Измерение Циркадные и остром Ответы Свет в использовании колеса мыши Запуск активность

Abstract

Суточный ритм физиологических функций, что цикл в течение приблизительно 24 часов (циркадного-ок: приблизительными и суточные: день) ^{1, 2.} Они несут ответственность за сроки нашего сна / бодрствования циклов и гормональной секреции. Так как это времени точно не 24-часов, он синхронизирован с солнечным светом дня ввода. Это достигается с помощью световой вход от сетчатки к ядру супрахиазматическое (SCN), который служит в качестве главного стимулятора периферических синхронизации часов и в других регионах мозга и периферических тканей к экологическим свет темно цикла ^3-7. Выравнивание ритмы этого естественного освещения темных цикл организует особых физиологических событий в правильной временной нише, которая имеет решающее значение для выживания ^8. Например, мыши спать днем ​​и активны ночью. Эта способность консолидировать деятельность либо светло-или темно часть дня называется циркадный photoentrainment и требует свет вклад в циркадных часов ^9. Деятельность мышей ночью является надежной особенно в присутствии ходового колеса. Измерение такого поведения является минимально инвазивных методов, которые могут быть использованы для оценки функциональности циркадной системы, а также легкие вклад в эту систему. Методы, которые будут покрыты здесь используются для изучения циркадных часов, легкий вход в эту систему, а также прямое воздействие света на колесо работает поведения.

Protocol

1. Оборудование установки

1. Подготовка групп животных очень важно при создании любой поведенческий эксперимент. Для колесо работает деятельности, все мыши должны быть мужчина, возраст совпадают, и, если возможно с братом вязки. В идеале молодых мышей, около 3 месяцев, используются для колес работает деятельности.
2. До создания каких-либо животных на колесах, комната должна быть полностью установки. Это включает в себя подготовку каждой клетке с 1 колесо, 1 оборот колеса зонд, небольшое количество мышей и постельные принадлежности в нижней части каждой клетки и достаточно пищи и воды в течение 2 недель.
3. Освещение помещения очень важно, при создании колесо работает клетки важно для измерения интенсивности света в каждой клетке, чтобы убедиться, что вы получаете ровное освещение в каждой клетке. Кроме того, при выборе источника света, посмотрите на один с широким спектром покрытие 450nm-650nm. Многие компании предлагают "дневной свет" или "полный спектр" люминесцентные лампы, которые отвечают этому критерию. (См. рисунок 1)

2. Эксперимент установки

1. При введении мышам колесо работает клетку, сделать это в свет цикл, который точно соответствует светлый / темный цикла они ранее были размещены под.
2. Постарайтесь, чтобы равномерно распределить мышей более эффективного обеспечения аналогичных условиях для всех групп. Например, воздерживаться от кластеризации все одна группа мышей в определенной области, таких как одного полка. Это может случайно ввести дополнительную переменную.
3. Прежде чем сделать какой-либо свет возмущения цикла или измерения активности, вы должны дать мышей примерно одной недели, чтобы привыкнуть к новой клетке, и колеса. Любой мышей, которые не работают на колеса через неделю должны быть удалены из клетки и заменен на другой мыши.
4. После того как вы когорте животных стабильно работает на колесах, вы можете начать настройку свет / темно-циклов для проверки различных гипотез. Различных циклов света подробно обсуждается в части 3.

3. Экспериментальные Анализы

1. Для анализа photoentrainment, начните с жильем мышей в 12 ч свет: 12 ч темно цикла. Примером этого может быть свет с 7:00-7: 00pm в то время как свет не от с 7:00 ч. 7:00 утра. Кроме того, снижение интенсивности света за 12 ч светлой части цикла возникает никаких различий в светочувствительность для photoentrainment. Мыши следует две недели, чтобы photoentrain и перед изменением интенсивности света. (Рис. 2)
2. Дополнительный аспект photoentrainment является возможность перенастраивать или вновь увлекают циркадных ритмов в новом свете / темно-цикла. Это может быть рассмотрено продвижение светлый / темный цикл, что мыши, расположены в таких, что свет будет включаться и выключаться раньше. Как правило, легкие циклы являются передовыми на 6 часов: например, вместо того, чтобы свет цикл 7:00 утра-7: 12 вечера, это будет 1:00 утра-1: 12 вечера. Это также может быть рассмотрено, задерживая свет цикла. Мыши, как правило, в состоянии повторно увлекают в 5-7 дней. (Рис. 3)
3. Эти парадигмы не делают, однако, в полной мере оценить функциональность эндогенных циркадных часов. Жилищный мышей в постоянной темноте может быть использован для измерения эндогенных циркадных период также известный как свободный ход период. В ночных животных, таких как мышей дикого типа, эндогенные период менее 24 часов означает, что они запущены на колесо чуть раньше каждый день. (Рис. 2) точное время этого периода немного варьируется между различными штаммами мыши. Например, свободный ход период C57 мышей составляет примерно 23,3 часов, а в BALB / CJ мышей она составляет 22,5 часа ^10.
4. После определения свободного хода период в постоянном темные входные условия освещения на циркадных системы могут быть рассмотрены через сдвиг фаз. Сдвига фаз является способность острого импульса света сдвиг циркадных часов. Фазового сдвига может быть достигнуто путем введения короткого светового импульса (15 минут; 1000lux) во время активной фазы мышей размещены в постоянной темноте и измерения начала деятельности на следующий день после этого светового импульса. (Рис. 4) Предыдущие исследования дали ответ кривые (называемые кривые фазовой характеристики), которые описывают величину и направление смещения основано на какое время свет дается ^{11, 12.} Например, 15 минут, 1000 люкс светового импульса данной 4 часа после начала деятельности (CT16) приведет к 2-часовой задержки в деятельности, в то время как тот же световой импульс дано 8 часов после начала деятельности (CT20) приведет на 2 часа вперед. (Рис. 4)
5. Чтобы проверить прямое воздействие света на колесо работает деятельности, светового импульса можно вводить мышам в темное / активную фазу. Присутствие света в это время будет тормозить колесо работает деятельности. В то время как длина этого светового импульса может меняться, мы обнаружили, что 3-часовой импульса, начиная через 2 часа после начала темновой фазы является наиболее информативным. (Рисунок 5) В некоторых случаях она может быть полезна для консолидации деятельности до этого теста, вы легко можете сделать это, изменив этот свет цикл 16 ч света: 8 ч темно цикл одной недели до введения светового импульса.
6. Это торможение колес работает деятельность непосредственно светом может быть рассмотрен на всех этапах циркадного цикла с помощью ultradian (Т7) световой цикл ^13. Этот цикл состоит из 3.5h света: 3,5 ч темноте продолжительность 1 неделя ^13. Мыши не могут photoentrain позволяет световых импульсов падать во всех точках циркадного цикла в течение этого 1-й неделе лечения. (Рис. 6)
7. Как и в постоянной темноте, жилье мышей в постоянном свете покажет характерный для свободного хода период. Тем не менее, этот период будет дольше, чем период находится в постоянной темноте. Длина свободного хода период в постоянный свет положительно коррелирует с интенсивностью света ^14; как количество света увеличивается, так же свободный ход длиной периода. (Рис. 7) Тем не менее, мыши редко показывают периоды, превышающие 26 часов. Вместо этого, при ярком свете, их деятельность станет аритмичный. По этой причине, это интенсивность света является важным фактором, если вы планируете сравнить период длиной в постоянном освещении.
8. Решая, какой для выполнения этих легких возмущений, помните, что до света циклов могут влиять на циркадные ритмы. По этой причине, то лучше начать с мягкой лечения первого и постепенно переходить к более тяжелым лечения светом. Например, photoentrainment анализов, постоянное темно, и фазовые сдвиги все очень мягкая и, кажется, не приведет к долгосрочными последствиями. С другой стороны, цикл T7 и постоянный свет очень жесткие лечения легких и может привести к аритмии и должны быть зарезервированы для конца эксперимента.

4. Анализ данных

1. Колесные работает активности собирается и число оборотов колеса, происходящие в данный период времени binned. Это бен или интервал выборки обычно 10-минут. Данные могут быть отображены в таблицу Excel, показывающие число оборотов колеса в пределах каждой ячейки. Это может быть полезно для количественной оценки и сравнения колесо революции. Данные также могут быть отображены как актограммы которой количество активности в каждом бен представлена ​​высоты черная полоса, как гистограмма. (Рис. 2)
2. Активность начала определяется как начало преобладать бой деятельности. Точные параметры могут варьироваться в зависимости от каждого отдельного человека, но, как правило, мы ищем первый приступ активности, который длится более 30 минут.
3. Чтобы проанализировать способность мышей photoentrain, Есть несколько мер, которые могут быть рассмотрены. Распространенный метод, используемый для рассмотрения мыши для photoentrained является наблюдение стабильных отношений между началом активности мыши и смещение света, а также большой процент активности мыши замыкаясь в темные фазы.
4. Начала деятельности обеспечивает наиболее полную информацию при взгляде на вторичный унос для продвижения свет / темно-цикла, в то время как деятельность смещение наиболее информативным при рассмотрении повторного увлечения к задержкам в свет / темно-цикла. Мыши обычно занимает 5-7 дней полностью заново увлекают их колесо работает деятельности 6-часового заранее или задержка свет / темно-цикла. Рассмотреть мыши повторно увлекаются, особенно в ответ на заранее, вы должны наблюдать стабильные отношения между началом деятельности и смещение света. Эти отношения должны быть похожи на то, что наблюдалось до света заранее цикла и должна сохраняться в течение не менее трех дней. (Рис. 3)
5. Для расчета в обеих постоянной темно и постоянный свет, натисков деятельности должны быть определены в течение 2 недель и оснащены линии регрессии. Как упоминалось ранее, в мышей дикого типа, период в постоянном темно будет меньше, чем 24 часов, а период, в постоянном свете будет больше, чем за 24 часов. (Рис. 2 и 7)
6. При расчете сдвига следующие светового импульса, начать с установки линии регрессии к деятельности натисков, по крайней мере за 5 дней до и 5 дней после светового импульса. Вычисление разницы между этими двумя линиями регрессии для определения величины фазового сдвига. (Рис. 4)

5. Представитель Результаты

Если посмотреть на колесо работает записи, вы должны ожидать увидеть несколько часов непрерывной работы в каждой мыши. Потому что мыши ведут ночной образ жизни, это работает, или активную фазу, будет коррелировать с темный период в присутствии свет / темно-цикла. Мыши свободного хода в постоянных условиях также будет иметь это ограничивается период устойчивого деятельности представляющих активную фазу своего автономный ритм. В постоянной темноте, это будет менее 24 часов и в постоянном свете,больше, чем 24 часов. Администрация 15-минутный 1000lux светового импульса через 4 часа после начала деятельности (CT16) приведет к более позднему наступлению деятельности на следующий день после этого светового импульса.

Рисунок 1: представитель спектр света А.. Светового спектра производства солнце широкая и относительно беспристрастного между 400 нм и 700 нм, которая является визуальной части светового спектра. Б. спектр ламп накаливания пиков в инфракрасном диапазоне, что приводит к ее красным смещением, с низкой интенсивностью в синем диапазоне. С типичной люминесцентные лампы, состоит из дискретных пика света, который появится "белый" для глаз. D. Однако, дневной свет люминесцентных ламп, имеют более высокий и широкий спектр дискретных пика частоты. Результатом является источником света, который не так жарко, как лампы накаливания, но имеет более широкий спектр, чем средние флуоресцентные лампы.

Рисунок 2: Суточный photoentrainment. Актограммы представляет собой график активности из одной мыши, где дней подряд, наносятся на оси ординат, а время отложено на оси абсцисс. Черные полосы представляют количество дисков революций, и фон затененной дать указание свет / темно-цикла. В дни 1-8, мышь находится в 12:12 свет: темно-цикла. В это время, мышь начинает работать на смещение света и консолидирует свою деятельность на темную фазу. Во время легкой фазы, активность минимальна. На 9-й день, свет выключен, в результате чего мыши в постоянной темноте. Без света цикл, нет никакого вклада в циркадных часов, в результате чего часы, работающие на ее эндогенного времени. Как вы можете видеть, деятельность начинается раньше, каждый день, признак того, что эндогенные часы этого животного составляет менее 24 часов.

Рисунок 3: Re-увлечения. Повторное увлечения парадигмы включают смещение света цикла вперед или назад заставляя циркадных часов, чтобы приспособиться к новому циклу свет. В этом примере цикл передовых 6 часов в день 9, а затем задержкой 6 часов в день 20. В обоих обстоятельств, за несколько дней, необходимых для полного повторного увлечения, однако в зависимости от направления движения эффект более выражен либо в начало или смещение времени.

Рисунок 4: Суточный ритм сдвиг в ответ на короткие импульсы света. А. Животные размещаются в постоянной темноте свободно работать с периодом менее 24 часов. На 8-й день, 15-минутный 1000-люкс светового импульса дается 4 часа после начала деятельности (CT16). В последующие дни, сдвиг в активности времени начала не наблюдается. Фазовый сдвиг разница в предсказал наступление животного времени (определяется от их деятельности до светового импульса) и время, что они фактически запущен на следующий день после светового импульса.
Б. кривой ФЧХ для мышей показывает величину и направление сдвига, который будет происходить в ответ на краткий импульс света в определенное циркадных раз. Светового импульса при субъективной день (а0-12) не могут вызвать значительные изменения, называемые мертвые зоны. С CT12-19, фазовая задержка может быть вызвана с пиком задержки, происходящие в ответ на световой импульс на CT16. Между CT 19 и 24 ритмов активности будет продвигать в ответ на световой импульс с пиковой заранее, происходящих в ответ на световой импульс на CT20.

Рисунок 5: Колесные работает деятельность запрещена, либо маскируются в ответ на импульс света в ночное время. В этом примере свет цикла 16h свет: 8х темно и консолидирует деятельность. 3-часовой световой импульс начинается через 2 часа после подсветка выключается на 4-й день. За это время, есть немного ни к какому колесо работает деятельности показывает способность света непосредственно ингибируют активность. Активность возобновится после светового импульса.

Рисунок 6: T7 свет цикл используется для предоставления мышей световых импульсов по всему циркадного цикла. Цикл T7 состоит из 3,5 часов света следуют 3,5 часов темноты. В этом цикле, мыши будет поддерживать суточный ритм, однако они также отображаются маскировка колесо работает активность во время световых импульсов. Количество активность во время свет можно сравнить с количеством деятельность в темное для меры маскировки, которая не смещены циркадных времени.

Рисунок 7: Период удлинение в постоянный свет

Discussion

Суточный ритм были измерены и записаны в различных организмов на протяжении истории. Хотя у нас есть описанные метод регистрации активности ритмов у мышей, этот метод может быть легко модифицирован для измерения ритмов в других грызунов, таких как хомяки и крысы, которые часто используются в циркадных исследований. Тем не менее, freerunning период и время, чтобы повторно увлекают в другие организмы будут меняться. Например, freerunning период хомяка в постоянной темноте 24,0 часов, в то время как у мышей она составляет менее 24 часов. В обстоятельство, что вы работаете в организме, которые не подходят для колес работает деятельности, многие из тех же парадигмы свет может быть использован, однако различные физиологические ритм должны быть рассмотрены. Наиболее подобная мера является общей активности. У людей, обезьян и собак, исследователи часто используют actigraphy, который измеряет количество движения человека. У людей, температура тела и секреции мелатонина также обычно измеряется и как было показано, что циркадный ритм, который способен сдвига фаз и возможность вновь увлекают ^{15, 16.}

Хотя мы думаем об этих физиологических ритмов в виде дискретных событий, они вполне взаимосвязаны. Деятельности ритм животного может быть тесно с наложенным на него ритм температуры тела и является обратной сна ритм. Кроме того, секреции мелатонина, который часто используется в качестве маркера циркадных фаз, напоминает нормальный ритм сна у людей. Потому что эти циклы так переплетены, изучение можно сообщить и предсказать результаты других. Например, NPAS2 мутантных мышей, которые показали, непрерывное колесо работает деятельности будто из темной части света темными цикла, позднее были рассмотрены для сна дефектов ^17. Эти мыши оказались спать меньше, в целом, с уменьшением, возникающие в процессе темновой фазы, нормальные "тихий час".

Колесо работает деятельности обеспечивает относительно неинвазивным способом для изучения циркадных ритмов. Парадигм описанные выше, могут быть использованы для завершения детального анализа циркадных поведения. Кроме того, парадигмы, такие как photoentrainment и жилья в постоянной темноте может быть использован как первоначальный осмотр циркадных фенотипы до более концентрированный исследований, таких как сон анализа.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics