Mesurant les réponses Lumière circadiens et aiguë chez la souris en utilisant l'activité roue qui tourne

Abstract

Les rythmes circadiens sont les fonctions physiologiques de ce cycle sur une période d'environ 24 heures (circa-circadien: approximatifs et diem: jour) ^{1, 2.} Ils sont responsables de synchronisation notre sommeil / éveil et les cycles de sécrétion de l'hormone. Depuis cette date n'est pas précisément de 24 heures, il est synchronisé avec le jour solaire par l'apport de lumière. Ceci est accompli via l'entrée photique de la rétine vers le noyau suprachiasmatique (NSC) qui sert de stimulateur maître synchronisation des horloges périphériques dans d'autres régions du cerveau et des tissus périphériques vers le cycle de l'environnement sombre lumière ^3-7. L'alignement des rythmes à ce cycle de l'environnement sombre lumière organise notamment des événements physiologiques à la niche correcte temporelle, qui est cruciale pour la survie ^8. Par exemple, les souris dorment pendant la journée et sont actifs la nuit. Cette capacité à consolider l'activité soit à la partie claire ou foncée de la journée est appelée photoentrainment circadiens et nécessite l'entrée de lumière de l'horloge circadienne ^9. Activité de la souris, la nuit est robuste en particulier en présence d'une roue qui tourne. La mesure de ce comportement est une méthode peu invasive qui peut être utilisé pour évaluer la fonctionnalité du système circadien ainsi que l'entrée de lumière à ce système. Les méthodes qui seront abordés ici sont utilisées pour examiner l'horloge circadienne, l'entrée de lumière à ce système, ainsi que l'influence directe de la lumière sur le comportement roue qui tourne.

Protocol

1. Installation du matériel

1. Préparation des groupes d'animaux est très importante lors de la création toute expérience comportementale. Pour l'activité roue qui tourne, toutes les souris doivent être de sexe masculin, appariés pour l'âge, et si possible à partir d'accouplements frère. Idéalement jeunes souris, environ 3 mois, sont utilisés pour l'activité roue qui tourne.
2. Avant de placer les animaux sur roues, la salle doit être complètement configuration. Cela comprend la préparation de chaque cage avec une roue, une roue de la révolution de sonde, une petite quantité de litière de souris dans le bas de chaque cage et une nourriture abondante et de l'eau pendant 2 semaines.
3. Éclairage de la pièce est très important, lorsque la mise en place des cages de roue marche, il est important de mesurer l'intensité lumineuse à chaque cage pour vérifier que vous avez trouvé un éclairage uniforme dans chaque cage. Par ailleurs, lors du choix d'une source de lumière, chercher un avec un large spectre couvrant 450nm-650nm. Beaucoup de compagnies offrent "la lumière du jour" ou "spectre" des ampoules fluorescentes, qui répondent à ce critère. (Voir Figure 1)

2. Montage expérimental

1. Lors de l'introduction des souris à la cage de roulement des roues, le faire dans un cycle de lumière qui correspond étroitement au cycle lumière / obscurité, ils étaient auparavant logés sous.
2. Essayez de répartir uniformément les souris afin de mieux garantir des environnements similaires pour tous les groupes. Par exemple, s'abstenir de tout regroupement d'un groupe de souris dans un domaine particulier, comme une seule étagère. Cela pourrait par inadvertance d'introduire une variable supplémentaire.
3. Avant de prendre toute perturbation du cycle de lumière ou de mesurer l'activité, vous devriez donner des souris environ une semaine pour s'acclimater à la nouvelle cage, et la roue. Toute souris qui ne fonctionnent pas sur les roues après une semaine devrait être retiré de la cage et remplacé par une autre souris.
4. Une fois que vous avez une cohorte d'animaux de façon stable, à roues, vous pouvez commencer à mettre en place des cycles jour / nuit pour tester différentes hypothèses. Les cycles de lumière différents sont discutés en détail dans la partie 3.

3. Les essais expérimentaux

1. Pour photoentrainment dosage, commencez par les souris de logement dans une lumière 12 h: 12 h cycle de sombre. Un exemple de ceci serait lumières de 7h00-7: 12 heures tandis que les lumières restent hors de 19h00-07h00. De plus, en abaissant l'intensité lumineuse de la partie 12 h de lumière du cycle va exposer les différences de sensibilité à la lumière des photoentrainment. Souris devrait être donné deux semaines pour photoentrain et avant de changer les intensités de lumière. (Figure 2)
2. Un aspect supplémentaire de photoentrainment est la capacité à réajuster ou ré-embarquer les rythmes circadiens d'un jour nouveau cycle jour / nuit. Cela peut être examiné par l'avancement du cycle lumière / obscurité que les souris sont logés dans de telle sorte que les lumières s'allument et s'éteignent plus tôt. Communément, les cycles de la lumière sont en hausse de 6 heures; par exemple, au lieu d'un cycle de lumière de 07h00-7: 12 heures, il serait 1h00-1: 12 heures. Cela peut aussi être examinée en retardant le cycle de lumière. Les souris sont généralement en mesure de re-embarquer dans les 5-7 jours. (Figure 3)
3. Ces paradigmes ne sont cependant pas, d'évaluer pleinement les fonctionnalités de l'horloge circadienne endogène. Souris de logement en constante des conditions sombres peuvent être utilisés pour mesurer la période circadienne endogène aussi connu comme la période sans course. Chez les animaux nocturnes tels que les souris de type sauvage, la période endogène est inférieure à 24 heures ce qui signifie qu'ils commencent à être diffusées sur la roue légèrement plus tôt chaque jour. (Figure 2) Le moment exact de cette période varie légèrement selon les souches de souris différentes. Par exemple, la période de libre fonctionnement de souris C57 est d'environ 23,3 heures alors que dans BALB / cJ souris, il est de 22,5 heures ^10.
4. Après détermination de la période gratuite fonctionnant en constante entrée sombre lumière des conditions pour le système circadien peuvent être examinées par décalage de phase. Déphasage est la capacité d'une impulsion de lumière aiguë de changer l'horloge circadienne. Déphasage qui peut être accompli par l'administration d'une impulsion lumineuse de courte durée (15 minutes; 1000lux) pendant la phase active de souris logés dans l'obscurité constante et en mesurant le début de l'activité sur les jours suivant cette impulsion lumineuse. (Figure 4) Des études antérieures ont produit des courbes de réponse (appelés courbes de réponse de phase) qui décrivent la quantité et la direction de déplacement en fonction de ce temps, la lumière est donnée ^{11, 12.} Par exemple, une minute 15, 1000 lux de lumière impulsion donnée 4 heures après le début de l'activité (CT16) va entraîner un retard de deux heures de l'activité, tandis que l'impulsion lumineuse même donné 8 heures après le début de l'activité (CT20) mènera à une avance de 2 heures. (Figure 4)
5. Pour tester l'effet direct de la lumière sur l'activité roue qui tourne, une impulsion de lumière peut être administré à des souris pendant la phase d'obscurité / actif. La présence de la lumière à ce moment va inhiber l'activité roues courir. Alors que la durée de cette impulsion lumineuse peut varier, nous avons constaté que d'une impulsion de 3 heures à partir de 2 heures après le début de la phase sombre est plus informative. (Figure 5) Dans certains cas, il peut être utile de consolider l'activité avant ce test, vous pouvez facilement faire cela en changeant ce cycle de lumière pour un éclairage 16 h: 8 h cycle de sombres une semaine avant l'administration de l'impulsion lumineuse.
6. Cette inhibition de la roue qui tourne activité directement par la lumière peut être examiné à toutes les phases du cycle circadien en utilisant un cycle ultradien lumière (T7) ^13. Ce cycle se compose de lumière 3.5h: 3,5 h sombres pour la durée de 1 semaine ^13. Les souris sont pas en mesure de photoentrain permettant des impulsions de lumière à tomber dans tous les points du cycle circadien au cours de ce traitement de 1 semaine. (Figure 6)
7. Similaires à la constante des conditions sombres, les souris du logement dans la lumière constante va révéler une caractéristique période sans course. Toutefois, cette période sera plus longue que la période dans l'obscurité constante. La longueur de la période de fonctionnement sans à la lumière constante est positivement corrélée avec l'intensité lumineuse ^14; comme la quantité de lumière augmente le fait de la longueur période sans course. (Figure 7) Cependant, les souris présentent rarement des périodes supérieures à 26 heures. Au lieu de cela, sous une lumière intense, leur activité va devenir arythmique. Pour cette raison, il est l'intensité lumineuse est une considération importante si vous prévoyez de comparer la longueur de la période de lumière constante.
8. Au moment de décider quel ordre effectuer ces perturbations lumière, avant de rappeler que les cycles de la lumière peut affecter les rythmes circadiens. Pour cette raison, il est préférable de commencer par le plus doux premiers traitements et progressivement passer à des traitements légers plus sévères. Par exemple, des dosages photoentrainment, sombre constante, et des décalages de phase sont tous très légers et ne semble pas conduire à des effets durables. D'autre part, le cycle T7 et lumière constante des traitements légers très sévère et peut conduire à une arythmie et devrait être réservé pour la fin de l'expérience.

4. Analyse des données

1. Roue-courir l'activité sont collectées et le nombre de tours de roue se produise dans une période de temps donnée binned. Cet intervalle bin ou d'échantillonnage est généralement de 10 minutes. Les données peuvent être affichées dans un tableur Excel indiquant le nombre de tours de roue dans chaque bac. Cela peut être utile pour quantifier et comparer les tours de roue. Les données peuvent également être affichées comme une Actogram lequel la quantité d'activité dans chaque bac est représentée par la hauteur d'une barre noire comme un histogramme. (Figure 2)
2. L'apparition d'activité est défini comme étant le début du combat d'activité prédominent. Les paramètres exacts peuvent varier entre chaque individu, mais généralement, nous recherchons pour le premier combat de l'activité qui dure plus de 30 minutes.
3. Pour analyser la capacité des souris à photoentrain, il existe plusieurs mesures qui peuvent être examinés. Une méthode couramment utilisée pour envisager une souris d'être photoentrained est l'observation d'une relation stable entre le début de l'activité de la souris et le décalage de la lumière ainsi que d'un grand pourcentage de l'activité de la souris étant limité à la phase sombre.
4. Le début de l'activité fournit le plus d'informations quand on regarde ré-entraînement à une avance du cycle lumière / obscurité, tandis que l'activité offset est plus informative lors de l'examen ré-entraînement à des retards dans le cycle lumière / obscurité. Souris prennent habituellement 5-7 jours à complètement ré-embarquer leur roue qui tourne activité à une avance de 6 heures ou retard du cycle lumière / obscurité. Pour envisager une souris réentraînées, en particulier en réponse à une avance, vous devriez observer une relation stable entre le début de l'activité et la lumière du décalage. Cette relation devrait être similaire à ce qui était observé avant l'avance du cycle de lumière et devrait persister pendant au moins trois jours. (Figure 3)
5. Pour calculer la période à la fois sombre et lumineuse constante constante, la en place de l'activité doivent être déterminés pour 2 semaines et équipé d'une ligne de régression. Comme mentionné précédemment, chez les souris de type sauvage, la période dans l'obscurité constante sera de moins de 24 heures alors que la période à la lumière constante sera supérieure à 24 heures. (Figures 2 et 7)
6. Lors du calcul du déplacement suite à une impulsion de lumière, commencer par les lignes de régression montage d'onsets activité pendant au moins 5 jours avant et 5 jours après l'impulsion lumineuse. Calculez la différence entre ces deux lignes de régression pour déterminer l'ampleur du décalage de phase. (Figure 4)

5. Les résultats représentatifs

Lorsque l'on regarde les dossiers roue qui tourne, vous devriez vous attendre à voir plusieurs heures de fonctionnement continu dans chaque souris. Parce que les souris sont nocturnes, cette course, ou phase active, en corrélation avec la période sombre de la présence d'un cycle lumière / obscurité. Souris sans courir dans des conditions constantes auront aussi cette période d'activité soutenue confinés représentant la phase active de leur free-running rythme. Dans l'obscurité constante, ce sera plus court que 24 heures et à la lumière constante,supérieure à 24 heures. L'administration d'un 15-minute 1000lux lumière pulsée 4 heures après le début de l'activité (CT16) se traduira par l'apparition retardée d'activité sur les jours suivant cette impulsion lumineuse.

Figure 1: spectres lumineux représentant A.. Le spectre de la lumière produite par le soleil est large et relativement impartial entre 400nm et 700nm, qui est la partie visible du spectre lumineux. B. Le spectre d'un des pics de lumière incandescente dans la gamme infrarouge, ce qui conduit à sa partialité rouge, avec de faible intensité dans le bleu. C. L'ampoule fluorescente typique, composé de pics discrets de lumière qui apparaissent «blanc» à l'œil. D. Toutefois, les ampoules fluorescentes lumière du jour ont une plus large spectre et les pics de fréquence discrète. Le résultat est une source de lumière qui n'est pas aussi chaud que d'une ampoule à incandescence, mais a un spectre plus large que la moyenne d'une ampoule fluorescente.

Figure 2: photoentrainment circadiens. Le Actogram est un graphique de l'activité à partir d'un simple clic de souris, où les journées consécutives sont tracées sur l'axe des y, et le temps est représentée sur l'axe des abscisses. Les barres noires représentent le nombre de tours de roue, et le fond est ombré pour donner une indication du cycle lumière / obscurité. Les jours 1-8, la souris est logé dans une lumière 12h12: Cycle sombre. Pendant ce temps, la souris commence à courir à l'offset de lumières et consolide son activité à la phase d'obscurité. Pendant la phase de la lumière, l'activité est minimale. Le jour 9, les lumières sont éteintes, laissant la souris dans l'obscurité constante. Sans un cycle de lumière, il n'ya pas d'entrée de l'horloge circadienne, qui se traduit par l'horloge fonctionnant sur son temps endogène. Comme vous pouvez le voir, l'activité commence plus tôt chaque jour une indication que l'horloge endogène de cet animal est de moins de 24 heures.

Figure 3: ré-entraînement. Ré-entraînement paradigmes impliquent déplaçant le cycle de lumière soit avant ou en arrière forçant l'horloge circadienne pour ajuster le cycle de lumière nouvelle. Dans cet exemple, le cycle est avancé 6 heures le jour 9, puis retardé 6 heures le jour de 20. Dans les deux cas, plusieurs jours sont nécessaires pour pleinement ré-entraînement, toutefois, selon la direction du mouvement, l'effet est plus prononcé dans l'apparition ou non du temps de décalage.

Figure 4: Les rythmes circadiens changement en réponse à de courtes impulsions de lumière. A. Animaux logés dans l'obscurité constante free-run, avec une période plus courte que 24 heures. Au jour 8, une de 15 minutes 1000-lux impulsion lumineuse est donné quatre heures après le début de l'activité (CT16). Les jours suivants, un décalage dans le temps l'apparition d'activité est observée. Le déphasage est la différence dans le temps l'apparition de l'animal prévu (déterminé à partir de leur activité avant l'impulsion de lumière) et le temps qu'ils ont effectivement commencer à courir les jours suivants l'impulsion lumineuse.
B. La courbe de réponse en phase pour des souris montre la quantité et la direction du changement qui se produira en réponse à une brève impulsion de lumière au moment précis du rythme circadien. Une impulsion de lumière pendant la journée subjective (CT0-12) ne peut pas induire un changement significatif, appelée la zone morte. Du CT12-19, un retard de phase peut être induite par le retard de pointe survenant en réponse à une impulsion de lumière à CT16. Entre 19 et 24 CT, le rythme d'activité fera avancer en réponse à une impulsion de lumière avec l'avance maximale a lieu en réponse à une impulsion de lumière à CT20.

Figure 5: Roue-courir l'activité est inhibée ou masquée en réponse à une impulsion de lumière la nuit. Dans cet exemple, le cycle de lumière est la lumière 16h: 8h sombres et consolide l'activité. Une impulsion lumineuse de 3 heures commence 2 heures après les lumières s'éteignent le jour 4. Pendant ce temps, il ya peu ou pas d'activité roues courir montrant la capacité de la lumière pour inhiber directement l'activité. Activité reprend à la suite de l'impulsion lumineuse.

Figure 6: un cycle de lumière T7 est utilisée pour exposer des souris à des impulsions de lumière tout au long du cycle circadien. Le cycle se compose T7 de 3,5 heures de lumière suivie par 3,5 heures d'obscurité. Dans ce cycle, les souris vont maintenir un rythme circadien, mais ils affichent également de masquage de l'activité roue qui tourne pendant les impulsions de lumière. Le montant de l'activité pendant la lumière peut être comparée à la quantité d'activité pendant la nuit pour une mesure de masquer ce qui n'est pas biaisée par le rythme circadien.

Figure 7: Période allongement de la lumière constante

Discussion

Les rythmes circadiens ont été mesurés et enregistrés dans divers organismes à travers l'histoire. Alors que nous avons spécifiquement décrit la méthode d'enregistrement des rythmes d'activité chez la souris, cette technique peut être facilement modifié pour mesurer des rythmes dans d'autres rongeurs comme les hamsters et les rats, qui sont souvent utilisés dans les études circadien. Toutefois, la période freerunning et le temps de ré-embarquer dans d'autres organismes peuvent varier. Par exemple, la période freerunning d'un hamster dans une obscurité constante est 24,0 heures, tandis que chez la souris, il est de moins de 24 heures. En la circonstance, que vous travaillez dans un organisme, ce qui n'est pas adapté à l'activité roue qui tourne, la plupart des paradigmes même lumière peut être utilisée, toutefois un rythme différent physiologiques doivent être examinés. La mesure la plus proche est l'activité générale. Chez les humains, les singes et les chiens, les chercheurs utilisent souvent actigraphie, qui mesure la quantité de mouvement de l'individu. Chez les humains, la température du corps et la sécrétion de la mélatonine sont aussi communément mesurés et ont tous deux été démontré qu'ils ont un rythme circadien, qui est capable de déphasage et capable de ré-embarquer ^{15, 16.}

Alors que nous pensons de ces rythmes physiologiques comme des événements discrets, ils sont assez liés. Le rythme d'activité d'un animal peut être étroitement superposée avec le rythme de la température corporelle et est l'inverse d'un rythme de sommeil. Par ailleurs, la sécrétion de mélatonine qui est souvent utilisé comme marqueur de la phase circadienne, ressemble de près le rythme de sommeil normal chez les humains. Parce que ces cycles sont si imbriqués, l'étude de l'un peut informer et de prévoir les résultats des autres. Par exemple, NPAS2 souris mutantes, qui a montré la roue fonctionnement continu l'activité si la partie sombre d'un cycle de lumière noire, ont plus tard été examinés pour ¹⁷ anomalies du sommeil. Ces souris ont été trouvés à moins dormir ensemble, avec la diminution survenant pendant la phase d'obscurité, le «moment de la sieste" normale.

L'activité de roulement des roues est un moyen relativement non-invasive pour examiner les rythmes circadiens. Les paradigmes décrits ci-dessus peut être utilisé pour compléter une analyse détaillée du comportement circadien. En outre, les paradigmes tels que photoentrainment et le logement dans l'obscurité constante peut être utilisée comme une enquête initiale sur les phénotypes circadien préalable à la recherche plus concentrée, comme l'analyse du sommeil.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics