마우스 침샘에 줄기 세포의 분리

Biology
 

Summary

마우스 침샘에서 줄기 세포의 격리를 위해 최적화된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 효소와 소화 기계를 고용하고, 줄기 세포의 특징과 세포를 포함하는 salispheres의 절연을 수 있습니다.

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Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

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Abstract

인간과 마우스 양쪽 원산지 성숙 침샘은 구강에 타액의 생산과 배설을 용이 각각 다섯 세포 유형의 최소 구성됩니다. 묽은 및 점액 acinar 세포는 각각 단백질과 선 (腺)의 점액 생산 공장이며, 타액 생산의 출처를 나타냅니다. 일단 합성, 타액의 여러 효소 및 기타 proteinaceous 구성 요소는 구강의 구멍에 한 가지 큰 덕트를 통해 타액의 최종 퇴학까지 상피 타입 형태를 베어링 ductal 세포의 일련을 통해 분비됩니다. 타액의 구성도이 과정에서 ductal 세포에 의해 수정됩니다.

이러한 Sjögren 증후군과 같은 질병의 발현에서와 같은 내분비선을 통해 머리와 목 암, 타액 생산을위한 방사선 치료와 같은 일부 임상 상황에서 극적으로 1,2을 줄일 수있다. 결과 xerostomia, 구강 건조의 주관적인 느낌이, 제비와 대화할 수있는 환자의 능력뿐 아니라 영향을뿐만 아니라, 치과 카리 에스의 개발을 장려하고 괴로워하는 사람에 대한 사회적 쇠약 수 있습니다.

위에서 언급한 임상 조건에서 타액 생산의 복원 따라서 충족되지 임상 필요성을 대표하고, 이러한 여러 연구 침샘 3-5의 재생 능력을 보여준 것처럼. 마우스와 인간의 몸에서 6-8 내의 여러 조직에서 세포의 줄기 세포와 같은 인구의 고립을 더욱, 우리는 마우스 침샘에서 분리된 줄기 세포가 조사 타액의 타액 생산을 구출하는 데 사용할 수있는 설명 방법을 사용 보였습니다 땀샘 9,10. 이 발견은 multipotent 자기 갱신 기능을 통해 세포를 포함하는 microenvironment로 침샘의 탐사에도 인간 xerostomic 조건의 치료를위한 줄기 세포 기반 치료법​​의 개발을위한 방법으로 불법 체류자합니다.

Protocol

1. 리젠트 준비

  1. 버퍼 : 1 % (W / V) 행크의 균형 소금 용액에 소 혈청 알부민
  2. Reconstitute 효소. Hyaluronidase 효소 : 버퍼에 용해 40mg / ML. Collagenase II : 23mg / ML, 버퍼에 용해. 각 절연 신선한 신선한 효소 솔루션을 사용합니다. 4 녹아 저장 ° C 소화에 사용까지.
  3. 증류수 50 MM의 염화칼슘. 0.2 UM 기공 크기의 필터를 통해 소독을 필터링합니다.
  4. 마우스 침샘 (MSG) 배지 : DMEM : 페니실린과 F12 (100 IU / ML), 스트렙토 마이신 (100 μg / ML), glutamax (2 ㎜), 표피 성장 인자 - 2 (20 NG / ML), fibroblast의 성장 인자 -2 (20 NG / ML), N2 보완 (1 %), 인슐린 (10 μg / ML)과 dexamethasone (1 μm의).

2. 기계 및 효소 조직 소화

  1. 해부 침샘을 나가는거야.
  2. 작은 배양 접시에있는 무균 곡선 해부 가위를 사용하여 동질적인 펄프로 분비 잘라.
  3. 80mg 턱밑 조직마다 버퍼의 1mL를 사용하여, 14 ML 튜브에 다진 조직을 수집합니다. 버퍼의 일부를 사용하여 조직의 깨끗한 배양 접시를 씻어.
  4. 25 μL collagenase 효소 II 솔루션, 25 μL hyaluronidase 효소 솔루션 80 MG 조직 당 250 μL 염화칼슘 용액 다음 80 MG 조직마다 버퍼의 또 다른 한 ML을 추가합니다. 2.9 편의를 위해 T25 조직 문화 flasks에서 수행할 수 있습니다 - 조직의 대용량과 함께 일하고있다면, 2.4이 단계를 반복합니다.
  5. 20 분 ° C 37 세트 떨고 waterbath에 품어. 튜브를 제거하고 다시 조직을 통해 철저하게 효소를 섞어 피펫으로 씹다.
  6. 또 다른 20 분 대한 waterbath로 바꿉니다.
  7. 팔분에 대한 400 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 폐기하십시오.
  8. 각 80 MG 조직 2 ML 버퍼에 Resuspend, 이상과 같은 효소와 염화칼슘 추가를 반복합니다. 물 목욕을 흔들어 20 분 알을 품다. 튜브를 제거하고 철저하게 효소를 섞어 피펫으로 씹다.
  9. 물 목욕을 흔들림의 마지막 20 분 알을 품다. , 위와 같이 원심 분리하여 세포를 수집 뜨는 폐기.

3. 워싱 단계

  1. 2 ML 버퍼와 효소의 무료 조직을 씻어 피펫으로 조직의 각 80 MG를 Resuspend.
  2. 수집하는 등 이전에 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
  3. 80 MG 조직 당 한 ML 버퍼를 사용하여 씻어 반복합니다. 수집 뜨는 폐기하기 위해 원심 분리기.

4. 필터링

  1. 80 MG 조직 당 한 ML 버퍼에 Resuspend 조직 솔루션입니다.
  2. 50 ML 팰컨 튜브를 통해 배치 100 μm의 기공 크기의 필터 솔루션을 추가합니다. 필터가 차단 될 수 있으므로, 컬럼마다 다진 조직 솔루션의 3 개 이상 MLS를 적용하지 마십시오. 을 통해 침투 수 있습니다. 피펫으로 필터의 아래쪽에 매달려 필터링된 자료를 제거하고, 여과액 추가할 수 있습니다.
  3. 50mL 튜브에서 여과물을 5 ML 튜브 50 μm의 기공 크기의 필터를 적용 26 게이지 바늘로 주사기를 사용하십시오. 필요한 경우 피부를 느슨해진하여 지원을 통해 필터링할 수 있습니다.
  4. 원심 분리기 튜브는 이전에 수집합니다. 뜨는 폐기하십시오.

5. 도금 및 매체

  1. 하나의 볼륨으로 모든 알약을 결합합니다. 자동 셀 카운터 또는 혈구계를 사용하여 계산합니다.
  2. 0.4 X 10 6 12 잘 플레이트 잘 당 세포, 또는 2.67의 밀도에 플레이트 세포 T25 조직 배양 플라스크 당 X 10 6 세포. 각 T25 플라스크에 각각 잘 또는 6 ML 1 ML의 MSG 매체를 추가합니다.
  3. 37 품어 ° C. 분야는 하루에 2 명확하게 표시해야합니다.

6. 대표 결과 :

문화 2-3일 후, 전지 (salispheres)의 작은 집계는 문화에 분명합니다. Salispheres 문화에서 10 일 기간 동안 크기로 성장할 것입니다. salispheres 대표 위상 콘트라스트 현미경 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 줄기 세포 관련 마커 단백질을 표현 Proliferating 전지는 최적의 3-5 일 이후 절연 사이에,이 분야에서 고립, 그리고 기능, 타액 생산 acinar 세포로 분화 능력이있다 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 체외에서 Salisphere 형성. 현재 프로토콜을 사용하여 기계적 소화 효소에 따라 증가하는 크기의 분야는 부동 문화에서 찾을 수 있습니다. 패널 며칠 0 (A), 4 분야의 대표적인 위상 콘트라스트 현미경 이미지 (B), 7 (C) 10 (D)입니다. 스케일 바 = 50 μm의.

Discussion

조직 배양 방법은 줄기 세포 함유 생쥐의 침샘에서 salispheres을의 격리에 대한 재현성 프로토콜을 나타냅니다 여기에서 설명한. 이러한 방식으로 분리된 세포를 사용하는 연구는 침샘에 줄기 세포 9 재생 능력을 강조했습니다. salispheres에서 파생된 C - 키트 + 세포 백의 이식은 조사 마우스 침샘의 기능 회복을 유도. 이러한 데이터는 흥분하고 xerostomia를위한 줄기 세포 기반 치료의 조사를위한 출발점을 제공합니다. 많은 아베는 줄기 세포의 전체 마커 단백질 발현 프로파일, 조사 귀밑샘 분비 관이 그 반대의 기능을 구출하기 턱밑 분비의 능력, 그리고 생체내 줄기 세포 틈새에서 putative의 특성을 포함하여, 그러나 탐험으로 남아 세포. 결국, 인간의 조직 샘플과 분리된 세포를 사용하여 인간의 환자 xerostomia의 치료에 대한 후속 가능성이 프로토콜의 번역이 설명한 방법의 가장 흥미로운 응용 프로그램입니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

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References

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  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
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  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

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