عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Biology
 

Summary

يوصف بروتوكول الأمثل لعزل الخلايا الجذعية من الغدة اللعابية الماوس. الأسلوب يعمل الهضم الأنزيمي والميكانيكية ، وتراخيص من العزلة salispheres تحتوي على خلايا ذات خصائص الخلايا الجذعية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الغدد اللعابية ناضجة سواء كانت ذات منشأ الإنسان والفأر تشمل الحد الأدنى من أنواع الخلايا الخمس ، كل واحد مما يسهل على إنتاج وإفراز اللعاب في الفم. خلايا عنيبية المصلية والمخاطية هي البروتين والأغشية المخاطية المصانع المنتجة للغدة على التوالي ، وتمثل مصدر إنتاج اللعاب. توليفها مرة واحدة ، تفرز مختلف المكونات البروتينية الأنزيمية وغيرها من اللعاب من خلال سلسلة من الخلايا الظهارية الأقنية التي تحمل نوع التشكل ، وحتى الطرد النهائي للعاب من خلال واحدة القناة الرئيسية في تجويف الفم. كما تم تعديل تركيبة اللعاب من قبل خلايا الأقنية خلال هذه العملية.

في مظهر من مظاهر الأمراض مثل متلازمة سجوجرن ، وفي بعض الحالات السريرية مثل العلاج الإشعاعي لسرطان الرأس والعنق ، وإفراز اللعاب من الغدد تنخفض بشكل كبير 1،2. وجفاف الفم الناتجة عن ذلك ، شعور ذاتي من جفاف الفم ، لا يؤثر فقط على قدرة المريض على البلع والكلام ، ولكنها تشجع أيضا على تطوير وتسوس الأسنان يمكن أن يضعف اجتماعيا لالمتألم.

إعادة إنتاج اللعاب في الظروف المذكورة أعلاه السريرية يمثل بالتالي لم تلب الحاجة الطبية ، وكما العديد من الدراسات أظهرت هذه القدرة على التجدد في الغدد اللعابية 3-5. مزيد من عزلة السكان تشبه الخلايا الجذعية من خلايا الأنسجة المختلفة من خلال الماوس وهيئات حقوق الإنسان 6-8 ، لقد أظهرنا باستخدام الطريقة الموصوفة التي يمكن أن تستخدم الخلايا الجذعية المعزولة من الغدد اللعابية الماوس لانقاذ إنتاج اللعاب في اللعاب المشع الغدد 9،10. هذا الاكتشاف يمهد الطريق لتطوير علاجات الخلايا الجذعية مقرها لمعالجة الأوضاع xerostomic في البشر ، وأيضا لاستكشاف الغدة اللعابية المكروية باعتبارها تحتوي على خلايا ذات القدرات الذاتية multipotent تجديد.

Protocol

1. الوصي التحضير

  1. العازلة : 1 ٪ (W / V) ألبومين المصل البقري في محلول ملح متوازن هانك
  2. إعادة الانزيمات. إنزيم هيالورونيداز : 40mg / مل ، الذائبة في العازلة. كولاجيناز الثاني : 23mg / مل ، الذائبة في العازلة. استخدام الحلول الطازجة المعدة أنزيم جديدة لكل العزلة. عندما يذوب ، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها لعملية الهضم.
  3. كلوريد الكالسيوم 50 مم في الماء المقطر. فلتر تعقيم خلال 0.2 UM تصفية حجم المسام.
  4. الماوس الغدة اللعابية المتوسطة الثقافة (MSG) : DMEM : F12 مع البنسلين (100 وحدة دولية / مل) ، وستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل) ، glutamax (2 ملم) ، وعامل نمو البشرة - 2 (20 نانوغرام / مل) ، عامل نمو الخلايا الليفية -2 (20 نانوغرام / مل) ، N2 الملحق (1 ٪) ، والانسولين (10 ميكروغرام / مل) ، وديكساميثازون (1 ميكرومتر).

2. الميكانيكية والأنزيمية الأنسجة الهضم

  1. تزن الغدد اللعابية تشريح.
  2. ختم الغدد في اللب متجانسة باستخدام مقص العقيمة تشريح المنحني في طبق بتري الصغيرة.
  3. جمع الأنسجة المفروم في 14 مل من الأنابيب ، وذلك باستخدام 1mL المخزن المؤقت في الأنسجة تحت الفك 80mg. شطف الأطباق بتري نظيفة من النسيج باستخدام بعض العازلة.
  4. إضافة آخر مل 1 من الأنسجة العازلة في 80 ملغ ، تليها 25 ميكرولتر حل كولاجيناز الانزيم الثاني ، و 25 إنزيم هيالورونيداز حل ميكرولتر و 250 كلوريد الكالسيوم في الأنسجة حل ميكرولتر 80 ملغ. إذا كان يعمل مع كميات كبيرة من الأنسجة ، والخطوات 2.4 -- 2.9 لا يمكن أن يؤديها في قوارير T25 زراعة الأنسجة للراحة.
  5. احتضان بالحمام المائي في الهز وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة أنابيب ومتمزج بواسطة ماصة للاختلاط انزيم بدقة من خلال نسيج جديد.
  6. في محل بالحمام المائي لمدة 20 دقيقة.
  7. جمع الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في 400 XG ، لمدة 8 دقائق. تجاهل طاف.
  8. Resuspend العازلة في 2 مل لكل 80 ملغ الأنسجة ، وكرر الانزيمات والكالسيوم بالإضافة إلى كلوريد على النحو الوارد أعلاه. احتضان 20 دقيقة في حمام ماء الهز. إزالة أنابيب ومتمزج بواسطة ماصة لخلط الأنزيمات بدقة.
  9. لاحتضان النهائي في 20 دقيقة هز حمام الماء. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه ، تجاهل طاف.

3. خطوات الغسيل

  1. Resuspend ملغ كل 80 من الأنسجة في المخزن 2 و مل ماصة لغسل الأنسجة خالية من الانزيمات.
  2. الطرد المركزي سابقا لجمع. تجاهل طاف.
  3. تكرار غسل به العازلة 1 مل لكل 80 ملغ الأنسجة. أجهزة الطرد المركزي لجمع والتخلص من طاف.

4. تصفية

  1. Resuspend حل في الأنسجة العازلة مل 1 في الأنسجة 80 ملغ.
  2. إضافة إلى 100 مرشح حل المسام حجم ميكرون وضعت أكثر من 50 مل أنبوب فالكون. لا تنطبق أكثر من 3 ملل من محلول الأنسجة مفروم لكل عمود ، كما قد تصبح مسدودة المرشحات. تتسرب من خلال السماح ل. إزالة المواد التي تمت تصفيتها معلقة على السفلي من تصفية حسب ماصة ، وإضافة إلى الترشيح.
  3. استخدام المحاقن مع إبرة قياس 26 إلى اتخاذ الراشح من 50mL الأنابيب وتنطبق على المرشحات 50 ميكرومتر حجم المسام على أنابيب 5 مل. السماح لتصفية من خلال تقديم المساعدة من خلال تخفيف الأغطية إذا لزم الأمر.
  4. أنابيب الطرد المركزي كما في السابق لجمع. تجاهل طاف.

5. الطلاء والمتوسطة

  1. تجمع كل الكرات في مجلد واحد. العد الآلي باستخدام العداد الخلية أو haemocytometer.
  2. لوحة الخلايا في كثافة الخلايا 0.4 X 6 10 لكل بئر من 12 لوحة جيدا ، أو 2.67 × 10 6 خلايا الأنسجة T25 في قارورة الثقافة. إضافة 1 مل المتوسط ​​MSG إلى كل بئر أو مل 6 إلى كل قارورة T25.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية. وينبغي أن تكون مرئية بوضوح مجالات النهار 2.

6. ممثل النتائج :

بعد يومين أو ثلاثة أيام في الثقافة ، فإن مجاميع صغيرة من الخلايا (salispheres) يكون واضحا في الثقافات. وسوف تستمر في النمو Salispheres في الحجم على مدى عشرة أيام في الثقافة. وتظهر الصور المجهري ممثل المرحلة النقيض من salispheres في الشكل 1. يمكن عزل الخلايا الجذعية المتكاثرة معربا عن البروتينات المرتبطة علامة خلية من هذه المجالات ، على النحو الأمثل بين عزلة يوما بعد 3-5 ، وتكون قادرة على التمايز إلى خلايا وظيفية اللعاب ، عنيبية المنتجة.

الشكل 1
الشكل 1. تشكيل Salisphere في المختبر. بعد الهضم الميكانيكية والأنزيمية باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن العثور على مجالات زيادة حجم العائمة في الثقافات. لوحات لوحات تمثل المرحلة المجهر النقيض من المجالات من أيام 0 (A) و 4 (ب) و 7 (C) و 10 (D). مقياس بار = 50 ميكرومتر.

Discussion

وصف طريقة زراعة الأنسجة هنا يمثل بروتوكول استنساخه لعزل الخلايا الجذعية التي تحتوي على salispheres من الغدد اللعابية من الفئران. وقد أبرزت الدراسات التي تستخدم الخلايا المعزولة في هذه الطريقة القدرة على التجدد اللعابية الخلايا الجذعية الغدة 9. يسببها زرع الخلايا 100 + ج كيت المستمدة من salispheres الانتعاش وظيفية من الغدد اللعابية الماوس المشع. هذه البيانات هي مثيرة وتوفير نقطة انطلاق للتحقيق في الخلايا الجذعية العلاج استنادا لجفاف الفم. لا تزال العديد من السبل التي ينبغي استكشافها ولكن ، بما في ذلك التعريف الكامل التعبير علامة البروتين من الخلايا الجذعية ، وقدرة الغدد تحت الفك السفلي لانقاذ وظيفة الغدد اللعابية النكفية المشع ، والعكس بالعكس ، وتوصيف المفترضة في الخلية الجذعية المتخصصة في الجسم الحي الخلايا. في نهاية المطاف ، وترجمة هذا البروتوكول لعينات الأنسجة البشرية والإمكانات اللاحقة لعلاج جفاف الفم في المرضى من البشر باستخدام خلايا معزولة هو التطبيق الأكثر إثارة للطريقة وصفها.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics