골격근에서 Mitochondrial 절연

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Summary

이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서 적응했다

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Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (49), e2452, doi:10.3791/2452 (2011).

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Abstract

Mitochondria 세포의 삶과 죽음을 제어 organelles 있습니다. 그들은 주요 신진 대사 반응에 참여, ATP의 대부분을 종합하고, 폭포 2,3 신호의 숫자를 조절. 과거 및 현재 연구는 간, 뇌 및 4,5 마음으로 쥐, 생쥐 조직에서 mitochondria 고립있다. 최근에는 많은 연구자들은 골격 근육에서 mitochondrial 기능을 공부에 집중했습니다.

여기서 우리는 골격 근육 6 mitochondria의 격리를 위해 성공적으로 사용한 방법을 설명합니다. 우리의 절차는 모든 버퍼와 시약은 신선했고 골격근의 250-500에 대한 MG 필요한 것을 요구합니다. 우리는 쥐, 마우스 gastrocnemius 및 격막으로부터 격리 mitochondria을 공부하고, 쥐 extraocular 근육. Mitochondrial 단백질 농도는 브래드 포드 분석과 측정됩니다. mitochondrial 샘플 준비 중 및 기능 연구가 비교적 짧은 시간 (~ 1 시간) 이내에 수행되어야 얼음처럼 차가운 유지하는 것이 중요합니다. Mitochondrial 호흡은 37 클라크 타입 전극 (Oxygraph 시스템) ° C 7 polarography를 사용하여 측정됩니다. 산소 전극의 교정이 프로토콜의 핵심 단계이며, 그것은 매일 수행되어야합니다. 절연 mitochondria는 (150 μg) 실험 버퍼 (EB)의 0.5 ML에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 글루 탐 산염 (5mM)와 malate (2.5 ㎜)를 추가로 시작합니다. 그런 다음, 아데노신 diphosphate (ADP) (150 μm의)는 주 3 시작에 추가됩니다. Oligomycin (1 μm의), ATPase의 synthase의 차단은 주 4 추정하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 카르보닐 청산 가리 P - [trifluoromethoxy]이 - 페닐 - hydrazone (FCCP, 0.2 μm의)가 5 measurestate 추가하거나, 호흡 6 uncoupled입니다. 호흡 조절 비율 (RCR), 주 4 주 3의 비율은 각 실험 후 계산됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.

요약, 우리는 생화학 (예를 들어, 효소 활동, 면역, proteomics) 및 기능 연구 (mitochondrial 호흡)에서 사용할 수있는 골격 근육에서 가능한 mitochondria의 분리를위한 방법을 제시한다.

Protocol

1. 버퍼의 준비

  1. 원심 분리기의 5804R 켜고 4로 설정 ° C. 37 ° C.에 Isotemp 3006D 물 욕조와 세트를 켭니다
  2. 근육 분리하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
    • PBS : 증류수 (5 정제 / 리터)의 인산 버퍼 호수 (PBS) 정제를 디졸브. 잘 섞는다.
    • PBS 추가로 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 100 ML 솔루션을 준비하려면, PBS의 98 ML 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML를 추가합니다.
    • 8X Mitochondria 버퍼 : 0.6의 최종 농도 M, 자유 지방산 400 MG에 대한 자당의 10.28 g 소 혈청 0.8 %의 최종 농도, 160 mm의 최종 농도에 대한 HEPES의 2.08 g, pH를위한 (BSA) 알부민 증류수로 50 ML에 7.4와 QS.
    • 절연 버퍼 1 (IB1가) : 10-10 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl 추가 증류수와 ML.
    • 절연 버퍼 2 (IB2가) 10-3 mm의 최종 농도, 0.392-215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 G, 8X mitochondria 버퍼, 산도의 1.25 ML 7.4 및 QS 500 MM의 EGTA 60 μl 추가 증류수와 ML.
    • 실험 버퍼 (EB)는 :의 최종 농도 5 mm의 최종 농도, 215 mm의 최종 농도를위한 D - mannitol의 0.392 g, 2.5 mm의 25 μl KH 2 PO 4 500 MM MgCl 2 100 μl 추가 6.25 μm의 20 μm의의 최종 농도 100 MM EGTA 2 μl, mitochondrial 버퍼, 산도 7.4과 QS 증류수 10 ML에의 1.25 ML.

2. 근육 절연

  1. 얼음 양동이에 세 10 ML의 비커, 포터 - Elvehjem 조직 그라인더와 얼음 악기 / 용품 기타 필요한 넣어. 모든 실험을하는 동안 얼음처럼 차가운 유지합니다.
  2. 완료 온수 욕조에 얼음 양동이와 EB에 IB1 및 IB2를 놓습니다.
  3. 세 10 ML 비커에 다음 솔루션은 추가한다 :
    • 비커 1 PBS 10 ML
    • 비커 2 : PBS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ML
    • 비커 3 : IB1 3 ML
  4. 편안하게 같은 지역 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인을 쥐를 죽여.
  5. 신속, 골격근의 250-500 밀리그램을 분리 비커 1 린스, 다음 비커 2 전송할 수 있습니다.

3. 균질 / Mitochondrial 절연

  1. 비커 3 근육을 전송하고 가늘게 가위로 근육을 말하다.
  2. 포터 - Elvehjem 균 질기에 대한 해결책을 전송합니다. 항상 얼음에 튜브를 유지 전동 유봉 (드릴 언론 작업을 다하겠습니다) 10 번 사용하여 근육을 균질.
  3. 4 10 분 700g ° C.에 사전 냉장 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 원심 분리기에 homogenate 전송
  4. 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관에 뜨는 전송합니다. 펠렛 폐기하십시오.
  5. 4 10 분 10,500그램에 뜨는 원심 분리기 ° C.
  6. 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관 및 레이블 SN1 (뜨는 숫자 1)와 근육의 유형에 뜨는 전송합니다.
  7. IB2 500 μl의 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
  8. 4 10 분 10,500그램에서 원심 분리기 ° C.
  9. 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관 및 레이블 SN2 (뜨는 번호 2) 근육의 종류에 뜨는 전송합니다.
  10. IB2 100 μl의 최종 mitochondrial 펠렛을 일시 중지합니다.
  11. 몇 초 동안 minifuge에 다시 스핀 최종 mitochondrial 현탁액. 펠렛있다면, 새로운 사전 차게 microcentrifuge 관에 뜨는를 전송하여 펠렛을 삭제.
  12. 브래드 포드 분석 8을 사용 단백질 농도를 결정합니다.

4. 전극 보정

참고 : mitochondrial 격리하는 동안 완벽한 전극 교정.

  1. 250 ML 플라스크에 증류수 100 ML을 추가합니다. 대기 가스와 물을 평형 20 분 동안 적극적으로 저어.
  2. Oxygraph 전극에 KCl 50 % 몇 방울을 추가합니다.
  3. 전극 위에 블루 Rizla 롤링 종이의 작은 조각을 넣으십시오.
  4. 롤링 종이 위에 PTFE 막 조각을 넣으십시오.
  5. 반지의 작은 주걱을 사용하여 내부 링을 적용한 다음 전극 홈에서 외륜을 놓으십시오.
  6. 전극을 연결하고 장비의 나머지 부분 조립 : 큰 플라스틱 링베이스, mitochondrial 회의소와 물 호스합니다.
  7. Oxygraph 박스의 전원을 켜고 Oxygraph 소프트웨어를 시작합니다.
  8. mitochondrial 챔버에 equilibrated 물을 추가합니다.
  9. 막대를 저어 60의 속도에 설정 추가합니다.
  10. 새로운 실험을 시작합니다.
  11. 교정을 클릭한 다음 상자 1 액상 보정. 37 온도를 변경하는 것은 ° C 및 "확인"을 두 번 누릅니다.
  12. "OK"를 "무시"변경을 클릭하고 질소 가스 탱크를 열 때.
  13. 연결된 플레이스 팁챔버에 질소 탱크와 제로 산소를 설정합니다. 그것이에서 스위치 때 "확인"을 클릭 "무시."
  14. 물을 기음과 mitochondrial 방으로 EB 버퍼 500 μl를 추가합니다.
  15. 플런저와 인감 챔버.
  16. 여러 개의 상자를 사용하여 반복 박스 2의 보정을위한 11-15 단계를하십시오.

5. Mitochondrial 호흡

  1. 새로운 실험을 시작, 그것이 신호를 안정화하기 위해 약 1 분간 실행하자.
  2. 150 각 챔버에 μg, 마크 이벤트 mitochondrial 정지 필요한 볼륨 (3.11 단계)을 추가하고 1 분 해보죠.
  3. 10 μl를 추가 따뜻한 250 mM/125 MM 5 mM/2.5 mm의 최종 농도에 대한 글루 탐 산염 / malate. 마크 1 분간 실행하자. 이 상태 2로 정의됩니다.
  4. 150 μm의, 마크의 최종 농도 10 MM의 ADP의 7.5 μl를 추가하고 30 초 동안 실행하자. 이것은 주 3으로 정의됩니다.
  5. 10 MM ADP, 마크의 또 다른 7.5 μl을 추가하고 1.5 분 동안 실행하자.
  6. 1 μm의, 마크의 최종 농도에 대한 차가운 10 MM의 oligomycin 0.5 μl를 추가하고, 3 분 해보죠. 이것은 주 4로 정의됩니다.
  7. 0.2 μm의, 마크의 최종 농도에 대한 추위 0.1 MM FCCP 1 μl를 추가하고, 3 분 해보죠. 이것은 주 5 말합니다.
  8. 완료되면 실험을 종료하고 저장합니다.
  9. Oxygraph 소프트웨어를 사용하여 호흡 속도를 취득.
  10. 정규화 계수를 입력하십시오 : mitochondrial 단백질 150 μg을 추가하는 경우 정규화 계수는 0.15 것입니다.
  11. 다른 호흡 상태에 대한 표준 호흡 속도를 계산합니다.
  12. 주 4로 주 3 나누어 호흡기 제어 비율 (RCR)를 계산합니다.

6. 대표 결과 :

그림 1
그림 1. mitochondria 골격근의 산소 소비의 추적 대표를 보여줍니다. 전극 신호가 안정화되면 mitochondria 샘플 Oxygraph 챔버에 추가됩니다. 상태 2 호흡은 조미료와 malate를 추가로 시작합니다. ADP의 또한 주 3 호흡을 정의, 산소 소비를 증가시킵니다. ATP synthase는 상태의 네 호흡을 얻기 위해 oligomycin의 추가에 의해 차단됩니다. 마지막으로, FCCP는 mitochondrial 호흡 (주 5) 떨어지다에 추가됩니다. 표 1 주에서 2, 3, 4 및 5에 대한 대표적인 산소 소비 속도를 보여줍니다. 호흡 조절 비율 (RCR)가 각 실험에 대해 계산됩니다. RCR은 ≥ 4 가능한 mitochondria 준비의 증거로 간주됩니다.

미국

정규 요금

상태 2

34.74

주 3

153.40

주 4

16.49

주 5

143.70

RCR

9.30

표 1. Mitochondrial 호흡 속도. mitochondria 골격근에서 Representativeoxygen 소비 속도. 값이 챔버에 추가 mitochondria의 크기로 정규화됩니다. 호흡 조절 비율 (RCR)는 주 4에 의해 상태가 3 나눔으로써 결정됩니다. RCR ≥ 4 가능한 mitochondria 준비를 나타냅니다.

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Discussion

우리는 골격 근육에서 가능한 mitochondria를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 수율에 문제가있는 경우, 프로토콜은 얼음에 30 분 PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 5 ML에서 분리된 근육을 잠복기로 수정할 수 있습니다. 트립신 완벽한 근육 소화를 확인하기 위해서는 근육이 완전히 다진해야합니다. 30 분 부화 후, PBS/10mM EDTA/0.01 %의 트립신 솔루션은 완전히 절연 버퍼 1 (IB1) 3 ML로 교체해야합니다. 또한, 트립신의 사용은 호흡 프로토콜 중 일부 mitochondrial 기판을 방해할 수 있습니다. 트립신을 사용하는 좋은 mitochondrial 준비에서이 프로토콜 결과에 사용된 모든 기판.

마우스 골격 근육 들어, 두 다리에서 gastrocnemius 근육을 결합하거나, 전체 다이어프램을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 쥐의 골격 근육 들어, gastrocnemius 또는 피임기구의 작은 부분 충분합니다. 과도한 근육 질량은 낮은 수율에 격리 과정 및 결과를 복잡하게하실 수 있습니다. 같은 extraocular 근육과 같은 아주 작은 근육의 고립을 위해, 그것은 필요한 근육 질량을 얻는 이상 한 동물에서 풀 근육이 필요합니다.

SN1과 SN2 :이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 supernatants를 말합니다. 이러한 supernatants은 차동 원심 분리의 결과가 아닌 mitochondrial 단백질이 포함되어 있습니다. 이러한 supernatants로부터 최종 mitochondrial 펠렛의 단백질은 mitochondrial 준비의 순도를 확인하기 위해 서양 blots에 사용할 수 있습니다. mitochondrial 및 세포질 항체를 사용하여 서양 blots은 최종 펠렛에 mitochondrial 준비의 순결을 확인합니다.

mitochondrial 호흡 장비를 청소하는 것은 성공적인 실험을위한 중요합니다. 각 실험 후, 실은 다음과 같이 철저하게 세척해야합니다 증류수와 챔버 다섯 번 린스, 결국, 약 5 분 동안 PBS / BSA의 포화 용액과 함께 린스, 에탄올 가용성 기판을 제거하는 70 % 에탄올로 한 번 헹굼 증류수와 챔버, 5 번 씻어. 클라크 형 전극 제대로 증류수로 여러 번 rinsing과 칫솔로 부드럽게 청소하여 모든 사용 후 세척해야합니다. 그렇다면, 그들은 완전히 대여 - 무료 잎사귀와 건조 및 건조기에 저장해야합니다. 일주일에 한 번 전극은 Oxygraph 연마 키트를 사용하여 연마해야합니다.

Mitochondrial 기판은 -20 O C.에서 주식 솔루션으로 준비 aliquoted 및 저장됩니다 우리는 기판을 다시 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리의 경험에서는, 기판의 대부분은 매 2 개월 있으므로 교체해야합니다 oligomycin를 제외하고, 몇 개월 -20 O C에서 안정하고 있습니다. 항상 자세한 내용은 제조 업체의 사양을 참조하십시오.

마지막으로,이 프로토콜은 또한 마음에서 mitochondria 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 근육에 관해서는, 동물의 크기 (대 쥐 마우스)은 장기 어떤 분율 것은 충분한 mitochondria를 얻을 필요가 결정됩니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 작품은 FH 안드레 이드하기 위해 국립 안과 연구소 (R01 EY12998)에서 부여에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95% CO2 / 5% O2 mix Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Blue Rizla Paper Hansatech 890101
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Centrifuge 5804R Eppendorf
Compressed nitrogen Local Gas Supplier
D-mannitol Sigma-Aldrich M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio-Rad 161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806
Glutamic acid Sigma-Aldrich G5889
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich H7006
Isotemp 3006D Fisher Scientific
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Male Sprague Dawley Rats Harlan Laboratories 300-500g
Malic acid Sigma-Aldrich M9138
Minifuge ISC Bioexpress C1301P
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxygen electrode disc Hansatech S1
Oxygraph Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software Hansatech
pH-meter Mettler Toledo 1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P8416
Potter-Elvehjem homogenizers Fisher Scientific 08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane Hansatech S4
SKIL 3320 drill press Hardware store
Sucrose Sigma-Aldrich S5016

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References

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Comments

1 Comment

  1. I'm sorry, I don't typically feel the need to interject, but I feel that the information in this protocol is lacking and at times inaccurate. While the buffers and general protocol are by and large correct, following the procedures shown in the video will yield low State 3 rates and the absence of a true "State 4," without the addition of oligomycin. While it is true that State 4 rates in the literature are generally reported in the presence of oligomycin, the absence of a progression to State 4 as described by Chance and Williams in 1955 indicates swollen, broken, leaky mitochondria and a poor preparation. Furthermore, State 5 here is described as after FCCP addition, which is in reality a modified State 3, sometimes called as "State 3U", or State 3 Uncoupled, as described in a letter by John Lemasters. State 5 is actually characterized by the absence of oxygen in the reaction chamber, and therefor a very low oxygen consumption rate.

    Reply
    Posted by: Dieter K.
    March 6, 2013 - 8:08 PM

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