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 JoVE Neuroscience

Lipophilic डाई संयोजन, बगल में संकरण, immunohistochemistry, और प्रोटोकॉल

1, 1, 2, 1

1Department of Biology, University of Iowa, 2Molecular Targeting Technologies, Inc.

Article
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    Summary

    विभिन्न तकनीकों का एक संयोजन के लिए माउस ऊतक से डेटा संग्रह को अधिकतम प्रस्तुत किया है.

    Date Published: 3/17/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2451

    Cite this Article

    Duncan, J., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology. J. Vis. Exp. (49), e2451, doi:10.3791/2451 (2011).

    Abstract

    एकल जीन समारोह से परे जा रहे हैं जीन विनियामक नेटवर्क में गहरी कटौती एकाधिक एक ही पशुओं में संयुक्त म्यूटेशनों की आवश्यकता है. दो या अधिक जीनों के इस तरह के विश्लेषण के साथ अन्य जीन, या उनके प्रोटीन की immunohistochemistry स्वस्थानी संकरण में पूरित दोनों पूरे घुड़सवार विकासशील सेलुलर और ऊतक अभिव्यक्ति परिवर्तन की विस्तृत समाधान के लिए अंगों या वर्गों में, की जरूरत है. एकाधिक जीन परिवर्तन के संयोजन का उपयोग रचनात्मक या flipase सशर्त जीन को हटाने और भ्रूण मारक से बचने की आवश्यकता है. आवश्यक प्रजनन योजनाओं नाटकीय रूप से प्रयास बढ़ाने और उत्परिवर्तित जीन की संख्या में आनुपातिक आनुवंशिक वांछित संशोधनों के पूर्ण प्रदर्शनों की सूची के साथ बहुत कुछ जानवरों के एक परिणाम के साथ, लागत. प्रयास और समय की विशाल राशि के लिए इन कुछ अनमोल नमूनों कि कई म्यूटेशनों ले जा रहे हैं प्राप्त amortizing ऊतक अनुकूलन आवश्यक है. इसके अलावा, कई तकनीकों के साथ एक एकल जानवर की जांच के यह आसान अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ जीन विलोपन दोष सहसंबंधी बनाता है. हम एक भी जानवर की एक और अधिक गहन विश्लेषण प्राप्त करने के लिए एक तकनीक विकसित की है, कई अलग अलग histologically पहचानने संरचनाओं दोनों पूरे घुड़सवार अंगों और वर्गों में एक ही नमूना से जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सभी विश्लेषण करने की क्षमता के साथ. हालांकि चूहों के लिए इस तकनीक के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया गया है यह जानवरों की एक विस्तृत सरणी के लिए लागू किया जा सकता है. हम ऐसा करने के स्वस्थानी संकरण, immunohistochemistry, और ऊतक विज्ञान में lipophilic डाई अनुरेखण, पूरे माउंट गठबंधन करने के लिए डेटा की अधिकतम संभव राशि निकालने.

    Protocol

    1. Lipophilic डाई इंजेक्शन

    ऊतक तैयार:

    सभी ऊतक dissections और जोड़तोड़ transcardial उचित आकार सुइयों के साथ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर छिड़काव द्वारा 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय पशुओं में किया जाता है. ऊतक रेफ्रिजरेटर में 4% पीएफए ​​में संग्रहीत किया जा सकता है 6 महीने के लिए. इमेजिंग के लिए ग्लिसरॉल के साथ बढ़ते तक सभी तैयारियाँ और जोड़तोड़ 0.4% या उच्च पीएफए ​​में आयोजित की जाती हैं. पीएफए ​​की इस राशि को प्रभावी ढंग से RNases समाप्त और स्वस्थानी संकरण में शाही सेना को बरकरार रखता है.

    डाई संग्रहण:

    सभी रंगों को एक अंधेरे बंद डिब्बे में संग्रहीत किया जाना चाहिए हवा परिसंचरण और उज्ज्वल दिन के उजाले करने के लिए जोखिम को कम करने के लिए, के रूप में वे सहज हैं. पार संक्रमण से बचने के लिए, उपकरणों की एक अलग सेट प्रत्येक डाई को संभालने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

    1. सबसे पहले, डाई के लिए एक आवेदन साइट और चुना जाना चाहिए क्रम में नेत्रहीन चुना साइट, और डाई की नियुक्ति के लिए पहुँच की पुष्टि बाहरी ऊतक निकाले. आवेदन साइट का चयन इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. एक अच्छा साइट विचाराधीन neuronal जनसंख्या लेबल का चयन और असंगत नहीं संरचनाओं चुनौतीपूर्ण हो सकता है. विदारक दायरे में दृश्य नियंत्रण के अधीन किसी दिए गए पथ में नियुक्ति की सटीकता सवाल में neuroanatomy की समझ का एक निश्चित स्तर की आवश्यकता है. डाई या तो केन्द्र या peripherally रखा जा सकता है के लिए परिधीय या केंद्रीय अनुमानों क्रमशः के रूप में एक दिया परियोजना (यानी मस्तिष्क, परिधीय तंत्रिका, कान, आंख) के लिए आवश्यक लेबल. Lipophic रंजक दिया न्यूरॉन से संबंधित सभी प्रक्रियाओं में फैलाना, दोनों retrogradely और anterogradely दिया न्यूरॉन या सभी न्यूरॉन्स एक दिया ट्रैक में पेश भरने.
    2. MTTI से NeuroVue डाई आसान आवेदन के लिए फिल्टर स्ट्रिप्स पर पूर्व लोड आता है. डाई 100% DMSO में भी भंग किया जा सकता है (हुड के अंतर्गत काम) और पतली बालों के इस समाधान में भिगो जा सकता है है और बाद में छोटे अनुप्रयोगों के लिए सूख. preloaded फिल्टर कागज डाई microscissors के साथ उचित आकार त्रिकोणीय टुकड़ों में काट रहा है. डाई के आकार नमूना, लेबल किया जा रहा संरचना के आकार, और एक साथ इस्तेमाल किया जा रहा है रंगों की संख्या के आकार पर निर्भर करेगा. संभव के रूप में के रूप में एक टुकड़ा के छोटे कटौती करने के लिए अन्य संरचनाओं लेबलिंग से बचने के लिए सुनिश्चित करें. काटने और डाई शराब में उपकरणों आंदोलन डाई करने के लिए किसी भी अवशेषों को हटाने के लिए, तो सूखी हवा पूरी तरह से या कागज के साथ थपका से निपटने के लिए संदंश के लिए microsissors का उपयोग करने के बाद. यह अवशिष्ट डाई के साथ उपकरणों है कि अवांछित संरचनाओं लेबल हो सकता है पर नमूना contaminating से बचने है.
    3. सीधे मस्तिष्क जैसे कोमल ऊतकों में सम्मिलन के लिए फ़िल्टर पियर्स के ऊतकों को फ़िल्टर त्रिकोण के एक बिंदु का उपयोग कर सम्मिलित कर सकते हैं. के लिए और अधिक कठोर ऊतकों एक चीरा बनाने के लिए डाई के आसान सम्मिलन की अनुमति. विदारक सुई का उपयोग करने के लिए ऊतक में फिल्टर धक्का मत करो. यह गलत और ऊतक के स्थान व्यवधान पैदा कर सकता है. NeuroVue डाई के वैकल्पिक तरंगदैर्य के रूप में अतिरिक्त neuronal आबादी की लेबलिंग के लिए आवश्यक डालें.
    4. डाई डालने, और अपनी स्थिति की पुष्टि करने के बाद, नमूनों 4% पीएफए ​​के साथ एक सुरक्षित बंद शीशी में रखा जाता है और 36 में incubated ° सी 2-14 उम्र और प्रसार दूरी पर निर्भर करता है (लगभग 2 प्रति मिमी कवर किया दिनों के लिए अंधेरे में 36 पर दिन ° C).
    5. Epiflouresence के साथ एक विदारक गुंजाइश का आकलन करने के लिए अगर इच्छित स्थान पर डाई विसरित है, और नमूना इनक्यूबेटर में वापस रखा जा सकता है अगर प्रसार करने के लिए अपर्याप्त माना जाता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Epifluorescene बिना एक सामान्य विदारक गुंजाइश का उपयोग करने के लिए प्रसार का पता लगाने सच लंबाई डाई विसरित है बहुत मूल्यवान समझना होगा. इसके अलावा, अगर डाई एकाग्रता गधे को पर्याप्त उच्च है नेत्रहीन यह अवशोषण शमन कारण जब उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का उपयोग कर सकते हैं.
    6. ब्याज की वांछित ऊतक बाहर dissected है और ग्लिसरॉल के साथ एक स्लाइड पर पूरे घुड़सवार और एक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के लिए coverslipped. Confocal सेटिंग्स के रूप में 1, 2 में वर्णित हैं. यदि ऊतक आकार पूरे रोकता है एक स्लाइड पर बढ़ते, धारावाहिक सेक्शनिंग (नीचे देखें) की जरूरत है. इमेजिंग और डाई वर्णक्रमीय गुण के लिए ऊतक की तैयारी पर विवरण पर उपलब्ध हैं : http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf

    चित्रा 1
    चित्रा 1. प्रयोग के योजनाबद्ध कान सिंहावलोकन. सभी संरचनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए संपर्क में है. Lipophilic डाई और फिर इंजेक्शन फैलाना अनुमति दी है. प्रसार के बाद अलग neuronal आबादी देखा जा अलग रंगों द्वारा लेबल कर सकते हैं. अगले, स्वस्थानी संकरण में (Sox2) कान और लेबल mRNA अभिव्यक्ति पर किया जाता है. Immunohistochemistry तो बाहर किया जाता है(Myo7 ट्यूबिलिन) प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना. Histological वर्गों जिसमें दोनों स्वस्थानी संकरण और immunohistochemistry में visualized किया जा सकता द्वारा पीछा किया.

    2. स्वस्थानी संकरण में

    मामले में आप स्वस्थानी संकरण में (जिसके बाद lipophilic रंगों के साथ अनुरेखण असंभव हो जाएगा) के साथ शुरू करना चाहते हैं, भाग 1 में ऊतक तैयारी के लिए देखें. हर धोने, जब तक संकेत, समाधान के 2 एमएल के साथ किया जाता है एक पलटनेवाला / मिश्रक पर कमरे के तापमान पर. एक साफ, RNase मुक्त वातावरण में काम करने के लिए सुनिश्चित करें.

    1. निर्जलीकरण, और फिर एक वर्गीकृत मेथनॉल श्रृंखला के माध्यम से नमूने rehydrate.
      1. 100% 1 घंटे रातोंरात @ 4 ° C (वैकल्पिक: 100% मेथनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान नमूने)
      2. 75% x 5 मिनट. 4 @ डिग्री सेल्सियस
      3. 50% x 5 मिनट. 4 @ डिग्री सेल्सियस
      4. 25% x 15 मिनट. @ 4 ° C (या ऊतक डूब तक)
      5. एक 2 एमएल Eppendorf ट्यूब (RNase निःशुल्क) के लिए नमूने स्थानांतरण.
    2. पीबीएस (1x पीबीएस) में तीन बार धो लें और पर भविष्य के उपयोग (60 डिग्री सेल्सियस) के लिए संकरण ओवन बारी.
      1. पीबीएस x 5 मिनट.
      2. पीबीएस x 5 मिनट.
      3. पीबीएस x 5 मिनट.
    3. 20mg / एमएल 2.0 एमएल ताजा पीबीएस में शेयर proteinase कश्मीर (Ambion बिल्ली # AM2546) के 2 μL साथ डाइजेस्ट ऊतक.
      वास्तविक पीके पाचन समय भ्रूण की उम्र पर निर्भर करता है है. निम्नलिखित समय की एक मोटा अनुमान है. पाचन बारीकी से किया जा के रूप में deproteination एक महत्वपूर्ण कदम है निगरानी करनी चाहिए. पाचन के तहत गरीब जांच पैठ में परिणाम जबकि अधिक पाचन संरचनात्मक अखंडता का एक नुकसान में परिणाम होगा. पाचन की एक अच्छा संकेत अपारदर्शी से ऊतक में बदलने के लिए लगभग स्पष्ट है.
      तालिका 1. माउस ऊतक पर proteinase कश्मीर पाचन समय.
      उम्र (भ्रूण दिन) समय (मिनट)
      E8.5 6
      E9.5 10
      E10.5 13
      E11.5 15
      E12.5 17
      E14.5 18
      E16.5 + 20 +
    4. 5 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​में नमूने incubating द्वारा पाचन बंद करो.
    5. पीबीएस में धो डालें.
      1. पीबीएस x 1 मिनट.
      2. पीबीएस x 5 मिनट.
      3. पीबीएस x 5 मिनट.
      4. पीबीएस x 5 मिनट.
    6. पीबीएस त्यागें खत्म करने के रूप में संभव के रूप में में ज्यादा के लिए विशेष ध्यान दे.
    7. नमूने Prehybridize: 60 पर सेते ° सी पलटनेवाला पर कम से कम 1 घंटे के लिए 1.8 एमएल संकरण मिश्रण में. 85 ° भविष्य में उपयोग के लिए सी IsoTemp गर्मी ब्लॉक सेट.
      1. के रूप में एक घंटे nears, denature ऊष्मायन द्वारा सामन शुक्राणु (Invitrogen बिल्ली सं 15632-011) 85 ° डीएनए 10 मिनट के लिए सी. उपयोग करें जब तक बर्फ पर सेट करें.
    8. Prehybridization के कम से कम 1 घंटे के बाद, 200 μL विकृत ssDNA और डीआईजी लेबल riboprobe के लगभग प्रत्येक नमूने के 100ng जोड़ें. 60 डिग्री सेल्सियस संकरण ओवन में रात में संकरण.
    9. 2 एमएल 2X एसएससी के साथ संकरण मिश्रण बदलें. 37 के लिए IsoTemp गर्मी ब्लॉकों सेट डिग्री सेल्सियस 70 और डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए.
      1. 2X एसएससी x 10 मिनट के साथ धोएं. @ 60 ° C संकरण ओवन में.
      2. 2X एसएससी x 10 मिनट के साथ धोएं. @ 60 ° C संकरण ओवन में.
      3. 2X एसएससी x 10 मिनट के साथ धोएं. @ 60 ° C संकरण ओवन में.
      4. 2X एसएससी x 60 मिनट के साथ धोएं. 70 @ ° IsoTemp गर्मी ब्लॉक में सी.
      70 डिग्री सेल्सियस किसी भी अंतर्जात alkaline फॉस्फेट गतिविधि निकालता है. यह शायद पृष्ठभूमि को कम करने की दिशा में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. (घ) भाग दो 30 मिनट में तोड़ा जा सकता है. ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए washes.
    10. पीबीएस एक्स 5 मिनट के साथ धोएं. RNase भविष्य में उपयोग के लिए बर्फ पर एक एंजाइम पहले गला लें.
    11. पीबीएस बदलें और एक एनजाइम RNase के 1.0 μL (Fermentas EN0531 10mg / एमएल) x 60 मिनट जोड़ने. 37 @ ° IsoTemp गर्मी ब्लॉक (एक 90 मिनट की अवधि के ऊष्मायन. अगर जांच अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया है पसंद है) में सी.
    12. पीबीएस / एक RNase त्यागें और 4 बार धो लो.
      1. 1X धोने समाधान x 10 मिनट.
      2. 1X धोने समाधान x 10 मिनट.
      3. 1X धोने समाधान x 10 मिनट.
      4. 1X धोने समाधान x 60 मिनट. 70 @ ° IsoTemp गर्मी ब्लॉक में सी.
    13. 1X ब्लॉक बफर में 1 घंटे के लिए सेते हैं.
      1. इस समय, ब्लॉक बफर के 2.0 एमएल और 1 (1:2000) नमूना प्रति μL प्रतिरक्षी विरोधी Digoxigenin तैयार करते हैं. संक्षिप्त उलटें और 4 में बैठ ° उपयोग करें जब तक सी.
    14. 1 घंटे त्यागें ब्लॉक बफर के बाद और नमूने के 2.0 एमएल ब्लॉक पूर्व अवशोषित + बफर एंटीबॉडी जोड़ें.
    15. रातोंरात सेते हैं.
    16. ब्लॉक समाधान त्यागें.
    17. 1X धोने बफर के साथ धोएं.
      1. 1X धोने बफर x 5 मिनट.
      2. 1X धोने बफर x 5 मिनट.
      3. 1 घंटे x 5-6 परिवर्तन के लिए 1X धोने बफर.
    18. 1X धोने बफर के साथ रात भर धो लें.
    19. 1X detectio साथ कुल्ला10 मिनट के लिए n बफर.
    20. अच्छी तरह से थाली करने के लिए पता लगाने के बफर में नमूने स्थानांतरण.
    21. बफर निकालें और बी.एम. बैंगनी (11442074001 Roche) के साथ पता लगाने के लिए जब तक वांछित सिग्नल की शक्ति प्राप्त होता है (अब जांच के साथ इस रातोंरात मतलब हो सकता है है). बी.एम. बैंगनी प्रकाश के प्रति संवेदनशील कवर पन्नी या एक बॉक्स के साथ है.
      • बी.एम. बैंगनी का उपयोग करने से पहले अच्छी तरह मिक्स.
      • यकीन है कि नमूने मुक्त चल रहे हैं और कुओं के लिए अटक नहीं.
      • 1 घंटे के बाद संकेत की जाँच करें.
    22. कुओं एक्स 5 मिनट में 1X पता लगाने के बफर के साथ नमूने कुल्ला.
    23. 4 में 4% पीएफए ​​° सी. में छवि या दुकान नमूने

    * नमूने इस चरण में imaged किया जा सकता है और / या immunohistochemistry कदम के बाद (3 पार्ट नीचे) जोड़ा जाता है.

    समाधान:

    • Nuclease मुफ्त पानी: 1 एमएल DEPC (सिग्मा) 1L बाँझ ultrapure पानी के साथ मिक्स. आटोक्लेव.
    • 1X पीबीएस: मिक्स 1 1L nuclease मुफ्त पानी और फिल्टर में पीबीएस पैकेट (सिग्मा) बाँझ.
    • 1X धो समाधान: मिक्स 450 एमएल nuclease मुफ्त पानी + 50 एमएल 10x धोने समाधान और फिल्टर बाँझ.
    • संकरण मिक्स: मात्रा (25 एमएल) द्वारा 50% Formamide, मात्रा से 50% 2X एसएससी (25 एमएल), 6% जन द्वारा dextran सल्फेट (3 जी).
    • 1X जांच बफर: मिक्स 50 एमएल 10X पता लगाने बफर 450 एमएल nuclease मुफ्त पानी और फिल्टर के साथ बाँझ.
    • 1X ब्लॉक बफर: 5 एमएल 10X Maleic एसिड बफर (Roche बफर सेट), 40 एमएल nuclease मुफ्त पानी, 5 एमएल 10X ब्लॉक बफर.
    • 2X एसएससी: मिक्स 50 एमएल एसएससी 20X 450 एमएल nuclease मुफ्त पानी और फिल्टर के साथ बाँझ.
    • श्रेणीबद्ध मेथनॉल: nuclease 75% के लिए मुफ्त पानी, 50%, और 25% सांद्रता के साथ 100% मेथनॉल पतला.

    3. Immunohistochemistry

    चरण 1 और 2 अगर भाग 2 पूरा कर लिया गया छोड़े गए किया जा सकता है है. उस मामले में, सुनिश्चित करें कि सभी ग्लिसरॉल या अन्य माध्यम बढ़ते धोया है. नोट है कि नहीं सभी एंटीबॉडी अभी भी proteinase कश्मीर पाचन के बाद उनके मिलान का पता लगाने में सक्षम हो जाएगा. हम एंटीबॉडी कि स्तनधारी ऊतकों में स्वस्थानी संकरण में के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में वे अपनी विशिष्टता बनाए रखने (तालिका 2 देखें) की एक छोटी सूची है .

    1. इथेनॉल के लिए श्रेणीबद्ध lipophilic रंगों के ऊतकों (भाग 2 में अगर पूरा प्रभाव के लिए नहीं) छुटकारा श्रृंखला:. 50% इथेनॉल 5min, 70% इथेनॉल 5 मिनट, 95-100% इथेनॉल रातोंरात या के रूप में की जरूरत जब तक वांछित प्रभाव, 70% इथेनॉल 5 मिनट, 50% इथेनॉल 5min.
    2. संवर्द्धित 5-10 मिनट में पीबीएस जोड़कर rehydrate.
    3. 1 घंटे के लिए 2.5% सामान्य बकरी (NGS) सीरम और 0.5% ट्राइटन X-100 @ हिलनेवाला आरटी में ऊतक ब्लॉक.
      (01:01 5% NGS: 1.0% 1x पीबीएस में TritonX 100)
    4. ब्लॉक 48-72 बजे @ 4 ° सी हिलनेवाला पर समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (ओं) के साथ सेते हैं.
    5. 1hr एक्स 3 में परिवर्तन के लिए पीबीएस के साथ धोएं.
    6. चरण 3 के रूप में ब्लॉक.
    7. 12-24hrs के लिए ब्लॉक समाधान में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (ओं) के साथ सेते @ 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलनेवाला (Invitrogen से Alexa Fluor ® रंगों का इस्तेमाल किया गया).
    8. चरण 5 में के रूप में धो डालें. (विकल्प: Hoechst परमाणु साथ काउंटर दाग दाग के रूप में पहली धोने पतला 10mg / एमएल शेयर 1:2000 पीबीएस में 1 घंटे के साथ पालन करें. पीबीएस 2-3 परिवर्तन @ हिलनेवाला पर आरटी एक्स में washes)
    9. इमेजिंग: नमूने दोनों पारेषण और epifluorescent माइक्रोस्कोपी के साथ इस कदम पर imaged किया जा सकता है, preferentially जोड़ा समाधान के लिए एक confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर. ऐसा करने के लिए हम नियमित रूप से ग्लिसरॉल में पूरे माउंट कान spacers के रूप में coverslips का उपयोग ऊतकों के संपीड़न पर से बचने के लिए. इस पूरे माउंट इमेजिंग के बजाय या इसके अलावा में, नमूनों epoxy राल में एम्बेडेड हो सकता है और serially जोडी histological जानकारी के लिए sectioned. संयुक्त पूरे विश्लेषण / माउंट अनुभाग से लाभ करने के लिए, confocal इमेजिंग चरण में फ्लोरोसेंट संकेत विरंजन से बचें.

    समाधान

    • पतला 100% आसुत जल में 50% और 70% के अंतिम सांद्रता इथेनॉल इथेनॉल समाधान.
    • ब्लॉक समाधान: 01:01 कमजोर पड़ने 5% NGS: से 1.0% 1x पीबीएस (अंतिम काम कर रहे सांद्रता: 2.5% NGS, 0.5% TritonX-100) में TritonX-100.
    • 1X पीबीएस: मिक्स 1 1L आसुत पानी में पीबीएस पैकेट (सिग्मा).
    • : 5% NGS 2.5 एमएल NGS पिघलना और 47.5 एमएल 1x पीबीएस के साथ मिश्रण. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
    • 1.0% TritonX 100: मिक्स 49.5 एमएल 1x पीबीएस के साथ 0.5 एमएल TritonX-100 (हिलनेवाला @ आरटी पर छोड़ने के लिए 1 घंटे के लिए मिश्रण). 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
    • Hoechst दाग शेयर समाधान: 1x पीबीएस की मिली लीटर प्रति 10mg Hoechst डाई भंग.
    तालिका 2. एंटीबॉडी proteinase कश्मीर पचा ऊतक के साथ काम.
    बिल्ली # मद विक्रेता
    25-6790 विरोधी मायोसिन VIIA पॉलीक्लोनल बदलनेवाला प्राणी बायोसाइंसेज
    25-6791 एंटी - मायोसिन छठी पॉलीक्लोनल बदलनेवाला प्राणी बायोसाइंसेज
    9661 Cleaved कस्पासे-3 पॉलीक्लोनल सेल संकेतन
    T7451 विरोधी acetylated ट्यूबिलिन Monoclonअल सिग्मा
    PRB-238C Prox1 पॉलीक्लोनल Covance

    4. प्रोटोकॉल

    Lipophilic किशोर दिमाग जैसे या पार्ट्स 2 या 3 के पूरा होने के बाद मोटी पूरे mounts में अनुरेखण डाई के संकल्प को बढ़ाने के प्रोटोकॉल के भाग 1 के बाद शुरू किया जा सकता है है. धारावाहिक मस्तिष्क वर्गों के लिए हम Compresstome VF-700 सूक्ष्म तक्षणी (Precisionary उपकरण इंक, Greenville, उत्तरी केरोलिना) की सिफारिश के लिए एक समान अनुभाग मोटाई प्राप्त. जमे हुए वर्गों कम सेक्शनिंग 3 प्रक्रिया के दौरान अधिक से अधिक डाई रिसाव की वजह इष्टतम हैं. धारावाहिक वर्गों की तैयारी और ग्लिसरॉल में 4 बढ़ते ऊतक की तैयारी के पसंदीदा विधि है जब पूरे mounts या सतह mounts हित के ऊतकों के क्षेत्रों के लिए पर्याप्त दृश्य की अनुमति नहीं देते . ऊतक भी बाद में epoxy राल में एम्बेडेड कर सकते हैं और 1-2 सुक्ष्ममापी मंदिर के लिए गिलास या हीरे की चाकू का उपयोग कर मोटाई में कटौती. जब इस तकनीक का उपयोग सबसे immunofluorescence रहना और प्लास्टिक एम्बेडिंग के बाद भी अधिक स्थिर है, तथापि, सभी lipophilic अनुरेखण पूरी तरह से इस स्तर पर खो जाएगा के रूप में वे शराब और epoxy राल में भंग. लो एहतियात के रूप में नमूने प्रकाश के प्रति संवेदनशील हो सकता है जब तक वे एम्बेडेड रहे हैं.

    Compresstome VF 700 सूक्ष्म तक्षणी सेक्शनिंग के लिए, Precisionary उपकरण इंक की सिफारिशों का पालन करें

    Epoxy एम्बेडिंग / सेक्शनिंग:

    1. फिक्सेशन: 2.5% gluteraldehyde / 0.1M फॉस्फेट बफर में 1% पीएफए ​​(7.4 पीएच) रातोंरात 1hr.
    2. 30% इथेनॉल (5min.), 50% इथेनॉल (5min.), 70% इथेनॉल (रातोंरात 5min.), 95% इथेनॉल (5x 10min प्रत्येक.), और निरपेक्ष इथेनॉल (5x 10min: एक गिलास नमूना शीशी निर्जलीकरण ऊतक में प्रत्येक).
    3. संक्रमणकालीन सॉल्वेंट: 01:01 निरपेक्ष इथेनॉल: 5 मिनट के लिए propylene ऑक्साइड (पीओ).
    4. सॉल्वेंट: पीओ केवल 5x 10min. प्रत्येक.
    5. राल के साथ घुसपैठ:
      1. हिलनेवाला पर राल रातोंरात: 01:01 पीओ.
      2. फ्लैट एम्बेडिंग मोल्ड में नमूने के साथ समाधान (ओं) डालो और काउंटर 4-6 बजे पर छोड़ने के लिए पीओ लुप्त हो जाना. वैकल्पिक रूप से, शीशी की टोपी को हटा दें और 4 बजे (बड़ा ऊतक के साथ अच्छी तरह से काम करता है) के लिए एक प्रकार के बरतन पर छोड़ दें.
      3. 4 बजे के लिए 100% राल नमूने स्थानांतरण.
    6. लेबल के साथ अंतिम मोल्ड में राल में एम्बेड. 24-48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेंटीग्रेड पर incubating द्वारा polymerize.
    7. एक धार के साथ ब्लॉक कट के रूप में बाहरी राल कम से कम करने की जरूरत है. एक Ultramicrotome (एक Ultracut रीचर्ट - जंग ई इस्तेमाल किया गया था) पर 1-2 उम धारावाहिक वर्गों कट. पर्वत और epifluorescent माइक्रोस्कोपी छवि का उपयोग कर.
      वैकल्पिक: histological दाग के साथ वर्गों के एक हिस्से (यानी Stevenel है नीले) दाग अगर वांछित (एहसास immunofluorescence इन वर्गों में निरंतर नहीं हो जाएगा).

    समाधान

    • इथेनॉल समाधान: आसुत जल में 30%, 50%, 70%, और 95% सांद्रता के लिए 100% इथेनॉल पतला.
    • फिक्सेशन समाधान: मिक्स 2.5 एमएल 50% Gluteraldehyde, 5 एमएल 10% Paraformaldehyde, और 42.5 एमएल 0.1M फॉस्फेट बफर 7.4 पीएच (अंतिम सांद्रता: 2.5% gluteraldehyde, 4% पीएफए). 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
    • Epoxy राल: पाली बेड / 812 एम्बेडिंग Media/DMP-30 किट (Polysciences इंक, # 08792-1) के साथ आपूर्ति निर्देशों के अनुसार करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

    5. प्रतिनिधि परिणाम

    चित्रा 2
    चित्रा 2. Lipophilic प्लेसमेंट डाई और एक माउस भ्रूण में इमेजिंग तीन अलग तरंग दैर्ध्य lipophilic रंजक इंजेक्शन और trigeminal तंत्रिका (तमिलनाडु), glossopharyngeal तंत्रिका (GN), और vagus (वी.एन.) तंत्रिका केंद्रीय अनुमानों के दृश्य की अनुमति के लिए incubated रहे थे. ए) तीन कपाल नसों के परिधीय भाग में lipophilic डाई नियुक्ति प्रसार brainstem के लिए उनके केंद्रीय प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए. NeurVue लाल रंग, वी.एन. और: NeuroVue जेड तमिलनाडु NeuroVue लाल, जी.एन. के साथ लेबल है. बी) () एक ऊष्मायन के बाद के रूप में समान माउस. कुछ प्रसार brightfield माइक्रोस्कोपी के साथ देखा जा सकता है. सी) के रूप में समान माउस (एक और बी). hindbrain dissected किया गया है और फ्लैट घुड़सवार. तीन लेबल नसों की केंद्रीय प्रक्रियाओं के कुछ लेबलिंग brightfield माइक्रोस्कोपी के साथ देखा जा सकता है. डी) (सी) के Confocal छवि. Confocal विशिष्ट न्यूरॉन्स की उपयोग के साथ देखा जा सकता है, और दूसरों के संबंध में प्रत्येक आबादी के वितरण के मूल्यांकन के लिए तीन अलग अलग रंगों के उपयोग की अनुमति देता है है. रंगों sequentially imaged थे. NeuroVue जेड 488 एनएम और उत्सर्जन 500-550 एनएम के एक उत्तेजना पर imaged किया गया था. NeuroVue लाल 535 एनएम और उत्सर्जन के एक उत्तेजना 550-600 एनएम पर imaged किया गया था. NeuroVue लाल रंग 643 एनएम और 650-700 एनएम पर उत्सर्जन की एक उत्तेजना पर imaged किया गया था.

    चित्रा 3
    चित्रा 3 प्रयोग के योजनाबद्ध सिंहावलोकन. कान के लिए सभी संरचनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए संपर्क में है. Lipophilic डाईतो इंजेक्शन और फैलाना की अनुमति दी. प्रसार के बाद अलग neuronal आबादी देखा जा अलग रंगों द्वारा लेबल कर सकते हैं. अगले, स्वस्थानी संकरण में (Sox2) कान और लेबल mRNA अभिव्यक्ति पर किया जाता है. Immunohistochemistry तो बाहर किया जाता है (Myo7 ट्यूबिलिन) प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना. Histological वर्गों जिसमें दोनों स्वस्थानी संकरण और immunohistochemistry में visualized किया जा सकता द्वारा पीछा किया.

    Discussion

    इस वीडियो में, हम एक विधि के लिए चार तकनीक गठबंधन क्रम में किसी दिए गए जानवर के भीतर डेटा (3 आंकड़ा) correlating द्वारा डेटा संग्रह और सामंजस्य को अधिकतम प्रदर्शित करता है. इस दृष्टिकोण के प्रजनन की राशि को कम करने और इस तरह समय publishable डेटा प्राप्त की जरूरत है, जबकि सह स्थानीयकरण और म्यूटेंट के correlative प्रभाव के बारे में जानकारी में सुधार होगा. हालांकि भ्रूण चूहों इस वीडियो, वयस्क के रूप में अच्छी तरह के रूप में माउस चिकन, xenopus और zebrafish जैसे अन्य जानवरों में उपयोग किया गया है इन तकनीकों का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण किया जा सकता है. जब अन्य प्रजातियों का उपयोग कर proteinase कश्मीर पाचन को बदले जाने की जरूरत हो सकती है. यहाँ हम अलग fluorescing NeuroVue रंगों का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से ब्याज की तीन neuronal आबादी के लिए लेबल. इन रंगों के लाभ है कि वे उत्परिवर्ती चूहों, जो समस्याग्रस्त हो सकता है जब immunohistochemistry कि या विश्लेषण किया जा म्यूटेशनों द्वारा प्रभावित हो सकता है नहीं हो पर पूरी तरह भरोसा कर सकते हैं में इस्तेमाल किया जा सकता है, और वे न्यूरॉन्स retrogradely और anterogradely 5 लेबल. हाल ही में एक अध्ययन में यह भी न्यूरॉन आबादी है कि दो छह एक साथ लेबल कर सकते हैं की संख्या में वृद्धि हुई है . के बाद, lipophilic डाई अनुरेखण ब्याज की एक ही ऊतक तो स्वस्थानी संकरण में उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है, जीन प्रतिलेखन के विश्लेषण के लिए और बाद में प्रोटीन वितरण के लिए immunohistochemistry का उपयोग विश्लेषण कर सकते हैं. उत्तरार्द्ध विश्लेषण विस्तृत ऊतक विज्ञान है जो फेनोटाइप 6 लक्षण वर्णन करने के लिए जोड़ सकते हैं द्वारा पूरक किया जा सकता है है. इस correlative विश्लेषण के माध्यम से एक ही जानवर है कि अन्यथा असंभव या अधिक व्यापक प्रोटोकॉल और माउस प्रजनन की जरूरत कम से कम किया जा सकता है के भीतर नए अंतर्दृष्टि लाभ multifactorial विश्लेषण करने की क्षमता है.

    Disclosures

    माउस ऊतक के आयोवा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (0804066 ACURF) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में एकत्र किया गया था.

    Acknowledgements

    Confocal छवियों इमेजिंग के लिए आयोवा Carver केंद्र के विश्वविद्यालय में प्राप्त किया गया. अनुदान एक एसबीआईआर अनुदान (MH079805) द्वारा बीएफ इस परियोजना के लिए चूहों की प्रजनन के लिए अतिरिक्त सहायता के लिए प्रदान किया गया NIDCD (5R01DC00559007) द्वारा BF करने के लिए प्रदान किया गया

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    in situ Hybridization:
    PC DIG wash + block buffer set Roche Group 1585762
    Premix 20x SSC Buffer Roche Group 1666681
    Proteinase K 20mg/ml Ambion AM2546
    Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) Research Products International Corp. D43060
    Formamide Sigma-Aldrich F9037
    Dextran Sulfate Research Products International Corp. D20020
    BM Purple Roche Group 11442074001
    Anti-Dig-AP Fab fragments Roche Group 11093274910
    RNase A enzyme 10mg/ml Fermentas EN0531
    RNase Away Research Products International Corp. 7003
    Salmon Sperm DNA 10mg/ml Invitrogen 15632-011
    Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml EMD Millipore SCGVU05RE
    Filter Discs 0.2μm; 25mm Whatman, GE Healthcare 6780-2502
    Phosphate buffered saline PH 7.4 packets Sigma-Aldrich P-5368
    Immunohistochemistry:
    Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
    Triton X-100 Sigma-Aldrich T8532
    H–chst Dye Polysciences, Inc. 9460
    Histology:
    Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit Polysciences, Inc. 08792-1
    Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205
    Gluteraldehyde Solution 50% Fisher Scientific G151
    DPX Mountant Fluka 44581
    Rocker MidSci 55D1114
    Heat Block Fisher Scientific 11-715-125D
    Rotator Thermo Fisher Scientific, Inc. 400110Q
    Incubator set to 60° Fisher Scientific 11-690-625D
    Dye tracing:
    Microscissors Geuder G-19775
    Fine Forceps E.M.S 72680-F
    NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade MTTI FS-100(1,2,6)
    1X phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
    Dissecting scope Leica Microsystems M205 FA
    Incubator set to 36° Fisher Scientific 11-690-506DQ
    Confocal Microscope Leica Microsystems LSM 510
    Slides Surgipath 00240
    Coverslips Surgipath 00106
    RPI Glycerol G22025-0.5
    Paraformaldehyde (4% and 0.4%) Fisher Scientific T353-500

    References

    1. Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
    2. Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. (2010).
    3. Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
    4. Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
    5. Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
    6. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).

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