사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

Biology
 

Summary

24hpf에서 zebrafish otocyst에 직접 morpholinos를 전달하는 방법이 개발되었습니다. 귀의 소포 및 침투력을 효과 electroporation의 루멘에 morpholinos의 microinjection을 사용하여, 우리는 두뇌에 morpholinos의 효과를 무시하고 내이 (内耳)에 특정 효과를 얻을 수 있었다.

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Holmes, K. E., Wyatt, M. J., Shen, Y., Thompson, D. A., Barald, K. F. Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (47), e2466, doi:10.3791/2466 (2011).

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Abstract

최근에는 electroporation은 눈, 뇌 및 zebrafish의 somites 등 다양한 조직로 DNA, RNA, 그리고 morpholinos의 생체내 transfection에 대한 인기가 기술되고있다. 유전자 조작의 다른 방법 이상의 electroporation의 장점은 특정 조직은 전류의 응용 프로그램에 의해 macromolecules의 도입을 위해, 두 공간과 temporally, 타겟이 될 수있다는 것입니다. 여기서 우리는 zebrafish의 개발 내이 (内耳)의 조직에 MIFMIF 같은 morpholinos를 transfecting위한 electroporation의 사용을 설명합니다. 과거 연구에서는 MIF morpholino은 1 배아에 주입 - 8 세포 단계에 확산 형태학의 신경계 및 안구의 변화뿐만 아니라 귀에 결과. 개발 나중 단계에서 내이 (内耳)의 조직을 대상으로하여, 우리는 다른 조직의 영향에서 발생할 수 있습니다 보조 효과를 반대로 개발 내이 (内耳)에서 MIF의 주요 효과를 확인할 수 있습니다. 뉴런,의 연결을 처리하고, 사후 망막의 황반과 관련된 세포의 형태를 연구 얼룩 phalloidin 및 acetylated tubulin을 사용함으로써, 우리는 zebrafish 내이 (内耳)에서 타겟으로 transfection을위한 방법으로 electroporation의 효능을 평가할 수 있었다. 24hpf 배아의 귀의 vesicles는 morpholinos와 electroporated로 주입되었고 그 어떤 치료를받은 적이 없음 또는 유일한 주입 또는 electroporated 있었다 배아에 비해했다. 주입 및 electroporated했다 공룡의 태아가 머리 셀 번호의 감소를 보여주 statoacoustic 신경절 (SAG)과 통제 그룹에 비해 적은 세그 뉴런에 의해 innervation을 감소. 결과는 나중 단계에서 otocysts에 morpholinos의 직접 배달은 불특정 신경계와 1-8 세포 단계에서 제공 morpholinos의 신경 크레스트 효과를 피할 것으로 나타났다. 또한 허용하는 내이 (内耳)와 뇌, 신경 문장 또는 periotic mesenchyme에 기본 효과의 귀가 아닌 보조 효과로 이동 효과 시험.

Protocol

1. Electroporation에 대한 전극 만들기

  1. 적당한 길이의 75 μm의 직경의 텅스텐 와이어를 (AM 시스템즈 Carlsborg, WA) (약 3-5센티미터) 컷
  2. molex 케이블 커넥터 (핀 스탬프 황동)를 통해 텅스텐 와이어를 넣어
  3. 랩 텅스텐 와이어 및 축소 튜브 (SPC 기술, 시카고, 일리노이)와 와이어로 축소 튜브를 밀봉하기 위해 알콜 램프 또는 열 총을 들고 열을 적용과 molex 케이블 커넥터
  4. 텅스텐 와이어의 팁을 선명하게하려면, 1.0 N의 수산화 나트륨에 와이어를 찍어 (콘라드 외. 1993)하고, 다른 전극으로 종이 클립을 사용하여, 스퀘어 웨이브 Electroporator와 와이어를 전해하다. 우리가 사용하는 조건은 펄스 사이에 50 MS 각 지속적인 100 MS 5 50 볼트 펄스입니다. 전극은 15-20 μm의의 직경을 날카롭게한다
  5. electroporation에 사용하기 전에 모델링 흙으로 눌러 홈 이내 트레이에서 전선을 유지

2. Electroporation 스테이션 설정

  1. 테이프 micromanipulators (세계 정밀 장비)에 75μm 텅스텐 전극을 날카롭게.
  2. 해부 현미경 스테이지 (Leica)의 양쪽에 플레이스 micromanipulators.
  3. 보호 뀨이 - 21 수정 스퀘어 웨이브 Electroporator (그림 1)에 전극을 연결합니다.
  4. electroporator 켜고 전압, 펄스 기간, 그리고 펄스의 수를 포함하여 electroporation에 대한 매개 변수를 설정합니다. 이 실험에 대한 가장 효과적인 매개 변수는 각 각 펄스 사이에 100ms와 5.0ms 동안 지속 세 13 볼트 펄스로 발견되었다. electroporation은 배아에서 공기 방울을 만드는 경우, 펄스 길이를 줄일 수 있습니다.

3. Zebrafish 귀의 소포으로 Morpholinos의 Microinjection

  1. 번식 탱크에서 수확 zebrafish의 배아. 에서 배아를 품어 배아 육아 ° C 하룻밤 28.5에서 0.3 PPM 메틸렌 블루 (웨스 터, 2005)와 매체를.
  2. 서터 P - 97 전극 풀러와 유리 바늘을 당겨
  3. 37 아가로 오스 겔 기지 (10mm 페트리 접시에 생선 물 1퍼센트 아가로 오스) 워밍업 ° C 물 목욕으로
  4. 생선 물 열 1% 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMPA)까지 녹아 및 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻하게 유지.
  5. morpholino 솔루션 (GeneTools, 코르 발리스, OR)와 유리 바늘을 작성하고 적절한 직경에 대한 제보를 잘라. micromanipulator (쿤)에 주사 바늘을 탑재합니다.
  6. 약 10 μm의에 바늘 끝부분을 잘라 끝 morpholino 솔루션의 충분한 공급을 허용하도록 미네랄 오일에 주입.
  7. 24 시간 postfertilization (HPF)에서 배아를 Dechorinate 및 0.3 PPM의 메틸렌 블루 피시 물에 MS222 (tricaine, 시그마)으로 그들을 마취.
  8. 편리 유니폼을 분석 오른쪽 위로와 아가로 오스 겔베이스에 3-5 anesthetized 배아 정렬
  9. 각각의 배아 이상 1 % LMPA 1 ~ 2 방울을 넣어 보자 자리에서 배아를 해결하기 위해 응고
  10. 귀의 소포가 오른쪽에 있도록 페트리 접시를 회전
  11. 귀의 소포의 루멘에 바늘을 놓고 부착된 질소 탱크 (그림 2)와 PV820 공압 PicoPump (세계 정밀 악기)와 morpholino 솔루션을 주입

4. Electroporation 절차

  1. 즉시 주사 후 electroporation 역에 탑재된 배아를 이동
  2. 귀의 소포 단 후부 조직에 긍정적인 전극을 플레이스하지만, 침투하지 마십시오 귀의 소포로 단지 앞쪽에 두뇌에 부정적인 전극을 삽입
  3. 발 페달이나 스위치를 눌러서을 사용하여 현재 적용합니다.
  4. 아가로 오스의 물고기 물을 붓고하고 소용돌이와 유리 피펫와 아가로 오스의 배아를 제거합니다. 배아를 손상하지 않도록주의하시기 바랍니다. 제거하기 어려운 배아 들어, 부드럽게 배아를 둘러싼 모든 LMPA 멀리 휴식하기 위해 바늘을 사용합니다.
  5. 메틸렌 블루 피시 물 및 분석을위한 원하는 단계 (현장 하이브리드화 등 및 미세한 anlaysis에 immunohistochemical, 형태학의)에 배아를 높이와 함께 접시에 장소 배아.

5. 대표 결과 :

그림 1
그림 1. Electroporation 역. 전극 날카롭게 75μm 텅스텐 와이어를 사용하여 만든 보호 뀨이 - 21 수정 스퀘어 웨이브 Electroporator로 연결로 연결되어 있었다. 이 전극은 micromanipulators이 테이프로 붙여져 있었다.

그림 2
그림 2. 사출 역. 모든 배아는 표준화 목적으로 오른쪽 귀에 주입했다.

그림 3
3 DPF의 배아와 굴지의 필라멘트의 그림 3. Phalloidin의 얼룩. (A) 3 DPF의 배아 injecte제어 MO와 D는 사후 망막의 황반 (PM)에 phalloidin 강한 얼룩이 있습니다. (B) 제어 MO로 주입 후 electroporated되었다 난자는 주사에만 배아에서 오후 phalloidin의 얼룩 비슷한 수준을했다. electroporation와 함께 MIF 수법의 살인인의 주입은시 (D)에서 phalloidin의 얼룩의 극적인 감소가 발생하면서 (C) 혼자 귀의 소포로 MIF 수법의 살인인과 사출이 phalloidin의 얼룩의 감소가 발생하지 않았다. 오전, 앞쪽에 망막의 황반.

그림 4
그림 4 5. DPF의 애벌레와 굴지의 필라멘트의 Phalloidin의 얼룩. 이 주사 사이에 차이는 없었다 (A) 및 표준 제어 morpholino가 (B) 사용되었다 electroporation와 함께 주입. 그러나, MIF morpholinos와 electroporated로 주입되었다 5 DPF의 애벌레는 MIF morpholinos (C를 주사 맞은 배 (胚)에 비해 3 DPF 이상하지만 덜 극적인 뒷부분 망막의 황반 (PM) (D)에서 phalloidin의 얼룩을 감소했다 ). 오전, 앞쪽에 망막의 황반.

그림 5
그림 5. 3 DPF에서 배아의 Acetylated tubulin의 얼룩. (A)의 배 (胚)는 주사 또는 electroporation을받지 못했습니다. (B)의 배 (胚)는 electroporated하지만 주사를받지 않았다. MIF morpholinos와 함께 주입하여 electroporation (C, D)를 모두받을 수 배아 컨트롤에 비해 가시 감소 tubulin의 얼룩을했다. (PM, 사후 망막의 황반).

그림 6
그림 6. 컨트롤 morpholino 3 DPF에서 배아의 Acetylated tubulin의 얼룩. (A) 어떠한 치료를하지 않고 난자는 사후 망막의 황반 (PM)와 광범위한 innervation에 강한 acetylated tubulin의 얼룩을 보여주었다. (B) 난자는 제어 morpholino 주사. (C) 난자는 오직 electroporation과 치료. (D) 주입 및 제어 electroporated morpholino와 컨트롤 난자는 치료없이 컨트롤에 비해 뒷부분 망막의 황반과 innervation의 acetylated tubulin 비슷한 수준을했다.

Discussion

우리는 성공적으로 24 HPF의 zebrafish 배아의 귀에에 안티 센스 oligonucleotide의 수법의 살인인를 도입했습니다. 분사와 electroporation 이후 자랐던 공룡의 태아가 가능한되었습니다. 배아의 electroporation에서 살아남는다면, 그들은 치료뿐만 아니라 전용 주입에만 electroporated 있었다 배아 있었다 배아를받은 적이 없음 배아에 비해 정상적인 속도로 증가했다.

우리는 phalloidin과 acetylated tubulin과 라벨을 통해 귀 분사와 electroporation 후 MIFMIF 같은 수법의 살인인의 효과를 관찰했다. 뒷부분 망막의 황반의 감각 세포에있는 굴지의 필라멘트의 Phalloidin의 얼룩은 수법의 살인인로 주입되었다 배아에 비해 머리카락 세포 및 / 또는 stereocilia 번호의 변화를 일으킨 MIF와 24 HPF 단계에서 MIF와 같은 MO의 electroporation을 나타냅니다 (그림 3). 헤어 셀 번호에있는이 감소는 쉔 외의 결과와 일치합니다. (제출) MIFMIF처럼하는 수법의 살인인 걸 saccular 망막의 황반에있는 세포의 수를 감소의 원인이되는. 그 electroporation을 설명 수법의 살인인 및 electroporated로 주입되었다 태아의 머리 세포 숫자의 감소함으로써 귀의 소포에만 주입어진 배아에 비해 형태학의 효과의 범위를 증가, 세포막에 걸쳐 수법의 살인인 이동에 도움이됩니다. statoacoustic 신경절의 형태의 변경은 acetylated tubulin의 얼룩을 통해 관찰했다. statoacoustic 신경절에 의해 innervation의 범위는 주입과 공연이 neurites (그림 5)의 분기 감소 electroporated되었습니다 배아으로 영향을했습니다. acetylated tubulin의 얼룩이 크게 주입하고 electroporated 있었다 모두 배아 감소하기 때문에 또한, ganglionic 세포 및 / 또는 신경절 세포의 감소 번호 결로가 발생 감소있을 수 있습니다. MIF는 신경 시스템 개발 (스즈키 외., 2004)에 중요한 것으로 표시 되었기 때문에, electroporation 후 본 변경 사항은 MIFMIF 같은 neuroblast 세포에 MO 솔루션입니다. 증가 transfection 결과 수 있습니다

직접 개발 조직으로 안티 센스 oligo morpholinos의 Electroporation은 배아에서 조직 개발하는 동안 유전자 모두 공간과 temporally의 표현을 제어하기위한 유용한 도구입니다. MIF와 내이 (内耳)의 조직에 수법의 살인인 MIF처럼의 Electroporation은 사후 망막의 황반과 statoacoustic 신경절 모두 비정상적인 형태의 결과. 어느에만 주사 또는 유일한 electroporated했다 배아 또는 전혀 치료를받은 적이 없음 배아에 비해 주입하고 electroporated 있던 태아의 사후 망막의 황반에있는 감각 세포의 수가 감소가 발생했습니다. statoacoustic 신경절 및 SAG의 크기에 의해 사후 감각 패치 innervation의 정도에 감소도 발생했습니다. Electroporation 원하는 조직에서 특정 DNA, RNA, 또는 MO의 주요 효과를 관찰하고 다른 조직에있는 보조 효과에서 이들을 차별, 뇌, 신경 문장을 포함하여의 이익과 특정 조직에 macromolecules를 transfecting위한 가치있는 방법입니다 내이 (内耳)의 개발에 periotic mesenchyme (Barald와 켈리, 2004).

Disclosures

문서의 생산은 비디오와 텍스트에 언급된 시약을 생산 유전자 도구, LLC에 의해 후원되었다.

Acknowledgements

이 작품은 KFB에 난청 연구 재단에서 YC S 및 NSF (IOS 0,930,096)를 부여 지원했다.
KFB : NIH / NINDCD이 RO1 DC04184, 3R01DC004184 - 08W1 , NSF DBI 0,832,862, NSF IOS 0,930,096

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Sutter P-97 electrode puller Equipment
PV820 Pneumatic PicoPump Equipment World Precision Instruments, Inc.
M3301L Manual Micromanipulator Equipment World Precision Instruments, Inc.
Leica S6D stereomicroscope Equipment
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator Equipment
Olympus FV500 confocal microscope Equipment
0.01 inch Platinum Wire Supply A-M Systems 711000
Shrink Tubing Supply Newark Inc 03F3172
Socket Crimp Terminal Supply Digi-Key 82PECT-ND
Capillaries Supply Stoelting Co. 50613
Modeling clay Supply
Plastic 100 mm Petri dishes Supply Falcon BD
6 well plastic plates Supply Falcon BD
  1. MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
    Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5’-acatcggcatgactgcgacagagat-3’. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5’-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3’, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5’-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3’. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3’.
  2. methylene blue (0.3 ppm) in fish water
  3. MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
  4. Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
  5. phenol red (Sigma)
  6. Anti-acetylated tubulin (Sigma)
  7. Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
  8. Texas red-phalloidin (Molecular probes)

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References

  1. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
  2. Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
  3. Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).

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