBS x 5 min.
      3. PBS x 5 min.
    3. Digest Gewebe mit 2 ul von 20 mg / mL Lager Proteinase K (Ambion Cat # AM2546) in 2,0 ml frischem PBS.
      Actual PK Verdauung Zeit hängt von dem Alter des Embryos. Das Folgende ist eine grobe Schätzung der Zeiten. Die Verdauung sollte engmaschig überwacht werden, wie Deproteinierung ist ein kritischer Schritt. Under-Verdauung wird in armen Sonde Penetration führen, während over-Verdauung in einem Verlust der strukturellen Integrität führen wird. Ein guter Indikator für die Verdauung ist ein Wechsel in das Gewebe von opak bis fast klar.
      Tabelle 1. Proteinase K-Verdau Zeit auf Maus Gewebe.
      AGE (embryonaler Tag) TIME (min)
      E8.5 6
      E9.5 10
      E10.5 13
      E11.5 15
      E12.5 17
      E14.5 18
      E16.5 + 20 +
    4. Stoppen Sie die Verdauung durch Inkubation Proben in 4% PFA für 5 min.
    5. Wash in PBS.
      1. PBS x 1 min.
      2. PBS x 5 min.
      3. PBS x 5 min.
      4. PBS x 5 min.
    6. Discard PBS mit besonderem Augenmerk auf so viel wie möglich zu beseitigen.
    7. Prehybridize Proben: Inkubation bei 60 ° C auf Wechselrichter in 1,8 ml Hybridisierungs-Mix für mindestens 1 Stunde. Set Isotemp Heizblock auf 85 ° C für eine spätere Verwendung.
      1. Als 1 Stunde nähert, denaturieren Lachssperma-DNA (Invitrogen Kat.-Nr. 15632-011) durch Inkubation bei 85 ° C für 10 min. Set auf Eis bis zum Gebrauch.
    8. Nach mindestens 1 Stunde Prähybridisierung, 200 ul denaturiert ssDNA und ca. 100 ng DIG-markierten Ribosonde zu jeder Probe. Hybridisieren bei 60 ° C in Hybridisierungsofen über Nacht.
    9. Ersetzen Hybridisierung vermischen sich mit 2 mL 2X SSC. Set Isotemp Wärme-Blöcke bis 37 ° C und 70 ° C für eine spätere Verwendung.
      1. Waschen mit 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C in Hybridisierungsofen.
      2. Waschen mit 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C in Hybridisierungsofen.
      3. Waschen mit 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C in Hybridisierungsofen.
      4. Waschen mit 2X SSC x 60 min. @ 70 ° C in Isotemp Heizblock.
      70 ° C entfernt alle endogene Aktivität der alkalischen Phosphatase. Dies ist vielleicht der wichtigste Schritt zur Verringerung der Hintergrund. Teil (d) kann in zwei 30 min gebrochen werden. wäscht, um Schäden an Gewebe zu minimieren.
    10. Waschen mit PBS x 5 min. Thaw RNase A-Enzym auf Eis für die zukünftige Verwendung.
    11. Ersetzen PBS und Geben Sie 1.0 ul RNase A Enzyme (Fermentas EN0531 10mg / ml) x 60 min. @ 37 ° C in Isotemp Heizblock (a 90 min. Inkubationszeit beträgt bevorzugt, wenn die Sonde hoch konzentriert ist).
    12. Discard PBS / RNase A und 4 x waschen.
      1. 1X Waschlösung x 10 min.
      2. 1X Waschlösung x 10 min.
      3. 1X Waschlösung x 10 min.
      4. 1X Waschlösung x 60 min. @ 70 ° C in Isotemp Heizblock.
    13. Inkubieren in 1X Blockpuffer für 1 Stunde.
      1. Zu diesem Zeitpunkt vorzubereiten 2,0 ml Block-Puffer und 1 ul (1:2000) Anti-Digoxigenin Antikörper pro Probe. Invert kurz und lassen Sie sich bei 4 ° C bis zur Verwendung.
    14. Nach 1 Stunde zu verwerfen Blockpuffer und fügen 2,0 ml pre-absorbiert Blockpuffer + Antikörper an Proben.
    15. Inkubieren über Nacht.
    16. Discard-Block-Lösung.
    17. Mit 1x Wash Buffer.
      1. 1X Waschpuffer x 5 min.
      2. 1X Waschpuffer x 5 min.
      3. 1X Waschpuffer für 1 Stunde x 5-6 Änderungen.
    18. Mit 1x Wash-Puffer über Nacht.
    19. Spülen Sie mit 1X detection-Puffer für 10 min.
    20. Transfer-Proben bei der Erkennung Puffer-Well-Platte.
    21. Entfernen Puffer und erkennen mit BM Purple (Roche 11442074001), bis die gewünschte Signalstärke erreicht ist (mit längeren Sonden kann dies bedeuten, über Nacht). BM purple ist lichtempfindlich Abdeckung mit Folie oder einer Box.
      • Mix BM Lila vor Gebrauch gut.
      • Stellen Sie sicher, dass die Proben frei schwebend und nicht in die Vertiefungen stecken.
      • Überprüfen Sie Signal nach 1 Stunde.
    22. Spülen Proben mit 1X Detektionspuffer in Brunnen x 5 min.
    23. Bild oder Lagerung von Proben in 4% PFA bei 4 ° C.

    * Die Proben können in diesem Stadium abgebildet werden und / oder nach der Immunhistochemie Schritt hinzugefügt wird (Teil 3).

    Solutions:

    • Nuclease freies Wasser: Mix 1 mL DEPC (Sigma) mit 1L sterile Reinstwasser. Autoclave.
    • 1X PBS: Mix 1 PBS-Paket (Sigma) in 1L Nuklease freiem Wasser und Filter zu sterilisieren.
    • 1X Waschlösung: Mix 450 ml Nuclease freies Wasser + 50 ml 10x Waschlösung und Filter zu sterilisieren.
    • Hybridisierung Mix: 50% Formamid Volumen (25 ml), 50% 2X SSC Volumen (25 ml), 6% Dextransulfat Masse (3g).
    • 1X Erkennung Puffer: 50 ml 10X Erkennung Puffer mit 450 ml Nuklease freiem Wasser und Filter zu sterilisieren.
    • 1X Blockpuffer: 5 ml 10x Maleinsäurepuffer (Roche-Puffer-Set); 40 mL Nuklease freiem Wasser, 5 ml 10x Blockpuffer.
    • 2X SSC: 50 ml 20x SSC mit 450 ml Nuklease freiem Wasser und Filter zu sterilisieren.
    • Graded Methanol: Verdünnen Sie 100% Methanol mit Nuklease freiem Wasser auf 75%, 50% und 25% Konzentration.

    3. Immunhistochemie

    Schritte 1 und 2 kann entfallen, wenn Teil 2 wurde abgeschlossen sein. In diesem Fall stellen Sie sicher, dass alle Glycerin oder andere Montage-Medium gewaschen ist. Beachten Sie, dass nicht alle Antikörper noch in der Lage, ihre Epitop nach Proteinase K-Verdau zu erkennen. Wir haben eine kurze Liste von Antikörpern, die in Kombination mit in-situ-Hybridisierung in Säugetier-Gewebe verwendet werden können, wie sie ihre Spezifität zu behalten (siehe Tabelle 2).

    1. Graded Ethanol-Serie auf das Gewebe der lipophilen Farbstoffen (wenn nicht wirksam in Teil 2 abgeschlossen) zu befreien:.. 50% Ethanol 5min, 70% Ethanol 5 min, 95-100% Ethanol über Nacht oder nach Bedarf, bis der gewünschte Effekt, 70% Ethanol 5 min., 50% Ethanol 5min.
    2. Rehydrieren durch stufenweise Zugabe von PBS in 5-10 Minuten.
    3. Block Gewebe für 1 Stunde in 2,5% normalem Ziegenserum (NGS) und 0,5% Triton X-100 @ RT auf Schüttler.
      (1:1 5% NGS: 1,0% TritonX-100 in 1x PBS)
    4. Inkubieren mit Primärantikörper (s) in Block-Lösung 48-72 Stunden bei 4 ° C am Schüttler verdünnt.
    5. Waschen mit PBS für 1h x 3 Änderungen.
    6. Block wie in Schritt 3.
    7. Inkubieren mit sekundärem Antikörper (s) in Block-Lösung für 12-24h verdünnt bei 4 ° C auf einem Schüttler (Alexa Fluor ® Farbstoffe von Invitrogen verwendet wurden).
    8. Wash wie in Schritt 5. (Option:.. Zähler mit Hoechst Kernfärbung Fleck als ersten Wäsche verdünnten 10mg / mL Lager 1:2000 in PBS mit 1 hr Folgen Waschen in PBS x 2-3 Änderungen @ RT auf Schüttler)
    9. Imaging: Die Proben können bei diesem Schritt mit den beiden Sende-und Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, vorzugsweise mit einem konfokalen Imaging-System für noch mehr Auflösung. Dazu müssen wir regelmäßig ganze Berg Ohren in Glycerin mit Deckgläsern als Abstandshalter, um über Kompression des Gewebes zu vermeiden. Zusätzlich oder anstatt dieser ganze Berg Bildgebung, können Proben in Epoxidharz eingebettet und seriell geschnitten für zusätzliche histologische Details. Um in den Genuss der kombinierten ganze mount / Abschnitt Analyse zu vermeiden Bleichen der Fluoreszenz-Signal in das konfokale Bildgebung Schritt.

    Lösungen

    • Ethanol-Lösungen: verdünnen 100% Ethanol in destilliertem Wasser, um Endkonzentrationen von 50% und 70%.
    • Block Lösung: 1:1-Verdünnung 5% NGS: 1,0% TritonX-100 in 1x PBS (final arbeiten Konzentrationen: 2,5% NGS, 0,5% TritonX-100).
    • 1X PBS: Mix 1 PBS-Paket (Sigma) in 1L destilliertes Wasser.
    • 5% NGS: Thaw 2,5 ml NGS und mischen sich mit 47,5 ml 1x PBS. Lagerung bei 4 ° C.
    • 1,0% TritonX-100: Mix 49,5 ml 1x PBS mit 0,5 mL TritonX-100 (verlassen auf Schüttler bei RT für 1 Stunde mix). Lagerung bei 4 ° C.
    • Hoechst-Färbung Lager-Lösung: 10 mg Hoechst Farbstoff pro Milliliter 1x PBS.
    Tabelle 2. Antikörper, die Arbeit mit Proteinase K verdaut Gewebe.
    Cat # Artikel Vender
    25-6790 Anti-Myosin-VIIa Polyklonale Proteus Biosciences
    25-6791 Anti-Myosin-VI Polyklonale Proteus Biosciences
    9661 Cleaved Caspase-3 Polyklonale Cell Signaling
    T7451 Anti-acetylierte Tubulin Monoclonal Sigma
    PRB-238C ProX1 polyklonalen Covance

    4. Histologie

    Histologie kann nach Teil 1 eingeführt werden, um die Auflösung des lipophilen Farbstoff Tracing in dicken ganzen mounts wie jugendliche Gehirne oder nach Abschluss der Teile 2 und 3 zu erhöhen. Für die serielle Hirnschnitten empfehlen wir die Compresstome VF-700 Mikrotom (Precisionary Instruments Inc., Greenville, North Carolina), um eine einheitliche Wanddicke zu erhalten. Gefrierschnitte sind weniger optimal aufgrund der größeren Austritt von Farbstoff während des Schneidens Prozess 3. Vorbereitung der Schnittserien und Montage in Glycerin 4 ist die bevorzugte Methode des Tissue Vorbereitung, wenn ganze Halterungen oder Oberfläche steigt nicht erlauben eine angemessene Visualisierung von Gewebe regions of interest. Tissue kann auch nachträglich in Epoxidharz eingebettet und geschnitten werden bei 1-2 mu m Dicke mit Glas-oder Diamantmesser für TEM. Bei Verwendung dieser Technik die meisten Immunfluoreszenz bleiben und ist noch stabiler, nachdem Kunststoff eingebettet, jedoch werden alle lipophilen Tracing völlig zu diesem Zeitpunkt verloren, als sie lösen sich in Alkohol und Epoxidharz. Nehmen Sie vorsorglich als Proben lichtempfindlich sein wird, bis sie eingebettet sind.

    Für Compresstome VF-700 Mikrotom Schnitte, folgen den Empfehlungen des Precisionary Instruments Inc.

    Epoxy Embedding / Schnitte:

    1. Fixation: 2,5% Glutaraldehyd / 1% PFA in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) 1 Stunde bis über Nacht.
    2. In einem Glas Probenfläschchen dehydrieren Gewebe: 30% Ethanol (5 Min.), 50% Ethanol (5 Min.), 70% Ethanol (5 Min. bis über Nacht), 95% Ethanol (5x 10min jeden.) Und absolutem Ethanol (5x 10min . pro Stück).
    3. Transitional Solvent: 1:1 absolutem Ethanol: Propylenoxid (PO) für 5 min.
    4. Lösungsmittel: PO nur 5x 10min. jeder.
    5. Infiltration mit Harz:
      1. 1.01 PO: Harz über Nacht auf Schüttler.
      2. Gießen Lösung mit Probe (n) in flache Einbettform und verlassen am Zähler 4-6 Std. nach PO verdampfen. Alternativ zu entfernen Kappe des Fläschchens und verlassen am Schüttler für 4 Stunden (funktioniert auch mit größeren Gewebe).
      3. Transfer-Proben zu 100% Harz für 4 Stunden.
    6. Embed in Harz in endgültige Form mit Label. Polymerisieren durch Inkubation bei 60 ° C für 24-48 Stunden.
    7. Cut-Block mit einer Rasierklinge wie notwendig, um überflüssige Harz zu minimieren. Oberteil 1-2 um Serienschnitte auf einem Ultramikrotom (ein Ultracut E Reichert-Jung verwendet wurde). Berg-und Bild mit Epifluoreszenzmikroskopie.
      Optional: Stain ein Teil der Abschnitte mit histologischen Färbungen (dh STEVENEL ist blau), falls gewünscht (klar Immunfluoreszenz nicht in diesen Abschnitten fortgesetzt werden).

    Lösungen

    • Ethanol-Lösungen: verdünnen 100% Ethanol in destilliertem Wasser auf 30%, 50%, 70% und 95% Konzentration.
    • Fixation Lösung: Mix 2,5 ml 50% Glutaraldehyd, 5 ml 10% Paraformaldehyd und 42,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 (Endkonzentration: 2,5% Glutaraldehyd und 4% PFA). Lagerung bei 4 ° C.
    • Epoxy Resin: Stellen Sie gemäß den Anweisungen mit Poly / Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc. # 08792-1) geliefert. Lagerung bei -20 ° C.

    5. Repräsentative Ergebnisse

    Abbildung 2
    Abbildung 2. Lipophiler Farbstoff Platzierung und Bildgebung in einem Maus-Embryo. Drei verschiedene Wellenlängen lipophile Farbstoffe wurden injiziert und inkubiert, um die Visualisierung des Trigeminus (TN), N. glossopharyngeus (GN) und Vagus (VN) zentralen Projektionen zu ermöglichen. A) lipophiler Farbstoff Ablagerung in den peripheren Abschnitten von drei Hirnnerven Diffusion an den Hirnstamm ermöglichen für die Visualisierung ihrer zentralen Prozesse. NeurVue Maroon und VN:: NeuroVue Jade Der TN ist mit NeuroVue Red, GN gekennzeichnet. B) Gleiche Maus wie in (A) nach der Inkubation. Einige Diffusion kann mit Hellfeld-Mikroskopie zu sehen. C) Same Maus wie in (A und B). Das Hinterhirn wurde seziert und flach montiert. Einige Kennzeichnung der zentralen Prozesse der drei Nerven beschriftet mit Hellfeldmikroskopie gesehen werden. D) Die konfokale Bild (C). Bei Verwendung des konfokalen spezifischen Neuronen zu sehen ist, und die Verwendung von drei verschiedenen Farbstoffen erlaubt die Beurteilung der Verteilung der jeweiligen Bevölkerung in Bezug auf die anderen. Farbstoffe wurden nacheinander abgebildet. NeuroVue Jade wurde bei einer Anregung von 488 nm und Emission 500-550 nm abgebildet. NeuroVue Red wurde bei einer Anregung von 535 nm und Emission 550-600 nm abgebildet. NeuroVue Maroon wurde bei einer Anregung von 643 nm und Emission bei 650-700 nm abgebildet.

    Abbildung 3
    Abbildung 3. Schematische Darstellung des Experiments. Das Ohr ist ausgesetzt für die Visualisierung aller Strukturen zu ermöglichen. Lipophile Farbstoffdann injiziert und man ließ sie diffus. Nach der Diffusion unterschiedliche neuronale Populationen zu sehen gekennzeichnet durch die unterschiedlichen Farbstoffe werden. Als nächstes werden in-situ-Hybridisierung (SOX2) ist auf dem Ohr und Etiketten-mRNA-Expression durchgeführt. Die Immunhistochemie ist dann (Myo7, Tubulin) durchgeführt, um die Proteinexpression zu visualisieren. Gefolgt von histologischen Schnitten, in denen beide in situ Hybridisierung und Immunhistochemie visualisiert werden können.

    Discussion

    In diesem Video zeigen wir eine Methode, um vier Techniken zu kombinieren, um die Datenerfassung und den Zusammenhalt durch die Korrelation von Daten innerhalb eines bestimmten Tieres (Abb. 3) zu maximieren. Dieser Ansatz verringert die Menge der Zucht und damit Zeit für die Veröffentlichung geeigneten Daten zu erhalten bei gleichzeitiger Verbesserung der Informationen über Co-Lokalisation und korrelative Wirkungen von Mutanten. Obwohl embryonalen Mäuse in diesem Video, erwachsenen Maus sowie andere Tiere wie Hühner, Xenopus und Zebrafisch eingesetzt wurden, können unter Verwendung dieser Techniken als gut. Bei Verwendung anderer Arten Proteinase K-Verdau kann verändert werden muss. Hier verwenden wir verschiedene fluoreszierende Farbstoffe NeuroVue gezielt Label bis zu drei neuronale Populationen von Interesse. Der Vorteil dieser Farbstoffe ist, dass sie in mutierten Mäusen, was problematisch sein kann, wenn sich ausschließlich auf die Immunhistochemie, die kann oder auch nicht durch die Mutationen analysiert werden betroffen sein können verwendet werden, und sie label Neuronen retrograd und anterograd 5. Eine aktuelle Studie hat auch die Anzahl der Neuronen Populationen, die gleichzeitig zu sechs 2 markiert werden können, erhöht. Danach können die lipophilen Farbstoff Verfolgung der gleichen Gewebe von Interesse dann mittels in-situ-Hybridisierung werden, für die Analyse der Gen-Transkription und können anschließend analysiert werden mittels Immunhistochemie für Protein-Verteilung. Letztere Analyse kann durch detaillierte Histologie, die zur Phänotypcharakterisierung 6 Fügen Sie können ergänzt werden. Diese multifaktoriellen Analyse hat das Potenzial, neue Erkenntnisse über korrelative Analyse gewinnen im gleichen Tier, die sonst möglicherweise unwahrscheinlich oder zumindest brauchen mehr umfangreiche Protokolle und Maus Zucht.

    Disclosures

    Maus Gewebe wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Iowa Institutional Animal Care und Verwenden Committee (ACURF 0804066) vereinnahmt.

    Acknowledgements

    Konfokale Bilder wurden an der University of Iowa Carver Center for Imaging erhalten. Die Finanzierung wurde von einem SBIR Zuschuss (MH079805) zu BF Zusätzliche Unterstützung für die Zucht der Mäuse für dieses Projekt wurde von NIDCD (5R01DC00559007) zu BF zur Verfügung gestellt

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    in situ Hybridization:
    PC DIG wash + block buffer set Roche Group 1585762
    Premix 20x SSC Buffer Roche Group 1666681
    Proteinase K 20mg/ml Ambion AM2546
    Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) Research Products International Corp. D43060
    Formamide Sigma-Aldrich F9037
    Dextran Sulfate Research Products International Corp. D20020
    BM Purple Roche Group 11442074001
    Anti-Dig-AP Fab fragments Roche Group 11093274910
    RNase A enzyme 10mg/ml Fermentas EN0531
    RNase Away Research Products International Corp. 7003
    Salmon Sperm DNA 10mg/ml Invitrogen 15632-011
    Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml EMD Millipore SCGVU05RE
    Filter Discs 0.2μm; 25mm Whatman, GE Healthcare 6780-2502
    Phosphate buffered saline PH 7.4 packets Sigma-Aldrich P-5368
    Immunohistochemistry:
    Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
    Triton X-100 Sigma-Aldrich T8532
    H–chst Dye Polysciences, Inc. 9460
    Histology:
    Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit Polysciences, Inc. 08792-1
    Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205
    Gluteraldehyde Solution 50% Fisher Scientific G151
    DPX Mountant Fluka 44581
    Rocker MidSci 55D1114
    Heat Block Fisher Scientific 11-715-125D
    Rotator Thermo Fisher Scientific, Inc. 400110Q
    Incubator set to 60° Fisher Scientific 11-690-625D
    Dye tracing:
    Microscissors Geuder G-19775
    Fine Forceps E.M.S 72680-F
    NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade MTTI FS-100(1,2,6)
    1X phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
    Dissecting scope Leica Microsystems M205 FA
    Incubator set to 36° Fisher Scientific 11-690-506DQ
    Confocal Microscope Leica Microsystems LSM 510
    Slides Surgipath 00240
    Coverslips Surgipath 00106
    RPI Glycerol G22025-0.5
    Paraformaldehyde (4% and 0.4%) Fisher Scientific T353-500

    References

    1. Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
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    3. Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
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