תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וידאו זה מדגים את נוהל בידוד המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב בודד באמצעות תא רגיל הטכנולוגיה כולו. זה כולל תמונות של תאים GFP ונוירונים שכותרתו שנצפו במהלך ההקלטה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248, doi:10.3791/248 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הליך לבודד את המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב אחד. נתחיל בתיאור פתרון לנתח ולתפוס של נשים בוגרות שימוש במחקרים שלנו. ההליך להסרת המוח כולו שלם, כולל שתי האונות אופטיים, מומחש. Dissection של קנה הנשימה שמעל מוצג גם. המוח מבודד הוא לא רק קטן אך זקוק לטיפול מיוחד בטיפול בשלב זה כדי למנוע נזק לתאי העצב, רבים מהם קרוב לפני השטח החיצוני של הרקמה. אנו מראים כיצד בעל מיוחדת שפיתחנו משמש כדי לייצב את המוח בחדר ההקלטה. Electrophysiology תקן להגדיר משמש ההקלטה מתא עצב יחיד או זוגות של נוירונים. תמונה ניאון, נצפים מבעד למיקרוסקופ הקלטה, מקו GAL4 נהיגה ביטוי של GFP (GH146) מדגים כיצד נוירונים השלכה (PNS) מזוהים במוח לחיות. תמונת מתח גבוה Nomarski מראה תצוגה של נוירון בודד כי הוא ממוקד עבור הקלטה התא כולו. כאשר המוח יוסר בהצלחה ללא נזק, רוב הנוירונים הם פעילים באופן ספונטני, יורים פוטנציאל פעולה ו / או להציג קלט סינפטי ספונטנית. זו הכנה באתרו, שבו כל תא הקלטה של ​​נוירונים במוח המזוהה כל יכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות תרופתי, הוא מודל שימושי לחקר הפיזיולוגיה פלסטיות הסלולר ב CNS מבוגר.

Protocol

I. Dissection של המוח של הזבוב הבוגר

  1. המקום טיפה קטן (~ 100 μl) של ביתור פתרון במרכז של צלחת פטרי 35 מ"מ.
  2. תפוס נקבה בוגרת באמצעות aspirator. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במזרק שתי מחטים לערוף את הזבוב.
  3. מקום ראש טיפה קטנה של מלח לנתח (עם papain נוסף) בצלחת פטרי.
  4. עמדה בראש עם עם חוטם מול התחתון של המנה.
  5. החזק את הקוטיקולה המכסה את עין שמאל מתחם עם מחט 1. בצע חתך אלכסוני המשתרע מן הגב אל פני השטח הגחון עם 2 מחט, המדיאלי רק מחט 1.
  6. החזק את גפי עם מחט 1 ולהשתמש מחט 2 לעשות חתך אופקי המשתרע מפני השטח של הגחון בעין שמאל לעין ימין, ברמת הבסיס של חוטם.
  7. החזק את הקוטיקולה המכסה את עין ימין מתחם עם מחט 1. בצע חתך אלכסוני המשתרע מן הגב אל פני השטח הגחון עם 2 מחט, רק המדיאלי של מחט 1.
  8. סובב את ראשו כך שהצד מקורי הוא על פני צלחת פטרי. הכנס מחט 1 לציפורן בין המוח לבין מקורי, ולהשתמש מחט 2 ללכת בדרך זהה המחט הראשונה. באופן אידיאלי, הקפסולה יהיה לקלף מן המוח עם שתי האונות אופטי המחובר מאז האלה חשובים בייצוב המוח ההקלטה.
  9. קנה הנשימה, שקי האוויר, ורקמות החיבור אחרים מוסרים בזהירות בעזרת שני מלקחיים טיפ נאה.
  10. דיסקציה שלמים צריך לקחת 3-10 דקות

השנייה. הרכבה העצבים המרכזית

  1. המוח הוא הועבר לתא הקלטה באמצעות pipet קצה צהוב.
  2. בחדר הקלטה, המוח הוא התייצב על ידי הצבת מסגרת פלטינה כך שתי שערות לחצות קנס ליצור קשר עם רקמת בצומת בין האונות אופטיים אזור במוח המרכזי.
  3. המוח כל מותר לנוח בחדר הקלטה עם טפטוף מתמיד עם מלוחים מחומצן (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) לפחות 10 דקות. זלוף של החדר עם מלוחים מחומצן הוא המשיך לאורך כל התקופה את ההקלטה. ההכנה היא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ זקוף (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, גרמניה) עם במה קבועה של מים 40X טבילה אובייקטיבי (Achroplan; הצמצם המספרי, 0.8; Zeiss) ו Nomarski אופטיקה. GFP נתפסה עם מסנן הקרינה 505-530 BP.

ג. Electrophysiology

  1. Pipets של 8-14 Mohms משמשים הקלטות התא כולו
  2. הקלטות מהדק הנוכחי מתח-clamp מבוצעות באמצעות רשימת EPC7 או מגבר Axopatch 200B, 1322A Digidata התובע ממיר (התקנים מולקולריים, פוסטר סיטי, קליפורניה), Dimension 8200 של Dell המחשב (Dell Computer, Round Rock, TX) ו pClamp 9 תוכנה (התקנים מולקולריים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנת מבודד המוח כולו אנו מדגימים בסרטון זה מאפשר הערכה של מנגנוני הסלולר הבסיסית רגישות והעברת סינפטיים של נוירונים שזוהו, לרבות אלה המסלולים עיבוד חוש הריח, את הבוגרים תסיסנית המוח (גו ו-O דאוד, 2006). גישה זו משלימה המחקר של הפעילות העצבית במוחם של מבוגרים תסיסנית שלם (Wilson et כל 2004), ברוב ההקלטות באותה דרך של נוירונים פרוסת מוח היונקים משלימים הקלטות ביונקים מתנהג ער. ישנם שני יתרונות גדולים של כהכנה לטוס באתרו המוח בהשוואה פרוסות יונקים. ראשית המוח לטוס כולו נכנס בקלות לתוך תא ההקלטה ולכן אין צורך הבלו פיסה קטנה של רקמה עצבית מעגל גדול המתרחשת בעת ביצוע פרוסות המוח של היונקים. לכן מעגלים עצביים בתוך המוח מבודד Drospohila להישאר שלם ברובו. שנית, גופי התא של רוב הנוירונים נמצאים סמוך לפני השטח של המוח, נגיש עבור כל הקלטה התא והם נשארים פעילים מבחינה תפקודית כאשר perfused ברציפות עם מלוחים מחומצן במשך כמה שעות.

בעזרת תחתית כוס קאמרית הקלטה גם מאפשר זיהוי של נוירונים ספציפיים על בסיס מיקומם ו / או ביטוי של GFP. בהכנה זו, הקלטה במהלך זלוף מחייבת התייצבות של המוח. זו אינה תואמת את נהלי סטנדרטי, כולל חוט זהב במיקום אסטרטגי או רשת ניילון, כי הם יעילים עבור רקמות כגון פרוסות בהיפוקמפוס, בגלל גודלו הקטן של המוח כולו (~ 1mm). לכן אנו מחזיק מעוצב עם מסגרת פלטינה לחצות ניילון שערות ממוצבת לפנות את המוח רק בשני מקומות כדי למזער את הנזק נוירונים הממוקמת סמוך לפני השטח של המוח. זה מייצב את המוח, עם פני השטח או הקדמי או האחורי כלפי מעלה את פני השטח רק מול קלות מונחות על רצפת חדר ההקלטות. שימוש בהתקן זה אנו מסוגלים לשמור על שגרה יציבה הקלטות תא שלם עד שעה, גם מתא עצב קטן כולל תאים קניון, בעוד עושה מניפולציות תרופתי הדורשים יישום אמבטיה של תרופות ספציפיות. בעל צריך להיות שימושית גם בהבטחת אחרים דגימות רקמה קטנות ללימודי אלקטרו כגון פרוסות חוט השדרה של מכרסמים הילוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH NS27501 כדי DKOD. תמיכה נוספת עבור עבודה זו סופק על ידי גרנט HHMI תוכנית פרופסור כדי DKOD.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#5 Foceps Tool Fine Science Tools No. 11251-10 Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain Reagent Worthington Biochemical 3126 20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope SMZ-2B Model:C-PS Nikon Instruments Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co 305175 & 309602 Cheap and durable
Upright microscope Axioskop2 FS plus Carl Zeiss, Inc. Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier 200 B Molecular Devices
Digidata D-A converter 1322A Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
  2. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).

Comments

5 Comments

  1. As a fly researcher with no prior experience in electrophysiology, I intend to set-up the necessary facility, gain skill and subsequently implement, in our ongoing Drosophila neuropharmacogenomic modeling work, recording from brains of intact organism as well as from single neurons from isolated brain as described in the present paper. In this backdrop, I would like to know if the materials and devices mentioned in this paper would be sufficient for recording from brains of intact organism. If not, what else will be required? Where from one can obtain them? Kindly also suggest alternative suppliers, if any, for material and devices that have already been successfully used in intact organism and single neuron recordings.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2007 - 6:50 AM
  2. We have not recorded from brains in intact Drosophila with our equipment but I believe the set up we describe in this video is very similar to that used by Rachel Wilson and her colleagues at Harvard who are recording from intact organisms. In our lab we use both the Axon Instruments and List patch clamp amplifiers and they both work well. We have only used the Zeiss upright microscope.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2007 - 8:09 PM
  3. Is it possible to obtain or buy the designed holder (platinum frame and nylon cross hairs)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 14, 2010 - 11:50 PM
  4. We make these in the lab. You just need a short piece of platinum wire. Bend to shape you want. Use nylon hairs glued to wire with super glue. Nylon fibers are from a fine nylon mesh. We make under microscope and the nylon fibers are stretched over frame, taped on either side so they are tight, and then super glue applied to frame over the fiber. Each fiber glued in place allowed to dry before next one put on. Then trim all excess at end.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 15, 2010 - 7:43 PM
  5. What is the diameter of the platinum wire? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2015 - 12:10 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics