Meten Circadiaanse en acute Light Reacties in Muizen met behulp van Wiel Running Activity

Abstract

Circadiaanse ritmes zijn fysiologische functies die fietsen over een periode van ongeveer 24 uur (circadiane-circa: bij benadering en diem: dag) ^{1, 2.} Zij zijn verantwoordelijk voor de timing ons slaap / waak-cyclus en het hormoon secretie. Aangezien dit de timing is niet precies 24 uur, is het gesynchroniseerd met de zonne-dag door licht input. Dit wordt bereikt via fotische input van het netvlies naar de suprachiasmatische nucleus (SCN), die dient als de meester pacemaker synchroniseren van perifere klokken in andere delen van de hersenen en perifere weefsels om de milieu-licht donker cyclus ^3-7. De aanpassing van ritmes aan het milieuplan licht donker cyclus organiseert het bijzonder fysiologische gebeurtenissen op de juiste tijdelijke niche, wat cruciaal is om te overleven ^8. Bijvoorbeeld, muizen slapen overdag en zijn 's nachts actief. Dit vermogen om de activiteit te consolideren om de lichte of donkere gedeelte van de dag ofwel wordt aangeduid als circadiane photoentrainment en vereist het licht input voor de circadiane klok ^9. Activiteit van muizen in de nacht is robuust met name in de aanwezigheid van een loopwiel. Het meten van dit gedrag is een minimaal invasieve methode die kan worden gebruikt om de functionaliteit van het circadiaan systeem en lichte input voor dit systeem te evalueren. Methoden die hier zal bedekt worden gebruikt om de circadiane klok, licht invoer voor dit systeem, evenals de directe invloed van licht op wiel loopgedrag te onderzoeken.

Protocol

1. Apparatuur Setup

1. Voorbereiding van de diergroepen is erg belangrijk bij het opzetten van een gedrags-experiment. Voor wiel draait activiteit, alle muizen moeten worden man, dezelfde leeftijd, en indien mogelijk uit broer paringen. Idealiter jongere muizen, ongeveer 3 maanden oud, worden gebruikt voor wiel draaien activiteit.
2. Voorafgaand aan het plaatsen van een dier op wielen, de kamer moet volledig instellen. Dit geldt ook voor het bereiden van elke kooi met een wiel, een wiel omwenteling probe, een kleine hoeveelheid van de muis beddengoed in de bodem van elke kooi en voldoende voedsel en water voor 2 weken.
3. Verlichting is van groot belang, bij het opzetten van wiel draait kooien is het belangrijk om de lichtintensiteit te meten bij elke kooi om te controleren of u zelfs verlichting krijgt in elke kooi. Bovendien, bij het kiezen van een lichtbron, op zoek naar een met een breed spectrum met betrekking tot 450nm-650nm. Veel bedrijven bieden "daglicht" of "full spectrum" tl-lampen, die aan dit criterium te voldoen. (Zie figuur 1)

2. Experiment Setup

1. Bij de invoering van muizen aan het wiel draait kooi, doe dit dan in een lichte cyclus die nauw overeenkomt met de licht / donker cyclus ze voorheen waren ondergebracht onder.
2. Probeer gelijkmatig te verdelen muizen beter te waarborgen soortgelijke omgevingen voor alle groepen. Bijvoorbeeld, zich te onthouden van alle clustering van een groep muizen in een bepaald gebied zoals een enkele plank. Dit kan per ongeluk te introduceren een extra variabele.
3. Alvorens een licht cyclus storingen of het meten van de activiteit hebt, moet je muizen ongeveer een week om te wennen aan de nieuwe kooi, en het wiel. Alle muizen die niet op de wielen lopen na een week moet worden verwijderd uit de kooi en vervangen door een andere muis.
4. Zodra u een cohort van dieren stabiel op wielen, kunt u beginnen met het opzetten van licht / donker-cycli om verschillende hypothesen te toetsen. De verschillende licht cycli zijn in detail besproken in deel 3.

3. Experimentele Testen

1. Om assay photoentrainment, begin dan met woningen muizen in een 12 uur licht: 12 uur donker cyclus. Een voorbeeld hiervan zou lichten op van 7:00 am-7: middernacht, terwijl het licht uit blijven van 19u00-07u00. Daarnaast zal het verlagen van de lichtintensiteit voor de 12 uur licht gedeelte van de cyclus bloot eventuele verschillen in het licht gevoeligheid voor photoentrainment. Muizen moet worden gegeven twee weken photoentrain en voordat u lichtintensiteit. (Figuur 2)
2. Een bijkomend aspect van photoentrainment is de mogelijkheid om opnieuw aan te passen of opnieuw meevoeren circadiaanse ritmes een nieuw licht / donker-cyclus. Dit kan worden onderzocht door het bevorderen van de licht / donker cyclus die muizen zijn gehuisvest in zodanig dat de verlichting wordt ingeschakeld uit en eerder. Gewoonlijk, licht cycli zijn voorgeschoten door zes uur, bijvoorbeeld, in plaats van een lichte cyclus van 07u00-7: 00pm, zou het 01:00-1: 00pm. Dit kan ook worden onderzocht door het uitstellen van de licht-cyclus. Muizen zijn meestal in staat om opnieuw meevoeren in 5-7 dagen. (Figuur 3)
3. Deze paradigma's hebben echter niet volledig te kunnen beoordelen van de functionaliteit van de endogene circadiane klok. Woningen muizen in een constante donkere omstandigheden gebruikt kan worden om de endogene circadiane periode ook wel bekend als de free running periode te meten. In nachtdieren zoals wild-type muizen, de endogene periode is minder dan 24 uur betekent dat ze beginnen te lopen op het wiel een iets eerder elke dag. (Figuur 2) De exacte tijd van deze periode varieert enigszins tussen de verschillende muizenstammen. Bijvoorbeeld, de free running periode van C57 muizen is ongeveer 23,3 uur, terwijl in BALB / CJ muizen is het 22,5 uur ^10.
4. Na het bepalen van de free running periode constant donker licht input voor het circadiaan systeem kan worden onderzocht door middel van faseverschuiving. Faseverschuiving is het vermogen van een acute lichtpuls aan de circadiane klok te verschuiven. Faseverschuiving kan worden bereikt door het toedienen van een korte lichtpuls (15 minuten; 1000lux) tijdens de actieve fase van muizen gehuisvest in constante duisternis en het meten van de begin van activiteit op de dag na deze lichtpuls. (Figuur 4) Eerdere studies hebben geproduceerd respons curves (genoemd fase respons curves) dat de hoeveelheid en de richting van de verschuiving op basis van wat de tijd het licht wordt gegeven ^{11, 12} te beschrijven. Bijvoorbeeld, een 15 minuten, 1000 lux lichtpuls gegeven 4 uur na het begin van de activiteit (CT16) zal leiden tot een twee uur vertraging in de activiteit, terwijl hetzelfde licht puls gegeven 8 uur na de start van de activiteit (CT20) zal leiden naar een twee uur vooruit. (Figuur 4)
5. Voor het testen van het directe effect van licht op wiel draait activiteit, kan een lichtpuls worden toegediend aan muizen tijdens de donkere / actieve fase. De aanwezigheid van het licht in deze tijd zal remmen wiel-running activiteit. Terwijl de lengte van dit licht puls kan variëren, hebben we ontdekt dat een 3-uur puls vanaf 2 uur na het begin van de donkere fase is het meest informatief. (Figuur 5) In sommige gevallen kan het handig zijn om activiteiten te consolideren voorafgaand aan deze test kunt u eenvoudig doen door het veranderen van dit licht de fiets naar een 16 uur licht: 8 uur donker cyclus een week vóór de toediening van de lichtpuls.
6. Deze remming van het wiel draait activiteiten die rechtstreeks door het licht kan worden onderzocht in alle fasen van de circadiane cyclus met behulp van een ultradiane (T7) licht cyclus ^13. Deze cyclus bestaat uit 3,5 uur licht: 3,5 uur donker voor de duur van 1 week ^13. Muizen zijn niet in staat om photoentrain waardoor het licht pulsen om op alle punten daling van het circadiane cyclus in de loop van deze 1-week behandeling. (Figuur 6)
7. Net als bij een constante donkere omstandigheden, zal huisvesting muizen in constant licht onthullen een karakteristieke gratis looptijd. Toch zal deze periode langer zijn dan de periode in constante duisternis. De lengte van de free running periode in constant licht is positief gecorreleerd met de lichtintensiteit ^14, als de hoeveelheid licht toeneemt, is de free running periode lengte. (Figuur 7) Echter, muizen zelden zien periodes van meer dan 26 uur. In plaats daarvan, onder fel licht, zal hun activiteit worden aritmische. Om deze reden, het is licht-intensiteit is een belangrijke overweging als u van plan periode lengte te vergelijken voortdurend in het licht.
8. Bij de beslissing welke om deze lichte verstoringen uit te voeren, bedenk dan dat voorafgaande licht cycli kunnen circadiaanse ritmes beïnvloeden. Om deze reden, is het het beste om te beginnen met de meest milde behandelingen en geleidelijk over te gaan tot ernstiger licht behandelingen. Bijvoorbeeld, photoentrainment assays, constant donker en faseverschuivingen zijn allemaal erg mild en lijken niet te leiden tot langdurige gevolgen. Aan de andere kant, de T7 cyclus en constant licht zijn zeer hard licht behandelingen en kan leiden tot aritmie en moet worden gereserveerd voor het einde van het experiment.

4. Het analyseren van de gegevens

1. Wheel-lopende activiteit is verzameld en het aantal omwentelingen van het wiel die binnen een gegeven binned periode. Dit bin of sampling interval is vaak 10 minuten. Gegevens kunnen worden weergegeven in een Excel-spreadsheet met het aantal omwentelingen van het wiel in elke bak. Dit kan nuttig zijn voor het kwantificeren en vergelijken van wiel revoluties. De gegevens kunnen ook worden weergegeven als een actogram waarbij de hoeveelheid activiteit in elke bak wordt vertegenwoordigd door de hoogte van een zwarte balk als een histogram. (Figuur 2)
2. Activiteit ontstaan ​​is gedefinieerd als de start van de activiteit overheersen wedstrijd. De precieze parameters kan variëren tussen elk individu, maar over het algemeen, zoeken we naar de eerste aanval van de activiteit die langer duurt dan 30 minuten.
3. Voor het analyseren van het vermogen van muizen aan photoentrain, zijn er verschillende maatregelen die kunnen worden bekeken. Een veelgebruikte methode gebruikt om een ​​muis te photoentrained overwegen is de waarneming van een stabiele relatie tussen de intreden van de werking van de muis en de offset van het licht, evenals een groot percentage van de activiteiten van de muis wordt beperkt tot de donkere fase.
4. Het begin van activiteit levert de meeste informatie bij het kijken naar re-entrainment op een voorschot van de licht / donker-cyclus, terwijl de offset activiteit is het meest informatieve bij de behandeling van re-entrainment tot vertragingen in de licht / donker-cyclus. Muizen nemen meestal 5-7 dagen volledig opnieuw meevoeren hun wiel draait activiteit aan een 6-uur van tevoren of vertraging van de licht / donker-cyclus. Te overwegen een muis re-meegesleurd, met name in reactie op een voorschot, dient u zich aan een stabiele relatie tussen het begin van de activiteit en de offset van het licht. Deze relatie moet gelijk zijn aan wat eerder vastgesteld dat zij het licht cyclus van tevoren en moet nog minstens drie dagen. (Figuur 3)
5. Voor het berekenen van periode in zowel constant donker en constant licht, het aanzetten van de activiteit behoeft te worden vastgesteld voor 2 weken en voorzien van een regressielijn. Zoals eerder vermeld, in wild type muizen, wordt de periode in constante donker minder dan 24 uur, terwijl de periode van constant licht zal groter zijn dan 24 uur. (Figuur 2 en 7)
6. Bij de berekening van de verschuiving na een lichtpuls, te beginnen door het aanbrengen van regressielijnen tot activiteit aanzetten voor ten minste 5 dagen vóór en 5 dagen na de lichtpuls. Bereken het verschil tussen deze twee regressie lijnen naar de omvang van de faseverschuiving te bepalen. (Figuur 4)

5. Representatieve resultaten

Wanneer we kijken naar wiel draait records, kunt u verwachten enkele uren continu draaien zien in elke muis. Omdat muizen zijn nachtdieren, zal deze draait, of actieve fase, correleren met de donkere periode in de aanwezigheid van een licht / donker-cyclus. Muizen free running in constante omstandigheden zal ook deze beperkte periode van aanhoudende activiteit die de actieve fase van hun vrije-running ritme. In een constante duisternis, zal dit minder dan 24 uur en in constant licht,meer dan 24 uur. Toediening van een 15-minuten 1000lux lichtpuls 4 uur na het begin van de activiteit (CT16) zal resulteren in vertraagde activiteit aanvang op de dag na deze lichtpuls.

Figuur 1: Vertegenwoordiger lichtspectrum A.. Het lichtspectrum dat door de zon is breed en relatief onpartijdige tussen 400nm en 700nm, dat is het visuele gedeelte van het lichtspectrum. B. Het spectrum van een gloeilamp pieken in het infrarode bereik, wat leidt tot de rode vooringenomenheid, met een lage intensiteit in het blauwe bereik. C. De typische fluorescerende lamp, bestaat uit discrete pieken van licht, die zal verschijnen "wit" voor het oog. D. Echter, daglicht TL-lampen hebben een hogere breed spectrum en discrete frequentie pieken. Het resultaat is een lichtbron die niet zo heet als een gloeilamp, maar heeft een breder spectrum dan een gemiddelde tl-lamp.

Figuur 2: Circadiaanse photoentrainment. De actogram is een grafiek van de activiteit van een enkele muis, waar opeenvolgende dagen worden uitgezet op de y-as, en de tijd is uitgezet op de x-as. De zwarte balken geven het aantal van het wiel omwentelingen, en de achtergrond is de schaduw om een ​​indicatie van de licht / donker cyclus te geven. Op dag 1-8, is de muis gehuisvest in een 12:12 licht: donker cyclus. Gedurende deze tijd, de muis begint te lopen bij de offset van verlichting en consolideert haar activiteiten naar de donkere fase. Tijdens de lichte fase, de activiteit is minimaal. Op dag 9, zijn de lichten uitgeschakeld, verlaten van de muis in constante duisternis. Zonder licht fietsen, is er geen input voor de circadiane klok, wat resulteert in de klok draait op de endogene tijd. Zoals u kunt zien, activiteit begint vroeger elke dag een indicatie dat de endogene klok van dit dier is minder dan 24 uur.

Figuur 3: Re-entrainment. Re-entrainment paradigma's te betrekken het verschuiven van de licht cyclus ofwel vooruit of achteruit te dwingen de circadiane klok aan te passen aan het nieuwe licht cyclus. In dit voorbeeld wordt de cyclus geavanceerde zes uur op dag 9 en vervolgens vertraagd 6 uur op dag 20. In beide gevallen zijn meerdere dagen nodig voor een volledige re-meesleuren, maar afhankelijk van de richting van de beweging het effect is meer uitgesproken in zowel het ontstaan ​​of te compenseren tijd.

Figuur 4: circadiane ritmes verschuiving in reactie op korte pulsen van licht. A. Dieren gehuisvest in constante duisternis free-run met een periode korter dan 24 uur. Op dag 8, is een 15-minuten-1000 lux licht puls gegeven 4 uur na het begin van de activiteit (CT16). Op de volgende dag, is een verschuiving van de activiteit aanvangstijd waargenomen. De fase verschuiving is het verschil in voorspelde het dier aanvangstijd (bepaald op basis van hun activiteit voorafgaand aan de lichtpuls) en de tijd dat ze daadwerkelijk beginnen te lopen op de dag volgend op de lichtpuls.
B. De fase response curve voor muizen toont de hoeveelheid en de richting van de verschuiving die zal plaatsvinden naar aanleiding van een korte lichtpuls op specifieke circadiane tijden. Een lichtpuls tijdens de subjectieve dag (CT0-12) kan niet leiden tot een aanzienlijke verschuiving, aangeduid als de dode zone. Van CT12-19, kan een fase vertraging opgewekt te worden met de piek vertraging optreedt in reactie op een lichtpuls op CT16. Tussen CT 19 en 24, zal de activiteit ritme vooruitgang in reactie op een lichtpuls met de piek van tevoren voorkomen in antwoord op een lichtpuls op CT20.

Figuur 5: Wheel-lopende activiteit wordt geremd of gemaskeerd als reactie op een lichtpuls in de nacht. In dit voorbeeld, het licht cyclus is 16 uur licht: 8h donker en consolideert activiteit. Een 3-uur lichtpuls begint 2 uur na de lichten uit te gaan op dag 4. Gedurende deze tijd, is er weinig tot geen wiel-running activiteit vertonen het vermogen van het licht direct remmen activiteit. Activiteit hervat na de lichtpuls.

Figuur 6: T7 licht cyclus wordt gebruikt om muizen bloot te stellen aan lichtpulsen in de circadiane cyclus. De T7 cyclus bestaat uit 3,5 uur van het licht, gevolgd door 3,5 uur van donker. In deze cyclus zal muizen handhaven van een circadiaan ritme, maar ze zullen maskeren van het wiel draait activiteit ook weer te geven tijdens de lichtpulsen. Het bedrag van de activiteit in het licht kan worden vergeleken met de hoeveelheid activiteit in het donker voor een maatregel van maskering, die niet wordt beïnvloed door de circadiane tijd.

Figuur 7: Periode verlenging in constant licht

Discussion

Circadiaanse ritmes zijn gemeten en vastgelegd in verschillende organismen in de geschiedenis. Hoewel we hebben specifiek beschreven methode voor het opnemen van activiteiten ritmes bij muizen, kan deze techniek eenvoudig worden aangepast om ritmes te meten in andere knaagdieren zoals hamsters en ratten, die vaak worden gebruikt in de circadiane studies. Toch zal de freerunning periode en de tijd om opnieuw meevoeren in andere organismen variëren. Bijvoorbeeld, de freerunning periode van een hamster in constante duisternis is 24,0 uur, terwijl bij muizen is het minder dan 24 uur. In de omstandigheid, dat je werkt in een organisme, dat niet geschikt is voor wiel draaien activiteit, kunnen veel van hetzelfde licht paradigma's worden gebruikt, echter een verschillende fysiologische ritme moet worden gekeken. De meest vergelijkbare maatregel is de algemene activiteit. Bij mensen, apen en honden, onderzoekers vaak gebruik actigrafie, die de hoeveelheid van beweging van de afzonderlijke maatregelen. Bij de mens zijn lichaamstemperatuur en melatonine secretie ook vaak gemeten en hebben beide is aangetoond dat een circadiaan ritme, die in staat is faseverschuiving en in staat moeten opnieuw meevoeren ^{15, 16.}

Terwijl wij denken van deze fysiologische ritmes als discrete gebeurtenissen, zijn ze vrij met elkaar verbonden. De activiteit ritme van een dier kan nauwkeurig worden bedekt met een lichaamstemperatuur ritme en is het omgekeerde van een slaapritme. Bovendien is de secretie van melatonine, dat vaak wordt gebruikt als een marker van circadiane fase lijkt sterk op de normale slaap ritme bij de mens. Omdat deze cycli zijn zo met elkaar verweven, kan de studie van een te informeren en te voorspellen resultaten van anderen. Zo werden NPAS2 mutante muizen, die continu wiel draait activiteit al uit het donkere gedeelte van een licht-donker cyclus toonde aan, later onderzocht op gebreken slapen ^17. Deze muizen werden gevonden om te slapen minder algemeen, met de daling die zich tijdens de donkere fase, de normale "Nap tijd".

Wiel draait activiteit zorgt voor een relatief niet-invasieve manier om de circadiane ritmes te onderzoeken. De paradigma's hierboven beschreven kan worden gebruikt om een ​​gedetailleerde analyse van circadiane gedrag af te ronden. Daarnaast kunnen paradigma's zoals photoentrainment en huisvesting in constante duisternis worden gebruikt als een eerste onderzoek van de circadiane fenotypes voorafgaand aan de meer geconcentreerde onderzoek, zoals slaap-analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics