Mätning Circadian och akut Ljus svar på mus genom användning Wheel Löpning Aktivitet

Abstract

Dygnsrytmen är fysiologiska funktioner som cyklar över en period på cirka 24 timmar (dygnsrytm-ca: ungefärliga och Diem: dag) ^{1, 2.} De är ansvariga för timing vår sömn / cykler vakna och hormon. Eftersom detta timing är inte exakt 24-timmar, det är synkroniserad med solens dag av ljus ingång. Detta sker via fotiska input från näthinnan till suprachiasmatiska kärnan (SCN) som fungerar som befälhavare pacemakern synkronisering perifera klockor i andra regioner i hjärnan och i perifera vävnader till miljö-ljus mörker-cykel ^3-7. Anpassningen av rytmer till denna miljö ljus mörker-cykel organiserar särskilda fysiologiska händelser till rätt tidsmässiga nisch, vilket är avgörande för överlevnad ^8. Till exempel möss sova under dagen och är aktiva på natten. Denna förmåga att konsolidera verksamheten till antingen ljusa eller mörka delen av dagen kallas dygnsrytm photoentrainment och kräver ljus bidrag till dygnsrytm klockan ^9. Aktivitet av möss på natten är robust särskilt i närvaro av en löpande hjul. Att mäta detta beteende är en minimalinvasiv metod som kan användas för att utvärdera funktionaliteten av dygnsrytm systemet och ljus input till detta system. Metoder som kommer att behandlas här används för att undersöka dygnsrytm klocka, ljus input till detta system, liksom den direkta påverkan av ljus på hjul kör beteende.

Protocol

1. Installation av utrustningen

1. Beredning av djurgrupper är mycket viktigt när du ställer in en beteendevetenskaplig experiment. För hjulet igång verksamheten, alla möss bör man, matchas ålder, och om möjligt från syskon parningar. Helst yngre möss, cirka 3 månader gammal, används för att hjulet igång verksamheten.
2. Innan placera några djur på hjul behöver utrymme för att vara helt installationen. Detta inkluderar att förbereda varje bur med ett hjul, en hjulvarv sond, en liten mängd musen strö i botten av varje bur och gott om mat och vatten i 2 veckor.
3. Belysningen i rummet är mycket viktigt, när inrätta hjulet igång burar är det viktigt att mäta ljusstyrkan vid varje bur för att verifiera att du får jämn belysning i varje bur. Dessutom när man väljer en ljuskälla, leta efter en med ett brett spektrum täcker 450nm-650nm. Många företag erbjuder "dagsljus" eller "fullt spektrum" lysrör, som uppfyller detta kriterium. (Se figur 1)

2. Experiment Setup

1. Vid införandet möss till hjulet kör bur, göra det i en lätt cykel som nära överensstämmer med ljus / mörker-cykel de tidigare var inrymt under.
2. Försök att fördela möss att bättre säkerställa en liknande miljöer för alla grupper. Till exempel avstå från klustring alla en grupp av möss i ett visst område, såsom en enda hylla. Detta kan oavsiktligt införa en extra variabel.
3. Innan du gör något ljus cykel störningar eller mäta aktiviteten, bör du ge mössen cirka en vecka att acklimatisera sig till den nya buren, och hjul. Alla möss som inte kör på hjulen efter en vecka bör tas bort från buren och ersätts med en annan mus.
4. När du har en kohort av djur stabilt på hjul, kan du börja ställa in ljus / mörker cykler för att testa olika hypoteser. De olika ljus cykler diskuteras i detalj i del 3.

3. Experimentella analyser

1. För analys photoentrainment, börja med bostäder möss i en 12 h ljus: 12 tim mörker-cykel. Ett exempel på detta skulle vara lampor på från 7:00-7: 12:00 medan ljuset förblir ledigt från 7:00 till 7:00. Dessutom kommer sänka ljusstyrkan till 12 timmar ljus del av cykeln avslöja eventuella skillnader i ljus känslighet för photoentrainment. Möss bör ges två veckor till photoentrain och innan man byter ljusintensiteter. (Figur 2)
2. En ytterligare aspekt av photoentrainment är möjligheten av att anpassa eller på nytt STIGA PÅ TÅG dygnsrytmen för att ett nytt ljus / mörker-cykel. Detta kan undersökas genom att främja ljus / mörker-cykel att möss är inrymt i så att belysningen slås på och av tidigare. Vanligen är lätta cykler avancerade med 6 timmar, till exempel, istället för en lätt cykel av 7:00-7: 12:00, skulle det vara 1:00-1: 12:00. Detta kan också undersökas genom att fördröja ljuset cykeln. Möss är oftast möjlighet att åter STIGA PÅ TÅG i 5-7 dagar. (Figur 3)
3. Dessa paradigm dock inte helt bedöma funktionaliteten hos den endogena dygnsrytm klockan. Bostäder möss i konstant mörker kan användas för att mäta den endogena dygnsrytm period även känd som Free Running period. I nattaktiva djur, till exempel vildtyp möss, är den endogena period av mindre än 24 timmar vilket betyder att de börjar visas på hjulet en något tidigare varje dag. (Figur 2) Den exakta tidpunkten för denna period varierar något mellan olika musstammar. Till exempel är den fria körs under C57 möss ca 23,3 timmar medan BALB / CJ möss är det 22,5 timmar ^10.
4. Efter bestämning av lösspringande period i konstant mörker ljus bidrag till dygnsrytm systemet kan granskas genom fasförskjutningen. Fasförskjutningen är förmågan hos ett akut ljuspuls att flytta dygnsrytm klockan. Fasförskjutningen kan åstadkommas genom att ge en kort ljuspuls (15 minuter, 1000lux) under den aktiva fasen av möss inrymt i ständigt mörker och mäta effekten innebär att på de dagar efter detta ljus puls. (Figur 4) Tidigare studier har gett respons kurvor (sk fas responskurvor) som beskriver den mängd och riktning förskjutning baserat på vilken tid ljuset ges ^{11, 12.} Till exempel, en 15 minuters 1000 lux ljuspuls ges 4 timmar efter starten av verksamheten (CT16) kommer att leda till en 2 timmars försening i aktivitet, medan samma ljuspuls ges 8 timmar efter starten av verksamheten (CT20) kommer att leda till en 2 timmars förväg. (Figur 4)
5. För att testa den direkta effekten av ljus på hjul kör aktivitet, kan en ljuspuls ges till möss under den mörka / aktiva fasen. Närvaron av ljus vid den här tiden kommer att hämma hjul igång verksamheten. Även längden på denna ljuspuls kan variera, har vi funnit att en 3-timmars puls start 2 timmar efter starten av den mörka fasen är mest informativa. (Figur 5) I vissa fall kan det vara värdefullt att konsolidera verksamheten före provningen, kan du enkelt göra detta genom att ändra detta ljus cykel till en 16 h ljus: 8 h mörker-cykel en vecka före administrering av ljuset puls.
6. Denna hämning av hjulet igång verksamheten direkt av ljus kan undersökas i alla faser av dygnsrytm cykeln med hjälp av en ultradian (T7) ljus cykel ^13. Denna cykel består av 3,5 h ljus: 3,5 h mörker under hela 1 vecka ^13. Möss kan inte photoentrain låta ljuspulser falla på alla ställen i den dygnsrytm cykel under loppet av en veckas behandling. (Figur 6)
7. Liknande till konstant mörker kommer bostäder möss i konstant ljus visar en karakteristisk frispringande period. Kommer dock denna period vara längre än den period som finns i konstant mörker. Längden på lösspringande period i konstant ljus är positivt korrelerad med ljusintensitet ^14, eftersom mängden ljus ökar så ökar den fria körs perioden längd. (Figur 7) Men möss visar sällan perioder mer än 26 timmar. Istället, under starkt ljus, kommer deras verksamhet att bli arytmier. Av denna anledning är det ljusintensiteten är en viktig faktor om du planerar att jämföra period längd i konstant ljus.
8. När man beslutar vilka för att utföra dessa lätta störningar, kom ihåg att innan ljuset cykler kan påverka dygnsrytmen. Av denna anledning är det bäst att börja med den mildaste behandlingar först och successivt övergå till mer allvarliga ljusbehandlingar. Till exempel photoentrainment analyser, konstant mörk och skiftar fasen är alla mycket mild och verkar inte leda till långvariga effekter. Å andra sidan T7 cykeln och konstant belysning är mycket hårda ljusbehandlingar och kan leda till arytmi och bör reserveras för i slutet av försöket.

4. Analysera data

1. Hjul-running aktivitet samlas och antalet hjulens varvtal inträffar inom en given binned tidsperiod. Detta bin eller samplingsintervall är vanligen 10-minuter. Data kan visas i ett Excel-ark som visar antalet hjulens varvtal inom varje fack. Detta kan vara användbart för att kvantifiera och jämföra hjul revolutioner. Uppgifterna kan också visas som ett actogram varvid beloppet för aktiviteten i varje fack representeras av höjden på ett svart fält som ett histogram. (Figur 2)
2. Aktivitet debut definieras som i början av dominerar verksamheten matchen. Den exakta parametrar kan variera mellan varje individ, men generellt ser vi för första anfall av aktivitet som varar längre än 30 minuter.
3. För att analysera möjligheten för möss att photoentrain finns det flera åtgärder som kan ses. En vanlig metod som används för att överväga en mus som photoentrained är observation av ett stabilt förhållande mellan uppkomsten av musen verksamhet och offset av ljus, liksom en stor del av musens verksamhet som begränsas till den mörka fasen.
4. Uppkomsten av aktivitet ger mest information när man tittar på nytt ångan till en före ljus / mörker-cykel, medan aktiviteten offset är mest informativa när man undersöker åter övningsprovet till förseningar i ljus / mörker-cykel. Möss tar vanligtvis 5-7 dagar att helt nya STIGA PÅ TÅG sina hjul kör verksamheten till en 6-timmars förväg eller försening av ljus / mörker-cykel. Att överväga en mus igen fångas, särskilt som svar på ett förskott, bör du följa ett stabilt förhållande mellan uppkomsten av aktivitet och offset av ljus. Detta förhållande bör likna det som observerades innan ljuset cykeln förväg och ska stanna i minst tre dagar. (Figur 3)
5. För att beräkna tid i både konstant mörker och konstant ljus, erhölls verksamheten måste fastställas i 2 veckor och utrustad med en regressionslinje. Som nämnts tidigare i vildtyp möss, kommer den period i konstant mörker vara kortare än 24 timmar medan den period i konstant ljus kommer att vara större än 24 timmar. (Figur 2 och 7)
6. Vid beräkning av förändring efter en ljuspuls, börja med att montera regressionslinjerna till aktivitet ansats i minst 5 dagar före och 5 dagar efter ljuset puls. Beräkna skillnaden mellan dessa två regressionslinjer att bestämma storleken på fasförskjutning. (Figur 4)

5. Representativa resultat

När du tittar på ratten kör register, bör du räkna med att se flera timmars kontinuerlig drift i varje mus. Eftersom möss är nattdjur, kommer detta att köra, eller aktiva fasen, korrelera med den mörka period i närvaro av en ljus / mörker-cykel. Möss lösspringande i ständig villkor kommer också att ha denna begränsade period av ihållande aktivitet som representerar den aktiva fasen av deras fria fungerande rytm. I konstant mörker kommer detta att vara kortare än 24 timmar och i konstant ljus,mer än 24 timmar. Administrering av en 15-minuters 1000lux ljuspuls 4 timmar efter starten av verksamheten (CT16) kommer att leda till fördröjd aktivitet insättande effekt på de dagar efter detta ljus puls.

Figur 1: Representativa ljus spektrum A.. Ljuset spektrum produceras av solen är bred och relativt objektiva mellan 400nm och 700 nm, vilket är den visuella delen av ljusspektrum. B. spektrum av en glödlampa toppar i det infraröda området, vilket leder till dess röda partiskhet, med låg intensitet i det blå området. C. Den typiska fluorescerande lampa, består av diskreta toppar av ljus som kommer att visas "vita" för ögat. D. Men dagsljus lysrör har högre brett spektrum och diskreta toppar frekvens. Resultatet är en ljuskälla som inte är lika varmt som en glödlampa men har ett bredare spektrum än en genomsnittlig lysrör.

Figur 2: Circadian photoentrainment. Den actogram är ett diagram av aktivitet från en enda mus där dagar i följd plottas på y-axeln och tiden är plottas på x-axeln. De svarta staplarna representerar antal hjulens varvtal, och bakgrunden är skuggade för att ge en indikation på ljus / mörker-cykel. De dagar 1-8, är musen inrymt i ett 12:12 ljus: mörker-cykel. Under denna tid börjar musen körs med förskjutningen av ljus och konsoliderar sin verksamhet till den mörka fasen. Under den ljusa fasen är verksamheten minimalt. På dag 9, är belysningen stängs av lämnar musen i konstant mörker. Utan en lätt cykel, finns det inget bidrag till dygnsrytm klocka, vilket resulterar i klockan att köra på den endogena tid. Som ni ser, börjar aktiviteten tidigare varje dag en indikation på att den endogena klocka av detta djur är mindre än 24 timmar.

Figur 3: Re-ångan. Re-Entrainment paradigm innebär skiftande ljuset cykeln antingen framåt eller bakåt tvinga dygnsrytm klocka att anpassa sig till det nya ljuset cykeln. I detta exempel är cykeln avancerade 6 timmar på dag 9 och sedan försenat 6 timmar på dag 20. I båda fall är flera dagar som krävs för full igen ångan, men beroende på rörelsens riktning effekten är mer uttalad i antingen början eller offset tid.

Figur 4: dygnsrytmen flyttas som svar på korta pulser av ljus. A. djur som förvaras i ständigt mörker fritt köra med en kortare tid än 24 timmar. Dag 8, är en 15-minuters 1000-lux ljuspuls ges 4 timmar efter starten av verksamheten (CT16). På de följande dagarna, är ett skifte i aktivitet tillslagstiden iakttas. Fasförskjutningen är skillnaden i djurets förutspådde tillslagstiden (bestämt från deras verksamhet före ljuset puls) och den tid som de faktiskt börjar körs på dagarna efter ljuset puls.
B. fasen responskurva för möss visar mängden och riktningen av förändring som kommer att uppstå som svar på en kort ljuspuls på specifika dygnsrytm tider. En lätt puls under subjektiva dagen (CT0-12) kan inte framkalla en betydande förskjutning, kallad den döda zonen. Från CT12-19, kan en fasförskjutningen förmås med topp försening uppstå som svar på en ljuspuls på CT16. Mellan CT 19 och 24 Verksamheten kommer också att rytmen förskott som svar på en ljuspuls med toppen förskott uppstå som svar på en ljuspuls på CT20.

Figur 5: Wheel-kör aktiviteten hämmas eller maskeras som svar på en ljuspuls på natten. I detta exempel är ljuset cykeln 16h ljus: 8h mörka och konsoliderar verksamheten. En 3-timmars ljus puls börjar 2 timmar efter att ljuset släcks på dag 4. Under denna tid, det finns lite att ingen hjul kör aktiviteten visar förmåga ljus för att direkt hämma aktivitet. Aktivitet återupptas efter ljuset puls.

Figur 6: T7 ljus cykel används för att utsätta möss till ljuspulser hela dygnsrytm cykel. Den T7 cykel består av 3,5 timmars ljus följt av 3,5 timmars mörker. I denna cykel kommer möss hålla en dygnsrytm, men de kommer också att visa maskering av hjulet körs aktivitet under ljuspulser. Mängden aktivitet under ljuset kan jämföras med den mängd av aktivitet under den mörka för ett mått av maskering som inte är påverkade av den dygnsrytm tiden.

Figur 7: Period förlängning i konstant ljus

Discussion

Dygnsrytmen har mätts och registrerats i olika organismer genom historien. Medan vi har just beskrivit metoden för att registrera aktiviteten rytmer i möss, kan denna metod lätt ändras för att mäta rytmer i andra gnagare som hamstrar och råttor, som ofta används i dygnsrytm studier. Kommer dock freerunning perioden och tid att åter STIGA PÅ TÅG i andra organismer varierar. Till exempel är det freerunning perioden av en hamster i konstant mörker 24,0 timmar, medan i möss det är mindre än 24 timmar. I den omständigheten, att du arbetar i en organism, som inte är lämplig för hjul kör aktivitet kan många av samma ljus paradigm användas, dock en olika fysiologiska rytm bör studeras. Den mest liknande åtgärd är generell aktivitet. Hos människor, apor och hundar, forskare använder ofta actigraphy, som mäter mängden rörelse den enskilde. Hos människa är kroppstemperatur och utsöndring av melatonin också ofta mätas och har båda visat sig ha en dygnsrytm, som kan fasförskjutningen och kunna re-STIGA PÅ TÅG ^{15, 16.}

Medan vi tänker på dessa fysiologiska rytmer som diskreta händelser, de är ganska sammankopplade. Verksamheten rytm ett djur kan vara nära överdrog med kroppstemperatur rytm och är inversen av en sömn rytm. Dessutom liknar utsöndring av melatonin som ofta används som en markör för dygnsrytmen fas, nära den normala sömn rytm hos människor. Eftersom dessa cykler är så sammanvävda, kan studiet av en information och förutse resultaten av andra. Till exempel var NPAS2 muterade möss, som visade kontinuerlig hjulet igång verksamheten även på den mörka delen av en ljus mörker-cykel, som senare undersöktes för sömn defekter ^17. Dessa möss visade att sova mindre totalt sett, med minskningen sker under den mörka fasen, den normala "tupplur tid".

Hjul kör aktiviteten ger en relativt icke-invasiv metod för att undersöka dygnsrytm. Det paradigm som beskrivs ovan kan användas för att slutföra en detaljerad analys av dygnsrytm beteende. Dessutom kan paradigm som photoentrainment och bostäder i konstant mörker användas för att som en första kartläggning av dygnsrytm fenotyper innan mer koncentrerad forskning som sover analys.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics