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Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

Neuroscience

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Summary

이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.

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Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457, doi:10.3791/2457 (2011).

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Abstract

mammalians에서 줄기 세포는 동물의 수명 동안 여러 조직과 장기의 세포 창 및 갱신을 유지하기 위해 undifferentiated 세포의 소스 역할을합니다. 그들은 잠재적인 노화 과정에서 부상과 질병의 과정에서 길을 잃었 세포를 바꿀 수 있습니다. 신경 줄기 세포 (NSCs)의 존재가 처음 소설 혈청 무료 문화 시스템, neurosphere 분석 (NSA)를 사용하여 성인 포유류의 중추 신경계 (CNS)에 레이놀즈와 바이스 (1992)에 의해 설명되었다. 이 분석을 사용하여, 그것은 또한 배아 CNS의 다른 지역에서 NSCs을 분리하고 확장 가능합니다. 체외 확장의 NSCs에서 이들은 multipotent 있으며 CNS의 세 가지 주요 세포 유형 상승을 줄 수 있습니다. NSA가 수행하는 비교적 간단한데 동안 안정적이고 일관된 결과를 달성하기 위해 필요합니다 여기 증명 절차에주의. 이 비디오는 사실상 NSA가 14 마우스 뇌 조직을 생성하고 배아 날로부터 NSCs을 확장하는 방법을 보여줍니다 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 세부 사항을 제공합니다. 프로 시저는 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 NSC 매체에서 수확한 조직의 ganglionic eminences, 분리를 수확, 뇌 microdissection을 E14 마우스 배아를 수확하고, 마지막으로 NSA의 문화에 세포를 도금이 포함되어 있습니다. 문화 5-7일 후 결과 기본 neurospheres은 더 이후의 실험에 대한 NSCs의 수를 확장 passaged 있습니다.

Protocol

1. 기본은 절개로 진행하기 전에 설정 :

  1. 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다.
  2. 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다.
  3. 항생제의 높은 농도 (10 %)와 추위 HEPES 버퍼 최소 필수 매체 (앙)은 절개와 세탁 목적을 위해 준비가되어 있습니다. 또한, 항생제의 보완과 함께 NSC 기초 매체는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다.
  4. 항생제를 포함하는 감기 앙의 25-30 ML은 배아를 수집 무균 50 ML 튜브에 적절합니다.
  5. 여러 10cm 플라스틱 배양 접시는 절개시 태아와​​ 두뇌를 개최하는 데 필요한 또한 해부 조직을 개최합니다.
  6. 배아 (대형 가위, 작은 지적 가위, 큰 집게, 작은 곡선 포셉) 또는 배아 뇌 해부를위한 것이 (작은 포셉, 곡선 좋은 포셉, 45 ° 직각 좋은 포셉, 작은 가위)를 제거하기 위해 필요한 수술 도구는 사용 소독 아르 250 유리 구슬 살균기 ° C 또는 기타 가능한 압력솥 방법.
  7. 해부 현미경은 70 % 알코올로 닦아 및 층류 또는 PC2 후드 내부에 설정됩니다.

2. E14 마우스 두뇌와 마이크로 절개를 수확 :

  1. 임신 마우스를 성관계 시간이 하루에 하나의 기관 승인 동물 프로토콜에 따라 태동 14 anesthetized입니다.
  2. 자궁 경부 전위는 동물이 고통과 고통을 경험하게하지 않도록하기 위해 수행됩니다.
  3. anesthetized 마우스는 흡수성 티슈에 미치는 뒷면에 마련이고, 복부는 지역을 소독하기 위해 70 %의 에탄올로 씻어서 있습니다.
  4. 복부 이상의 피부는 큰 집게를 사용하여 파악하고, 다음 피부와 기본 근막은 복강과 자궁 뿔을 폭로 큰 가위로 절단됩니다.
  5. uteri 작은 집게와 가위로 제거되고 50 ML 원뿔 튜브 함유 추위 앙을로 전송됩니다.
  6. 자궁 조직이 후드로 전송 후 혈액과 머리카락과 같은 가능한 오염 물질을 제거하는 신선한 무균 추위 앙의 충분한 볼륨 한두 번 씻어서 있습니다.
  7. 자궁 조직은 다음 차가운 앙을 포함 10cm 페트리 접시로 전송됩니다.
  8. 자궁 뿔은 작은 곡선 집게와 가위를 사용하여 개설하고 배아는 추위 앙을 포함하는 새로운 10cm 요리로 전송됩니다.
  9. 태아의 머리가 자궁 경부 척수 수준에서 분리되어 추위 앙을 포함하는 다른 페트리 접시로 전송됩니다.
  10. 페트리 접시는 두개골에서 뇌를 제거하는 해부 현미경으로 전송됩니다.
  11. 머리는 머리의 등 부분의 면이 위쪽 직면만큼 꼬리 측면에서 멋진 곡선 포셉 개최하고 있습니다. 를 사용하여 마이크로 가위, 먼저 수평 상처가 눈 위에서 만든 다음 머리 뒤쪽으로 이마의 정중선에서 계속됩니다. 피부와 두개골을 통해 절감과 기본 뇌 손상하지 않도록하십시오.
  12. 두뇌는 곡선 집게를 사용하여 역방향 움직임에 절단 부분의 가장자리를 추진하여 두개골에서 제거됩니다. 모든 두뇌는 두개골에서 제거되기 전까지는이 절차는 계속됩니다.
  13. 두뇌는 지속 등의 측면이 상처가 후각 구근에서 ganglionic eminences을 폭로하는 북반구의 뒷면에 걸친 각 반구의 피질을 통해 수행되는 microscissors를 사용하는 이상하고 직면되도록 곡선 집게를 사용하여 개최됩니다.
  14. 한손에 곡선 포셉와 다른 45 ° 직각 집게를 사용하여 cortices의 컷 펄럭이 확산되고 ganglionic eminences 밖을 해부하고 있습니다.
  15. 해부 조직은 멸균 10cm 페트리 접시에 배치되며, 모든 머리가 마이크로 해부 때까지이 절차가 반복됩니다.
  16. 조직 조각은 1 ML 피펫 팁의 NSC 매체 1 ML을 사용하여 수집하고 15 ML의 원심 관으로 전송됩니다.
  17. 조직은 철저히 다음 dissociated이지만, 부드럽게 튜브의 바닥에 피펫 팁을 누르고 정지를 pipetting 아래로. 이 방법은 대단히 짧은 시간은 단일 세포로 헤어 졌 수 있습니다. Pipetting는 우유 같은 현탁액이 달성되도록 3-4 회를 실시합니다. 그런 다음, 정지가 아닌 dissociated 대단히 짧은 시간이 precipitates만큼 1~2분을 받아들여야 허용됩니다.
  18. 거의 모든 세포 현탁액은 다른 튜브로 전송됩니다 그리고 NSC 매체의 또 다른 한 ML은 설명된대로 남아있는 대단히 짧은 시간 및 단일 세포에 dissociated에 추가됩니다.
  19. 튜브의 내용은 700rpm (110g)에서, 실온에서 5 분 풀링 및 centrifuged 있습니다.
  20. 뜨는은 실제 펠렛 아래로 떨어져 진공 청소기로 청소를하고, 세포가 완전한 NSC 매체 1 ML에 resuspended 있습니다.
  21. 매체는 부드럽게하기 위해 아래 pipetted 있으며단일 단일 세포 현탁액 있습니다.
  22. 세포 현탁액의 10 μL는 셀 카운트를 수행하는 trypan 파랑 90 μL와 혼합됩니다.
  23. 마지막으로, 세포가 20ng / ML 표피 성장 인자 (EGF)와 보충 전체 NSC 매체에 2x10 5 셀 / ML의 밀도에 도금입니다. 5 ML 매체는 T175 flasks에 대한 T75 40 ML에 대한 T25, 20 ML에 사용됩니다.
  24. 37 ° humidified 인큐베이터에서 C 5 % CO 2에서 incubated 때 Neurospheres는 5~7일를 형성하고 있습니다. 6-7일에서 분야는 150-200 미크론 사이에 측정해야하며 subculture (통로)을 준비합니다.

3. Passaging 및 배아 NSCs의 확장 :

  1. neurospheres가 subculture (직경 150-200 μm의)에 대한 준비가되면, 중지 분야와 매체는 flasks에서 삭제 적절한 크기 무균 조직 배양 튜브에 배치하고,시 5 분 700 RPM (110g)에 centrifuged입니다 상온.
  2. 뜨는은 삭제되고 분야는 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 있습니다.
  3. 세포 현탁액은 다음 2-3 분 37 ° C의 물을 욕조에 incubated이며, 다음 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨 트립신의 활동을 중지하는 데 사용됩니다.
  4. 세포 현탁액은 부드럽게 트립신가 완전히 inactivated되었는지 확인하기 위해 아래 pipetted하고 있습니다.
  5. 세포 현탁액은 5 분 700 RPM (110g)에 centrifuged입니다. 그런 다음, 표면에 뜨는이 제거되고 세포 전체 NSC 매체 1 ML에 resuspended 있습니다.
  6. 세포 현탁액의 10 μL는 셀 카운트를 수행하는 trypan 파랑 90 μL와 혼합됩니다.
  7. 세포는 적절한 크기의 조직 문화 플라스크에 20ng / ML EGF와 보충 전체 NSC 매체에 5x10 4 셀 / ML의 농도에 도금입니다. 5 ML 매체는 T175 flasks에 대한 T75 40 ML에 대한 T25, 20 ML에 사용됩니다.
  8. 37 ° humidified 인큐베이터에서 C 5 % CO 2에서 incubated 때 보조 neurospheres는 5~7일를 형성하고 있습니다.

4. 대표 결과 :

기본 배아 NSC 문화에서, 세포의 대부분은 비대가 될 것이며, 도금시 조직 문화 요리에 첨부합니다. 세포의 대부분이 중 죽게하거나 2-3일 후 차별화되지만, proliferative 전지는 기판 (그림 1)에서 분리됩니다 세포의 작은 클러스터를합니다. 문화의 첫 48 시간에 큰 회전 타원체의 집계의 형성은 주요 분야에 대한 착각해서는 안됩니다. 집계 형성은 주로 파편과 문화의 비 dissociated 조직 대단히 짧은 시간의 양을에 따라 달라집니다. 진정한 neurospheres이 단계 밝고하고 크기 증가 (그림 2)와 같은 더 구형이된다. 작은 microspikes이 가능한 건강 분야 (그림 3)의 바깥쪽 표면에 나타납니다. 5~7일 후, 분야는 둥근 수 있지만 압축 안된다, 그리고 직경 150 사이 200 μm의 측정해야합니다. neurospheres가 (문화 9~10일 이후) 너무 커질 수있다면, 그들은 집계를 형성하거나 (비디오 참조) 분야의 중심에 있기 때문에 세포 죽음의 어두운 색상이 될 수도 있습니다. 대형 neurospheres 결국 (기판에 연결하여 주변위한 마이 그 레이션) 현장에서 차별 시작 있습니다. 그것은 또한 큰 neurospheres을 떼어 놓다하기 어려운 그들을 subculture.

그림 1
그림 1. 삼일 도금 후 기본 E14 NSC 문화. 화살표 NSCs의 proliferating 클러스터를 보여줍니다. 원본 확대, 20x

그림 2
그림 2. 칠일 도금 후 기본 E14 NSC 문화. 원본 확대, 10X

그림 3
그림 3. 도금 후 패시지 한 E14 neurospheres 오일합니다. 분야의 주변에있는 마이크로 스파이크를 (화살표) 참고. 원본 확대, 20x

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Discussion

neurosphere 분석 때문에 간단하고 재현성의 신경 줄기 세포 1-5의 격리 및 확장을 위해 선택의 방법입니다. 이 분석은 체외에서 생체내 연구에서 모두 사용할 수 undifferentiated CNS 전구체 세포의 대규모 발전을위한 소중한 도구입니다. 그것은 neurospheres는 타고난 신경 줄기 세포 및 기타 제한된 progenitors 모두에서 발생 될 수 있다고 강조해야합니다. 따라서 neurosphere 성형 주파수를 계산하는 것은 단순히 특정 신경 세포 인구 6 타고난 NSCs의 개수를 과대 평가. 타고난 NSCs의 빈도를 추정하기 위해, 그것은 강력하게이 목적 7에 대한 개발되었습니다 세포 분석을 형성 신경 콜로니 (N - CFCA)를 사용하는 것이 좋습니다.

E14 NSCs의 일관된 고품질 neurosphere 문화를 위해, 우리는 좋습니다

  1. 배아를 수확하기 시작하기 전에 필요한 항목을 준비합니다.
  2. 해부 내내 감기 앙 또는 기초 NSC 매체에서 배아를 유지합니다.
  3. (1 H 이내) 가능한 한 빨리 절개를 수행하려면, 조직이 부드럽고 시간이 지남에 끈적끈적한되고 해부하다하기 어려울 수 있으므로.
  4. 영역이 너무 많이 성장하도록하지 않습니다. 보통 그들은 분야의 크기에 따라 하위 교양 모든 5~7일해야합니다.
  5. 2~3분에 대한 150-200 μm의 크기에서 분야를 trypsinize합니다. 이상 3 분 트립신을 떠나하면 세포에 손상을 원인과 구체 형성 효율이 저하되고 세포가 문화 요리를 첨부하고 차별하는 경향이 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701
%0.05 trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
*MEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4034 HEM component
*Distilled water Reagent GIBCO, by Life Technologies 15230-147
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10
Fine scissors Surgical tools World Precision Instruments, Inc. 500216
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

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References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  3. Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
  4. Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
  5. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. (2010).
  6. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  7. Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).

Comments

1 Comment

  1. Pleas email me on azari.hassan@gmail.com if have any questions regarding this assay.

    Reply
    Posted by: Hassan A.
    May 13, 2011 - 6:55 PM

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