マウスにおける伝統的な米航空宇宙局(NASA)後肢アンロードモデルへの交代方法

Biology
 

Summary

我々は、マウスでモデルをアンロード交代後肢を開発した。従来のモレ-ホルトンテールトラクション法上の私たちの後肢アンテールリング方式の主な利点は、動物によってストレスを最小限に抑える簡単な簡単な手順です。

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Ferreira, J. A., Crissey, J. M., Brown, M. An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice. J. Vis. Exp. (49), e2467, doi:10.3791/2467 (2011).

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Abstract

モレ-ホルトン後肢アンロード(HU)メソッドは、広く受け入れられている米航空宇宙局(NASA)げっ歯類4-6に廃用-萎縮を研究するための地上ベースのモデルです。我々の研究は、マウスのゴールドスタンダードモレ-ホルトンHUテールトラクションテクニックに交代方式を評価した。 54雌マウスでは、(4-8ヵ月)、14日間HU(N = 34)または28日(N = 20)であった。 HUからの回復は、HU(N = 22)に続く通常のケージの歩行の3日後に評価した。高齢マッチしたマウス(n = 76)は体重を支えるの対照として用いた。

前のHUにテールリングは5 番目 、6 番目 、または7日間脊椎のディスク容量を通過し、マウスが中断されたからリングに成型された2から0滅菌外科用鋼線で形成された。テールリングのための椎体の位置が適切に排便を妨げることなく、動物の体重のバランスをとるために選ばれました。

私たちはHU、ヒラメ筋萎縮の程度、および副腎腫瘤は、次のHUの前後に体重を評価することでこの小説HU技術の成功を決定する。前のHU(24.3 ± 2.9グラム)にマウスの体重は有意に(24.0 ± 1.8グラム)HUの14D(22.7 ± 1.9グラム)、HUの28D(21.3 + 2.1グラム)後、または3日間の回復後すぐに低下していない。ヒラメ筋の質量が大きく、それぞれ14日と28日間のHU(P <0.001)以下の(-39.1%、および-46.6%)減少しました。回復ヒラメ筋の質量の3日間に続いて大幅にコントロール値の74%に増加した。 HUマウスの副腎重量は対照マウスに比べて差は認められなかった。

私たちの小説のHUの方法の成功は予想される文献の値に対応するHU、2、7、8に続く動物の体重、匹敵する副腎の重量、およびヒラメ筋萎縮のメンテナンスにより証明される。このHUの方法の主な利点は次のとおり:1)サスペンションの間にテール検査のしやすされない、2)チアノーゼ、炎症の可能性を減少、および/または頻繁にテールテーピングとHUで観察壊死尾、トラクションを噛むマウスの3)も可能すぐにHU後急速に回復し、通常のケージの活動、4)、テープやサスペンション装置から出てくる。

Protocol

手術前の楽器/材料

  • ワイヤーカッター/プライヤー
  • ガーゼ2 × 2"パッド
  • 暖房パッド
  • 硝酸銀棒
  • 無菌手術用手袋
  • イソフルラン吸入麻酔薬
  • クロルヘキシジングルコン酸4%(防腐剤手術スクラブ)
  • 無菌の2から0外科鋼の縫合
  • 25 × 5 / 8ゲージの針(オートクレーブ)
  • 止血鉗子(オートクレーブ)
  • 外科用鋼製縫合糸

手術の手順

  1. 滅菌フィールドを作成します。滅菌の手順に従ってください。
  2. 2マウスを麻酔 - イソフルラン3%。
  3. 加熱パッド上でマウスを置きます。
  4. クロルヘキシジン溶液を尾をスクラブ。
  5. ケート5、6、または7 番目の椎間腔(尾の2つの骨の突起の間に、尾の基部に、体毛の終わりからカウントを開始)。
  6. 椎間腔に、二つの椎骨の間にパイロットホールを作るために止血剤と25G針を使用してください。
  7. 長さ10cm鋼製縫合糸を切断するワイヤカッターを使用してください。
  8. 針を外し、テールのどちらかの端に、穴を通して縫合糸の5 cmのスチールの縫合糸を挿入します。
  9. 尾の各側面には、縫合糸の+ 5 cmの必要があります。
  10. テールの上に親指の先端を置きます。
  11. 空いている手を使用し、親指の先端に鋼製縫合糸を巻き、大きなループを形成するために両端をねじります。傷または円形の部分は+ 3 mm長でなければなりません。
  12. 親指を削除します。
  13. 止血鉗子で縫合糸の一方の鎖をクランプし、小さなループにそれを曲げる、の最後はオリジナルの大型ル​​ープ上のねじれにできる限り近い添付されます。
  14. 余分なワイヤーを切断し、そしてツイスト線を後ろに曲げる。
  15. 余分な出血がある場合は、硝酸銀の棒でそれを停止することができます。
  16. 前後肢のアンロードに5-7日間回復するために、単一の家のケージにイソフルランと場所でマウスの電源を切ります。複数のマウスが一緒に収容されている場合、テールのリングが絡み合ったなる。

1。後肢アンロードの手順

材料

  • サイズ10-24 X 4本のビス、動物ごとに。
  • ナイロンロックナットサイズ10 - 24、動物ごとに。
  • ウィングナットサイズ10 × 24、動物ごとに2つ。
  • ワッシャーのサイズ¼ X 1、動物ごとに2つ。
  • スナップフックサイズ#6、1-11/16"、と一個の動物との釣りのスイベル。
  • ボビン金属のミシン。ひとつあたりの動物。
  • S字フックの小さなペーパークリップ、動物ごとに
  • プライヤー。
  • 2 × 2"ガーゼ。
  • 2"黒の紙のバインダーのクランプ。
  • ダクトテープ/ラボテープ。
  • 少しケージの完全な長さを超える1-3/8"メッキマイナス棒鋼
  • 50センチメートルX 40センチメートルX 20センチメートルケージ(ラットケージ)。
  • 曲がった管と水のボトル。
  • ステンレス鋼線、水のボトルをサポートするために、U字型。

ケージのセットアップ

  1. ダクトテープで一時的にダウンして1から38"プレート溝スチールケージの上にバー、およびテープを置く。
  2. 機械のネジを1ウィングナットをネジ、ワッシャーを挿入し、ネジの谷の溝付き鋼板±ケージの端から15 cmの挿入。
  3. 別のワッシャーとウィングナットを追加。両方のウィングナットを締めますが、完全にそれが後で調整を行うために必要になるので、締めしないでください。
  4. ボビンの中央の穴から機械のネジを挿入します。
  5. 落下ボビンを防ぐために、機械のネジの端にナイロンロックナットをねじ込みます。ボビンは、自由に回転さしてください。
  6. ボビンの下部を通して釣りスイベルからスナップフックを挿入します。
  7. クリップからS字状のフックを形成するためにペンチを使用してください。 (フックを形成するためにペーパークリップから2cmをカット)。
  8. 釣りのスイベルの穴からS字フックの一端を挿入し、ペンチでシャットダウンそれをつまんで。
  9. ケージの側面の内側にあるマシンのネジと平行にU字型のワイヤーを、置き、そして完全な水のボトルをサポートするバックエンドを曲げる。
  10. spicketが下向きですが、底に触れていないと、U字型ワイヤーに水の入ったペットボトルを挿入します。
  11. 曲げ2"バインダーは、彼らが近くにシャットダウンしないことができるように、オープンクランプ。それは落ちることなく、その中に食品の3〜4個を保持するだけで十分なテンションが、これは食物を破砕からクランプの力を防ぐ、または弾圧されマウスの鼻。
  12. バインダーのクランプに齧歯類固形飼料の4個の場所3。

マウスの後肢のアンロード

  1. テールのリングの小さいリングを介してS字状のフックの開放端を挿入します。
  2. 小ねじの下側ウィングナットを締めたり、緩めて、マウスの高さを調整します。下肢は、体重負荷であってはならない。一度最適な高さは、上翼のナットを締めて実現されます。
  3. マウスが後肢でspicketに登ることができないように水のボトル、およびU字型の線の位置を変更。ケージの側面にダクトテープで水のボトルを固定します。
  4. マウスがその上に登ることができないようにケージの底の上に食べ物とバインダーのクランプを置き、ダクトテープとテープをダウン。
  5. 複数の動物が後肢ケージの反対側にアンロードされた場合と同じ手順を繰り返します。ハウスケージごとに2つの動物、宇宙動物を彼らはほとんどお互いに触れることができるように。
  6. 緩く魚のスイベルにマウスの尾をラップする2 × 2ガーゼを使用してください。尾にガーゼを固定し、ガーゼを包むテープの小片を使用してください。このステップでは、血尾の先端にプーリングし、その尾が壊死になることにつながる、下方に垂下から尾を防ぐために重要です。
  7. ケージにcobの寝具の少量を追加。あまりにも多くの寝具そうでなければ、マウスは寝具との試みのマウンドから寝具に後肢をロードする予定を追加しないでください。

2。代表的な結果:

テールリングHUの技術の成功を確立するために、我々は尾輪の手術の前に、と前にとHUと復旧後、動物の体重を測定し、すべてのグループおよび副腎腫瘤、ヒラメ筋の質量。

実験を通して、マウスの体重を図1に示されています。前のテールリング手術(24.7 ± 3.5グラム)にマウスの体重は、HUの前に尾輪の手術(24.3 ± 2.9グラム)からの回復の5日後に有意差は認められなかった。も体重が大幅に、HUの14日間(22.7 ± 1.9グラム)の直後に辞退HUの28日間(21.3 + 2.1グラム)またはHU(24.0 ± 1.8グラム)から3日間の回復後でした。 14および28日間のHUは、体格の小さい(-6.8%と12%)が、非重大な損失をもたらしたが、マウスは完全に回復の3日後にプレHUの体重まで回復した。外来コントロールマウスとHUのマウスの摂餌量を図3に示されています。平均毎日の食物摂取量はコントロールと比較して28日間HUのマウスでは差がなかった。

我々は効果的HUの手順(図2)を示す14および28日(-39.1%、および-46.6%)のためのHU以下のかなりのヒラメ筋の萎縮を観察した。さらに萎縮のこの度はHU 2、7、8の2〜4週間の予想文献値と一致している。 HUヒラメ筋の質量からの回復の3日間に続いて大幅にコントロール値の74%に増加した。回復群のヒラメ筋の質量は、HUの両方のグループよりも有意に大きかったが、外来対照動物よりも、はるかに少ない。

副腎重量は、動物のストレスの指標として測定され、左と右副腎の両方を摘出し、秤量した。平均重量は全群で対照とHUマウスマウス(図4)のための同等であった。

以前にラットで我々は10出ていたHUの先頭に動物の数の成功率はサスペンション装置から出てくることなく、HUを完了した動物数(尾トラクションテープを噛む動物に起因)と比較していることが示されている12のモレ-ホルトンの技法1を使用。この研究ではマウスのなし(N = 54)はこれまでHUの期間の終了前に懸濁液から降りてきていません。我々は、しかし、深刻な炎症を起こして尾を開発したつのマウスを持っていなかった。炎症が明らかになったとき、我々は、炎症部位が治癒するようにテールリングを削除し、その後HUの期間を完了するために別のテールリングを配置。

彼らはサスペンション装置から出てくるので、過去に我々はHUのモレ-ホルトンの方法を使用している時、我々は、通常1〜2匹/群を排除する。トレイルリング方式で誤って14または28日間(nは= 54マウス)のためのHUの期間中、HUの装置から出てくるマウスのないエピソードはありませんでした。

図1
図1体重の変化(平均± SD)。略語:CON:荷重制御のマウス(n = 76)、プレHU:前のHUにすべてのマウス(n = 54)、HU14:14日(N = 34)でアンロードしたマウスの後肢、HU28:後肢のためのアンロードマウス28日(N = 20)、REC:ケージに許可されて後肢無負荷時のマウスは、3日(N = 22)のために回復する。体重に有意差はグループ間で観察されなかった。

図2
図2。ヒラメ筋の萎縮(平均± SD)。略語:CON:荷重制御のマウス(n = 76)、HU14:マウス14日間(N = 34)でアンロード後肢、HU28:後肢が28日(N = 20)でアンロードマウス;とREC:許可されて後肢無負荷マウスケージに3日間(N = 22)のために回復する。 *体重がコントロール(CON)より(P <0.001)に有意差。両方HU群より(P <0.01)δSignificantly異なる。

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図3。食料消費(平均± SD)。体重がかかると後肢のアンロード時の平均毎日の食事の摂取量(g /日)。略語:荷重制御のマウス(n = 76)、HU:マウス後肢unloaded14 - 28日間。 CONとHUの群間に有意差は認められなかった。

図4
図4。副腎腫瘤(平均± SD)。略語:CON:荷重制御のマウス(n = 76)、HU14:マウス14日間(N = 34)でアンロード後肢、HU28:後肢が28日(N = 20)でアンロードマウス;とREC:許可されて後肢無負荷マウスケージに3日間(N = 22)のために回復する。有意な差はグループ間で観察されなかった。

Discussion

我々は非常に成功したと判定さ後肢アンマウスの代わりの方法を、評価した。ここで説明するようにテールリング方式は、長期の後肢懸垂のために使用され、復旧後、HUを検討する。これらの条件のそれぞれの下、安定的な食物摂取、体重、及びマウスの副腎重量によって証明されるように適応するため、障害の証拠はなかった。このテールリングHUの手法は、実行するために簡単で、容易に非​​常に少ない外科診療に組み込むことができます。

伝統的なモレ-ホルトン5、6の方法に比べテールリング方式のいくつかの利点があります。最初に、皮膚とそのテールのリングの移植部位は問題が起こるようなら、それだけではなく一時停止期間の終了時に、すぐに明らかである、常に見える状態です。第二に、動物は、データセット内のマウスかどうかを保持するかどうかの決定を行うために必要がなくなります、HU中いつでもサスペンション装置から取得することはできません。また、マウスはリング装置を気にしない人として、リカバリのHUから解放されるとき、彼らはHU以下のシームレスな回復局面を可能にする、彼らの尾を改ざんしないでください。最後に、テールリング方式と後肢無負荷時のマウスは、モレ-ホルトンテール牽引法によってアンロードしたマウスの後肢よりもより自分の体重を維持する。我々の手ではHUの14日後に我々は、体格の小さい(-6.8%)が非有意な損失を観察した。インガルスらは、モレ-ホルトンの方法3でHUの14日後にマウスの体重が大幅に-12%の縮小が観察されたのに対し。インガルスは副腎重量が報告されていないものの、それは私たちのテールリング方式は、マウス(私たちのHUのマウスにおける副腎重量は対照より異なっていない)と後肢のアンロード期間中の体重のよりよい維持管理にあまりストレスを与えることが表示されます。

要約すると、後肢のアンロードのテールリング法を開発し、14および28日間マウスHUでテスト、およびマウスにHU 3日後のケージ回復に返されました。副腎重量、体重及び食物摂取量に基づいて、マウスは尾リング装置によく適応しているように見えます。テールリング後肢のアンロードの方法は、従来のモレ-ホルトン後肢アンロードテクニックに便利な、簡単な代替手段です。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

著者は、彼の技術支援や動物の世話のためにアンドリューJダン、私たちの研究室で優秀な学部研究生を、感謝したいと思います。健康補助金HD058834とミズーリ州のライフサイエンスフェローシップの大学の研究所では、この作業に資金を供給した。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wire cutters/pliers Ace Hardware 84-056
Gauze Fisher Scientific 22-037-901
Heating pad Sunbeam Z-1228-001
Silver nitrate applicators ARZOL 0001-2
Isoflurane,USP Novaplus NDC 0409-3292-49
Chlorhexidine Gluconate 4% Purdue Products L.P. NDC 67618-200-01
Sterile 2-0 surgical steel suture Ethicon Inc. SS-28
25 X 5/8 A gauge needle Terumo Medical Corp. NN 2516R
Hemostat/ needle holder Fine Science Tools 12500-12
Size 10-24 X 4 machine screws Hillman The Fastener Center 90272
Nylon lock nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180141
Wing nut size 10 X 24 Hillman The Fastener Center 180243
Fender Washer size ¼ X 1 Hillman The Fastener Center 290012
Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” Bass Pro Shop 38-481-554-01
Metal sewing machine bobbin. Singer Instruments 45785
Paper clip Office Depot 221720
2” black paper binder clamps. Office Depot 308957
Scotch Multi-Use Duct Tape Office Depot 790710
1-3/8” Plated slotted steel bar Home Depot 548932 Extends slightly beyond the full length of the cage
50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage Alternative Design Manufacturing RC88D-PC
Water Bottle Alternative Design Manufacturing WB16FS
Stainless Steel wire Small Parts, Inc. SWX-4029 U-shaped wire to support water bottle

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References

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Comments

2 Comments

  1. Is it possible to apply such a method to rat?
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Christian C.
    March 19, 2013 - 12:22 PM
  2. Yes!!
    We have tried this method in both species and have the same results.

    Reply
    Posted by: Johan F.
    March 19, 2013 - 2:48 PM

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