测量小鼠使用车轮运行活动的昼夜和急性对光反应

Abstract

昼夜节律的生理功能，周期多期（约24小时昼夜大约：近似的日均：天^）1，2。他们是负责定时睡眠/唤醒周期和激素分泌。由于这个时机不正是24小时，它是太阳日同步光输入。这是通过光的输入从视网膜视交叉上核（SCN）在脑和周围组织的环境光线暗周期^3-7其他地区同步外设时钟作为主起搏器。这种环境的光线暗周期的节奏对齐举办特殊的生理活动，以正确的时间生态位，这是生存^的关键8。例如，老鼠白天睡觉，都在夜间活动。这种能力，巩固活动，无论是一天的浅色或深色的部分被称为昼夜photoentrainment和要求光输入^生物钟 9 。小鼠在夜间活动，是强大的，尤其是在一个跑轮。测量这种行为是一种微创的方法，可用于评估的昼夜系统的功能以及光输入到这个系统。将这里介绍的方法用于研究生物钟，光输入到这个系统，以及光轮的运行行为的直接影响。

Protocol

1。设备安装

1. 设立任何行为实验时，动物群体的制备是非常重要的的。车轮运行的活动，所有的小鼠需要为男性，年龄匹配的，并且如果可能的话从兄弟姐妹交配。理想的情况是年轻的老鼠，大约3个月大，用于车轮运行的活动。
2. 将车轮上的任何动物之前，房间需要完全安装。这包括准备1轮，1轮革命探头，在每个笼和充足的食物和水2周的底部少量的鼠标床上用品每笼。
3. 房间里的灯是非常重要的，设立车轮运行笼时，重要的是要测量每个笼的光照强度，以验证您是否在每个笼子里，甚至照明。此外，在选择光源时，寻找一个具有广泛覆盖在450nm - 650nm的光谱。许多公司提供的“天灯”或“全谱”荧光灯泡，这符合此标准。 （见图1）

2。实验设置

1. 当小鼠轮运行笼，这样做在光周期，密切与他们先前设下的光/暗周期。
2. 尽量均匀地分布，以更好地确保所有群体的类似环境的小鼠。例如，不要从群集的一组小鼠在一个特定区域，如一个单一的货架。这可能无意中引入一个额外的变量。
3. 在任何光线的周期扰动或测量活动，你应该给小鼠约一个星期的时间适应环境的新笼，和车轮。应删除任何不车轮上运行一个星期后的小鼠从笼中，并与其他鼠标所取代。
4. 一旦你有一个稳定运行的车轮上的动物群，你可以开始设置光/暗周期，来测试不同的假设。第3部分中详细讨论了各种光周期。

3。实验分析

1. photoentrainment分析，启动住房小鼠在12 h光照：12 ​​h黑暗周期。这方面的例子将灯从上午7:00 - 7：00PM而灯光从7:00至下午7:00时仍然关闭。此外，降低光照强度为12小时的周期部分将公开photoentrainment任何光线的敏感度的差异。应给予两个星期小鼠photoentrain之前改变光的强度。 （图2）
2. 额外的photoentrainment方面的能力，重新调整或重新乘火车到一个新的光/暗周期的昼夜节律。这可以检查推进，小鼠是安置在灯打开和关闭较早的光/暗周期。一般情况下，先进的光周期由6个小时;例如，而不是一个光周期7:00 AM - 7：00PM，这将是凌晨1:00 - 1：00。这也可以拖延光周期研究。老鼠通常能在5-7天重新夹带。 （图3）
3. 然而，这些模式没有充分评估的内源性生物钟的功能。在不断的黑暗条件下的房屋小鼠可以用来衡量又称自由运行期间的内源性昼夜期间。在夜行动物，如野生型小鼠，内源性期间不少于24小时，这意味着他们开始略有上运行的车轮每一天早些时候。 （图2）这一时期的确切时间会略有不同小鼠品系。例如，C57小鼠自由运行期间约23.3小时，而在BALB / CJ小鼠为22.5小时。
4. 确定后在不断的黑暗条件下的光输入的自由运行期间的昼夜系统，可以进行检查，通过相移。相移转移生物钟的一种急性光脉冲的能力。相移，可以通过管理一个短的光脉冲（15分钟; 1000lux）在活跃期的小鼠在不断的黑暗安置和测量这个脉冲光之后的日子里开始的活动。 （图4）以往的研究产生的响应曲线（称为相位响应曲线），描述的数量和移位方向的基础上什么时候的光线^是11，12 。例如，一个15分钟的，1000勒克司的光脉冲（CT16）活动开始后4个小时，将导致在活动2小时的延迟，而在相同的光脉冲，活动开​​始后（CT20）8小时将导致提前2小时。 （图4）
5. 要测试的光轮运行活动的直接影响，可管理的光脉冲对小鼠在黑暗/活跃期。在这个时候光的存在会抑制车轮运行的活动。虽然这种光脉冲的长度可以不同，我们发现，开始2个小时的黑暗阶段开始后的3小时的脉冲是最翔实。 （图5）在某些情况下，它可以是有用的这个测试之前，以巩固活动，你可以很容易地改变这种光周期16 h光照：8 h黑暗周期一个星期前的光脉冲的管理。
6. 抑制这轮运行活动直接受光可以检查在昼夜周期的所有阶段使用ultradian（T7）光^周期 13 。这个周期包括3.5H光：3.5小时为1 ¹³周的时间黑暗。老鼠不能够使光脉冲秋季昼夜周期，在这1周的治疗过程中所有点photoentrain。 （图6）
7. 不断黑暗条件下，住房小鼠在恒定的光，就会发现一个特点的运行周期。然而，这一时期将是比在不断的黑暗发现时期较长。常亮自由运行期间的长度是正相关，与光照^强度 14，光增加的量，使自由运行期的长短。 （图7），但小鼠很少表现出超过26小时的周期。相反，在明亮的灯光下，他们的活动将成为心律失常。出于这个原因，它是光的强度是一个重要的考虑因素，如果你计划比较恒定的光周期的长度。
8. 在决定顺序执行这些光的扰动，记得前光周期可以影响生理节律。出于这个原因，最好是先用最温和的治疗开始，并​​逐步转移到更严重的光​​疗法。例如，photoentrainment分析，不断地暗，和相移都非常温和，似乎没有导致长期持久的影响。另一方面，T7周期和恒定的光非常苛刻的光治疗，可导致心律失常，并应保留实验结束。

4。分析数据

1. 轮运行的活动是收集和车轮转数分级给定的时间期间内发生的。这bin或采样间隔通常为10分钟。在Excel电子表格中显示每个容器内的数轮革命的数据可以显示。这可用于量化和比较轮革命。数据也显示，即在每个容器的活动量是由黑条像直方图的高度代表actogram。 （图2）
2. 活动开始的定义是占主导地位的活动回合开始。每一个人之间的确切的参数可能会有所不同，但一般来说，我们活动的第一回合，持续时间超过30分钟。
3. 为了分析小鼠photoentrain的能力，有几项措施可以看着。考虑photoentrained鼠标一个常用的方法是观察一个稳定之间的鼠标活动的发生和光以及鼠标的活动局限于黑暗阶段的大比例抵消关系。
4. 活动开始提供最多的信息时，再夹带光/暗周期提前，而活动的偏移是最翔实的研究重新夹带在光/暗周期的延误。小鼠通常需要5-7天，完全重新夹带自己的车轮运行活动到6个小时的光/暗周期提前或延迟。要考虑重新夹带，特别是在提前，鼠标，你应该观察一个发病之间的活动和偏移的光稳定关系。这种关系应该是相似的的是之前观察到的光周期提前，并应持续至少3天。 （图3）
5. 为了计算在恒定的黑暗和恒定的光的期间，活动onsets需要2周，待确定安装与回归线。如前所述，在野生型小鼠，在不断的黑暗时期将少于24小时，而在恒定的光期间将大于24小时。 （图2和7）
6. 当光脉冲计算转变，开始前至少5天，5天之后，光脉冲通过拟合回归线活动onsets。计算这两个回归线之间的差异，以确定相移的幅度。 （图4）

5。代表性的成果

当车轮的运行记录来看，你应该会看到几个小时的连续运行，在每个鼠标。由于老鼠是夜间活动，运行，或活跃的阶段，将相关的一个光/暗周期中的黑暗时期。在恒定的条件下运行的免费的小鼠也有这持续活跃的阶段，代表他们的自由运行的节奏活动局限于时期。在不断的黑暗，这将是少于24小时，并在恒光，大于24小时。 15分钟的1000lux光脉冲（CT16）活动开始后4小时，当局会在这个光脉冲延迟天活动开始。

图1：代表光频谱A.。由太阳产生的光谱广泛，相对400纳米和700纳米之间，这是视觉部分光谱的公正。 B.在红外线范围，从而导致其红色偏见强度低，在蓝色的范围内，白炽灯峰频谱。 C.典型的荧光灯泡，由分立的光高峰将出现“白”的眼睛。然而，日光型荧光灯泡有较高的广谱和离散频率峰。结果是不能被认为是白炽灯泡的热，但比一般的荧光灯具有更广泛的光源。

图2：昼夜photoentrainment。 actogram是从一个单一的鼠标图上绘制的y轴连续两天的活动，和时间上绘制的X轴。黑网吧代表车轮转数，背景是阴影给光/暗周期的迹象。在1-8天，鼠标被安置在12:12光：暗周期。在这段时间内，鼠标开始在灯的偏移运行，并巩固其活动，黑暗的阶段。在光阶段，活动是最小的。在第9天，的灯都关闭，留在黑暗中不断的鼠标。没有光周期，没有任何的生物钟，导致在其内源性的时间运行时钟输入。正如你可以看到，活动开始每一天早些时候的迹象表明，这种动物源性时钟不到24小时。

图3：重新夹带 。再夹带范例涉及光周期转移，无论是向前或向后迫使的生物钟调整到新的光周期。在这个例子中，先进的第9天的周期是6个小时，然后再推迟了20天6小时。在这两种情况下，需要完全重新夹带数天，但运动的方向，效果更明显，无论是在发作或偏移时间。

图4：昼夜节律短的光脉冲响应的转变 。答：在恒定的黑暗里的动物自由运行一段时间少于24小时。 15分钟1000勒克司的光脉冲在第8天，活动开始后（CT16），4个小时。在随后的日子里，在活动开始时的转变。相移预测动物的发病时间（从他们的活动之前，光脉冲决定）和时间，他们其实光脉冲后的日子里开始运行的差异。
相小鼠响应曲线显示的偏移量和方向会发生在一个简短的光脉冲，在特定的生理时期。一个在主观一天（CT0 - 12）的光脉冲，不能诱发了重大转变，被称为死区。从CT12 - 19，相位延迟可致与光脉冲峰值延迟发生在CT16。与CT 19日和24日，活动的节奏将提前在光脉冲光脉冲响应峰值提前出现在CT20。

图5：轮运行的活性被抑制或在夜间的光脉冲响应掩盖。在这个例子中，光周期是16H光：8小时黑暗和巩固活动。 3小时的光脉冲开始2个小时后，灯熄灭4天。在这段时间里，很少有没有车轮运行的活动呈现出的光线能够直接抑制活性。恢复活动后的光脉冲。

图6：T7光周期是用来揭露小鼠整个昼夜循环的光脉冲。的T7周期由3.5小时，3.5小时的黑暗光。在这个循环中，老鼠会保持昼夜节律，但是他们也将显示在光脉冲轮运行活动的掩蔽。活动期间光量可以比在黑暗的屏蔽措施，这是不偏颇的昼夜时间的活动量。

图7：常亮期延长

Discussion

昼夜节律进行了测量，并记录在整个历史上的各种生物。虽然我们有专门描述记录小鼠的活动节律的方法，这种技术可以很容易地修改，以衡量在其他啮齿类动物，如仓鼠和大鼠，这往往是昼夜研究的节奏。然而，freerunning期间和时间重新夹带其他生物体会有所不同。例如，在不断黑暗仓鼠freerunning期间为24.0小时，而在小鼠，这是不到24个小时。在这种情况下，你是一个有机体，这是不适合车轮运行活动的工作，许多相同的光范例可以使用，但不同的生理节奏应看着。最相似的措施，是一般的活动。在人类，猴子和狗，研究人员经常使用actigraphy，措施的个别运动的量。在人类中，体温和褪黑激素分泌也常用的测量，并已被证明有昼夜节律，这是移相能力，并能重新乘火车^15，16。

虽然我们认为离散出现这些生理节奏，他们是有相当的互连。可紧密覆盖一个动物的活动节律与体温节律和睡眠节奏的逆。此外，褪黑激素的分泌，往往是作为一个生理阶段的标志，非常类似于在人类的正常睡眠节律。因为这些周期是如此相互交织，一项研究可以告知和预测他人的结果。例如，NPAS2突变小鼠，这显示出黑暗的部分光线暗周期运行活动虽然连续轮，后来研究睡眠缺陷^17。这些老鼠被发现，睡眠少的整体，减少发生在黑暗的阶段，正常的“午睡时间”，。

车轮运行的活动提供了一个相对的非侵入性的方法来研究昼夜节律。上文所述的范例，可以用来完成一个昼夜的行为的详细分析。此外，如范例photoentrainment，并在不断的黑暗的房屋可以用来作为一个昼夜的表型更集中，如睡眠分析研究之前的初步调查。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics