마우스의 전통 NASA Hindlimb 하역 모델 Alternant 방법

Biology
 

Summary

우리는 생쥐에서 모델을 하역 alternant hindlimb을 개발했습니다. 종래의 모리 - 홀턴 꼬리 - 견인 기술을 통해 우리 hindlimb 하역 테일 링 방식의 주요 장점은 동물에 스트레스를 최소화하는 간단한 간단한 절차입니다.

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Ferreira, J. A., Crissey, J. M., Brown, M. An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice. J. Vis. Exp. (49), e2467, doi:10.3791/2467 (2011).

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Abstract

모리 - 홀턴 hindlimb 하역 (HU) 메소드는 널리 인정 국립 항공 우주국 (NASA) 설치류 4-6으로 쓰지 않음 - 위축을 공부를위한 지상 기반의 모델입니다. 우리의 연구는 생쥐의 황금 표준 모리 - 홀턴 HU 꼬리 - 견인 기술로 alternant 방법을 평가했다. 피프티 개 여성 생쥐 (4-8 모.) 14 일 동안 HU (n은 = 34) 또는 28일 (n은 = 20)했다. HU에서 복구 HU (n은 = 22) 다음과 같은 일반적인 케이지 ambulation 3 일 후에 평가되었다. 세 일치하는 생쥐 (N = 76) 무게 - 베어링 컨트롤을 역임했습니다.

이전 HU에 꼬리 반지는 5 일, 6 또는 7 간 척추 디스크 공간 통과하고 생쥐가 일시 중지되었습니다하는 고리 모양으로되었다 2-0 살균 수술 강철 와이어로 형성되었다. 꼬리 링을위한 척추 위치를 적절하게 깨끗하게 함 방해하지 않고 동물의 체중의 균형을 위해 선택되었다.

우리는 HU, soleus 위축의 정도, 그리고 부신 대량 다음 HU 전후의 체중을 평가하여이 소설 HU 기술의 성공을 결정. 이전 HU (24.3 ± 2.9g)에 쥐의 체중은 크게 (24.0 ± 1.8g) HU의 14d (22.7 ± 1.9g), HU의 28d (21.3 + 2.1g) 후 3 일 복구 직후 감소하지 않았 . Soleus 근육 질량은 크게 각각 십사일 28 일 동안 HU (P는 <0.001) 다음 (-39.1 %, -46.6 및 %) 감소했다. 복구 soleus의 질량에 따라 3 일 크게 제어 값의 74 %로 증가했다. HU 마우스의 부신 체중 조절 마우스에 비해 다양한되지 않았습니다.

우리 소설 HU 방법의 성공은 기대 문학 값에 해당 HU, 2, 7, 8 다음 동물 체중, 비교 ​​부신의 무게와 soleus 위축의 유지 보수에 의해 입증됩니다. 이 HU 방법의 주요 장점은 다음과 같습니다 서스펜션 동안 꼬리 시험 1) 용이성, 2) 자주 꼬리 - 찍어 HU와 관찰 청색증, 염증, 및 / 또는 괴사성 꼬리의 가능성을 감소, 3) 마우스의 가능성은 견인을 씹는 없습니다 테이프 및 정지 장치 나오는, 바로 HU 후 4) 신속한 복구 및 정상 케이지 활동.

Protocol

사전 외과 악기 / 재료

  • 와이어 커터 / 플라이어
  • 거즈 2 X 2 "패드에게
  • 손난로
  • 실버 질산 스틱
  • 무균 수술 장갑
  • Isoflurane 흡입 마취
  • Chlorhexidine 글루 콘 산 4퍼센트 (살균 외과 스크럽)
  • 무균 2-0 외과 강철 봉합
  • 25 X 8분의 5 게이지 바늘 (Autoclaved)
  • Hemostat (Autoclaved)
  • 서지컬 스틸 봉합

수술 절차

  1. 멸균 필드를 만듭니다. 멸균 절차를 따르십시오.
  2. 2 마우스를 마취 - 3퍼센트 isoflurane.
  3. 가열 패드에서 마우스를 놓으십시오.
  4. Chlorhexidine 솔루션 꼬리 스크럽.
  5. 찾아 5, 6, 또는 7 척추 공간 (꼬리 두 뼈가 충돌 사이에, 꼬리의 기지에서 체모의 끝에서부터 시작).
  6. 척추 공간으로, Hemostat 두 번 척추 사이의 파일럿 구멍을 만들기 위해 25G 바늘을 사용합니다.
  7. 10cm 길이 철강 봉합사를 잘라 절단기를 사용하십시오.
  8. 바늘을 제거하고 꼬리 중 하나를 끝에 구멍, 봉합의 5cm를 통해 철강 치료를 삽입합니다.
  9. 꼬리의 각 측면 봉합의 + 5cm 있어야합니다.
  10. 꼬리에 플레이스 엄지 팁.
  11. 무료 손을 사용하여 철강 봉합을 바람이 네 손가락의 끝에와 큰 루프를 형성하기 위해 끝을 비틀어. 상처 또는 원형 부분은 길이 + 3mm해야합니다.
  12. 엄지를 제거합니다.
  13. hemostat과 봉합 한 가닥을 고정하고 작은 루프, 원래 큰 루프의 꼬임에 최대한 부착되는의 끝 부분에 반지를 다스릴.
  14. 초과 와이어 잘라, 그리고 트위스트 전선을 뒤로 구부 러.
  15. 초과 출혈이있다면, 당신은 은색 질산염 스틱으로 중지할 수 있습니다.
  16. 이전 hindlimb 하역하는 5~7일에 대한 복구 단일 집 케이지에서 isoflurane과 장소 마우스를 끕니다. 하나 이상의 마우스가 함께 보관되어있다면 꼬리 고리가 뒤엉키다.

1. Hindlimb 하역 절차

자료

  • 사이즈 10-24은 X 4 기계 나사, 동물 하나씩.
  • 나일론 잠금 너트 사이즈 10-24, 동물 하나씩.
  • 윙 너트 사이즈 10 X 24, 동물마다 둘.
  • 와셔의 크기 ¼ X 1, 동물마다 둘.
  • 스냅 후크 크기 # 6, 1-11/16 "하나마다 동물과 함께 낚시 스위블.
  • 보빈 금속 재봉틀. 하나마다 동물.
  • S - 모양의 후크에 대한 작은 종이 클립, 동물 당 한
  • 펜치.
  • 2 X 2 "거즈.
  • 2 "검은 종이 바인더 클램프.
  • 덕트 테이프 / 실험실 테이프.
  • 약간은 새장의 전체 길이 초과 1-3/8 "도금 홈 붙이 스틸 바
  • 50cm X 40cm X 20cm 케이지 (쥐 케이지).
  • bended 튜브와 물통.
  • 스테인레스 스틸 와이어, 물통을 지원하는 U - 모양.

케이지 설치

  1. 덕트 테이프와 temporally 다운 1-38 "도금 홈 붙이 강철 새장의 맨 위에 바, 테이프를 놓는다.
  2. 기계 나사 1 꼴통을 나사, 와셔를 삽입하고, 기계 나사 트러프에게 홈 붙이 강판 ± 케이지의 가장자리에서 15cm를 삽입합니다.
  3. 다른 세탁기와 꼴통을 추가합니다. 날개 너트를 모두 조여지만, 나중에 조정을 할 필요하므로 완전히 조여하지 않습니다.
  4. 보빈의 중앙 구멍을 통해 기계의 나사를 삽입합니다.
  5. 떨어지에서 보빈을 방지하기 위해, 기계 나사의 끝 부분에 나일론 잠금 너트를 나사. 보빈 자유롭게 회전해야합니다.
  6. 보빈의 하단 부분을 통해 어업 회전에서 스냅 후크를 삽입합니다.
  7. 클립에서 S - 모양의 후크를 형성 펜치를 사용합니다. (후크를 형성하기 위해 종이 클립에서 2cm 잘라).
  8. 낚시 회전의 구멍을 통해 S - 모양의 후크의 한쪽 끝을 삽입하고 펜치로 종료 핀치.
  9. 케이지 측면의 내부에있는 기계 나사에 병렬 U - 모양의 와이어를, 장소, 전체 물통을 지원하기 위해 다시 끝을 구부.
  10. 스피켓가 다운 마주하지만 바닥을 건드리지 마와 U - 모양의 와이어에 물통을 넣습니다.
  11. 이것은 음식을 분쇄에서 클램프의 힘을 방지, 또는 아래로 클램핑되도록 그들이 가까이 차단할 수가 없어. 그 밖에 떨어지지 않고 거기에 음식을 3-4 조각을 보유하는 정도죠 긴장., 2 "바인더 클램프 오픈 벤드 마우스 코.
  12. 바인더 클램프에 설치류 차우의 4 조각 장소 3.

마우스 Hindlimb 내리기

  1. 꼬리 반지의 작은 링을 통해 S - 모양의 후크의 열린 끝을 넣습니다.
  2. 기계 나사의 낮은 날개 너트를 강화하거나 느슨해진하여 마우스의 높이를 조정합니다. 하반신은 체중 베어링해서는 안됩니다. 일단 최적의 높이는 상부 날개 너트를 조여 이루어진다.
  3. 마우스는 hindlimbs와 스피켓에 올라갈 수 있도록 물통 및 U - 모양의 와이어를 재지정. 덕트 테이프와 함께 새장 측면에 물통을 고정합니다.
  4. 마우스가에 올라갈 수 있도록 새장 바닥에 음식과 함께 바인더 클램프 위치를, 테이프로 테이프를 내려.
  5. 하나 이상의 동물이 hindlimb 새장 반대편에 언로 드하는 경우 동일한 절차를 반복합니다. 하우스 케이지마다 짐승 같은 두, 공간이 동물들은 거의 서로를 만질 수 있도록.
  6. 느슨하게 물고기 회전에 마우스의 꼬리를 정리하고 2 X 2 거즈를 사용합니다. 꼬리에 거즈를 확보, 거즈 주위에 포장 테이프의 작은 조각을 사용합니다. 이 단계는 꼬리의 끝부분과 괴사되고 그 꼬리에 풀링 혈액에 이르는, 아래 쳐지고에서 꼬리를 방지하는 것이 중요합니다.
  7. 케이지에 코브 침구의 작은 금액을 추가합니다. 마우스 침구와 침구에 hindlimbs를로드 시도의 마운드에서합니다 그렇지 않으면 너무 많은 침구를 추가하지 마십시오.

2. 대표 결과 :

꼬리 링 HU 기술의 성공을 구축하기 위해 우리는 꼬리 링 수술 전에 사전과 HU 및 복구 다음과 같은 동물의 체중을 측정, 모든 그룹과 부신 대량, soleus 근육 질량.

실험을 통해 생쥐의 바디 무게는 그림 1에 표시됩니다. 전에 꼬리 링 수술 (24.7 ± 3.5g)에 마우스 바디 가중치가 꼬리 링 수술 (24.3 ± 2.9g) HU하기 전에 회복 5 일 후에 크게 다르지 않아. 또한 체중이 크게 HU 28 일 (21.3 + 2.1g)는 (22.7 ± 1.9g) HU 14 일 후에 즉시 감소 않았거나 HU (24.0 ± 1.8g)부터 3 일 복구 후. 14 28 일 동안 HU 시체 - 대량의 작은 (-6.8 %와 12 %)하지만, 이외의 상당한 손실이 발생하지만, 생쥐가 완전히 복구 3 일 후에 그들의 사전 HU 바디 무게로 회복. 외래 제어 마우스 및 HU 마우스에 대한 식품 소비는 그림 3에 표시됩니다. 평균 일일 식품 섭취량 컨트롤에 비해 28일 이상 HU 마우스에서 다른되지 않았습니다.

우리는 효과적인 HU 절차 (그림 2)을 나타내는 14과 28 일 (-39.1 %, -46.6 %와)에 대한 다음과 같은 중요한 HU soleus 근육 위축을 관찰했다. 또한 위축이 정도 HU 2, 7, 8 2~4주에 대한 예상 문헌 값과 일치합니다. HU soleus 대량의 회복에 따라 3 일 크게 제어 값의 74 %로 증가했다. 복구 그룹에 Soleus 질량은 HU 그룹 모두보다 훨씬 큰했지만, 외래 제어 동물보다 여전히 훨씬 적은.

부신 중량은 동물의 스트레스의 지표로 측정되었다, 왼쪽과 오른쪽 부신 선들은 excised와 무게했다 둘 다. 평균 무게는 제어 및 모든 그룹에서 HU 마우스 마우스 (그림 4)에 대한 비교했다.

이전 쥐에서 우리가 HU의 시작 부분에 동물의 숫자에 대한 성공률은 서스펜션 장치에서 나오는없이 HU를 완료한 동물의 번호 (꼬리 - 견인 테이프를 통해 씹는 동물에 의한)에 비해 것으로 나타났습니다 것만 10 살 12 모리 - 홀턴 기술 1을 사용합니다. 이 연구에서 생쥐들의 없음 (N = 54)도 전에 HU 기간의 완료로 정지에서 내려 온 없습니다. 우리는 그러나 심한 염증이 꼬리를 개발한 쥐 한마리가 있었나요. 염증이 명백한되었을 때, 우리는 염증 지역 치유 수 있도록 꼬리 링을 제거하고, 이후 HU 기간을 완료하는 또 다른 꼬리 - 링을 배치.

그들이 정지 장치 나올 때문에 과거에는 우리가 HU의 모리 - 홀턴 방법을 사용하는 경우, 우리는 일반적으로 1-2 쥐를 / 그룹을 제거합니다. 트레일 - 링 방법을 부주의하게 14 28일 (n은 = 54 생쥐)에 대한 HU의 기간 동안 HU 장치 나오는 생쥐에 대한 에피소드가 없었다.

그림 1
그림 1. 체중 변경 (± SD 평균). 약어 : CON : 체중 베어링 제어 마우스 (n은 = 76); 사전 HU : 이전 HU (n은 = 54)에 대한 모든 마우스, HU14 : 쥐 hindlimb 14 일 (n은 = 34)에 대한 하역, HU28 : 쥐 hindlimb가 언로 드 28일 (n은 = 20); REC : 케이지 수 hindlimb 하역 마우스는 3 일 (n은 = 22)에 대한 복구합니다. 체중에 큰 차이는 집단 간의 관찰되지 않았습니다.

그림 2
그림 2. Soleus 근육의 위축 (± SD 평균). 약어 : CON : 체중 베어링 제어 마우스 (n은 = 76); HU14 : 쥐 hindlimb 14 일 (n은 = 34)에 대한 하역, HU28 : 쥐 hindlimb 28 일 (n은 = 20)의 하역 및 REC : 허용 hindlimb 언로 드 쥐 에 케이지 3 일 (n은 = 22)에 대한 복구합니다. * 무게 - 베어링 제어 (CON)보다 (P <0.001) 훨씬 다릅니다. HU 그룹 모두보다 (P <0.01) δSignificantly 달라.

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그림 3. 식품 소비 (± SD 평균). 무게 - 베어링 및 hindlimb 하역 동안 일일 평균 식품 섭취량 (g / 일). 약어 : 체중 베어링 제어 마우스 (N = 76); HU : 마우스 hindlimb unloaded14 - 28 일. CON 및 HU 그룹 사이에는 큰 차이가 관찰되지 않았다.

그림 4
그림 4. 부신 질량 (± SD 평균). 약어 : CON : 체중 베어링 제어 마우스 (n은 = 76); HU14 : 쥐 hindlimb 14 일 (n은 = 34)에 대한 하역, HU28 : 쥐 hindlimb 28 일 (n은 = 20)의 하역 및 REC : 허용 hindlimb 언로 드 쥐 에 케이지 3 일 (n은 = 22)에 대한 복구합니다. 더 큰 차이는 집단 간의 관찰되지 않았습니다.

Discussion

우리는 매우 성공적인 것으로 판단 hindlimb 하역 생쥐의 대체 방법을 평가했다. 여기에 설명된 꼬리 링 방법은 장기 hindlimb 서스펜션에 사용되었고, 복구 다음 HU를 연구하기 위해 서요. 이러한 조건의 각에서 안정적인 음식 섭취, 신체 중량과 생쥐의 부신 무게에 의해 입증으로 적응 실패의 증거가 없었다. 이 꼬리 링 HU 기술은 수행하는 간단하고 쉽게 아주 작은 수술 연습 포함될 수 있습니다.

전통 모리 - 홀턴 5, 6 방법에 비해 꼬리 링 방식의 몇 가지 장점이 있습니다. 문제는 그것이 정학 기간의 끝에, 그냥 바로 분명하지 발생한다면 첫째, 그 꼬리에있는 피부와 고리 주입 사이트는 항상 볼 수 있습니다. 둘째, 동물은 데이터 집합에서 마우스 또는하지를 유지할지 여부를 결정하기 위해 필요 obviating, HU 동안 언제든지 정지 장치 나갈 수 없습니다. 또한, 마우스는 반지 장치 방해하지 않고 그들이 복구를 위해 HU에서 출시 때, 그들은 HU에 따라 완벽한 복구 단계에 대한 수 있도록, 그들의 꼬리로 조작하지 않습니다. 마지막으로, 꼬리 링 방식 hindlimb 하역 생쥐는 모리 - 홀턴 꼬리 - 견인 기술에 의해 언로 드 쥐 hindlimb보다 자신의 체중을 유지합니다. 우리 손에 HU 14 일 이후 우리는 신체 - 질량에있는 작은 (-6.8 %)하지만, 이외의 상당한 손실을 관찰했다. 잉갈스 외가. 모리 - 홀턴 방법 3 HU 날로부터 14 일 후 마우스의 체중에서 상당한 -12 %의 감소를 관찰 반면. 잉갈스은 부신 무게를 신고하지 못했지만, 우리의 꼬리 링 방법은 마우스 (우리 HU 마우스의 부신 무게가 컨트롤 다를되지 않습니다)과 hindlimb 내리기 기간 동안 체중보다 관리에 덜 스트레스를 수여가 나타납니다.

요약, hindlimb 하역의 꼬리 링 방법 개발, 14 및 28 일 동안 생쥐 HU에서 테스트하고, 생쥐에 대한 HU 후 3 일 동안 케이지 회복으로 반환되었습니다. 부신 무게, 신체 질량 및 식품 섭취량을 바탕으로, 생쥐는 꼬리 링 장치에 잘 적응하도록 나타납니다. 방법을 하역 꼬리 링 hindlimb은 전통 모리 - 홀턴 hindlimb 하역 기술에 대한 유용하고 간단한 대안입니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

저자는 자신의 기술 지원과 동물을 돌보는 위해 앤드류 J 던, 우리 연구실에 탁월한 연구 학부 학생을 감사드립니다. 건강 부여 HD058834와 미주리 생명 과학 원정대의 대학의 국립 연구소는이 작품을 후원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wire cutters/pliers Ace Hardware 84-056
Gauze Fisher Scientific 22-037-901
Heating pad Sunbeam Z-1228-001
Silver nitrate applicators ARZOL 0001-2
Isoflurane,USP Novaplus NDC 0409-3292-49
Chlorhexidine Gluconate 4% Purdue Products L.P. NDC 67618-200-01
Sterile 2-0 surgical steel suture Ethicon Inc. SS-28
25 X 5/8 A gauge needle Terumo Medical Corp. NN 2516R
Hemostat/ needle holder Fine Science Tools 12500-12
Size 10-24 X 4 machine screws Hillman The Fastener Center 90272
Nylon lock nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180141
Wing nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180243
Fender Washer size ¼ X 1 Hillman The Fastener Center 290012
Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” Bass Pro Shop 38-481-554-01
Metal sewing machine bobbin. Singer Instruments 45785
Paper clip Office Depot 221720
2” black paper binder clamps. Office Depot 308957
Scotch Multi-Use Duct Tape Office Depot 790710
1-3/8” Plated slotted steel bar Home Depot 548932 Extends slightly beyond the full length of the cage
50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage Alternative Design Manufacturing RC88D-PC
Water Bottle Alternative Design Manufacturing WB16FS
Stainless Steel wire Small Parts, Inc. SWX-4029 U-shaped wire to support water bottle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
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Comments

2 Comments

  1. Is it possible to apply such a method to rat?
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Christian C.
    March 19, 2013 - 12:22 PM
  2. Yes!!
    We have tried this method in both species and have the same results.

    Reply
    Posted by: Johan F.
    March 19, 2013 - 2:48 PM

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