Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Biology
 

Summary

Farenin tükürük bezi kök hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklanmıştır. Yöntemi, enzimatik ve mekanik sindirim istihdam ve hücrelerin kök hücre özelliklerini içeren salispheres izolasyonu izin verir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Olgun insan ve fare kökenli tükürük bezleri, ağız boşluğuna tükürük üretimi ve atılımını kolaylaştırır, her biri beş hücre tipleri, en az oluşmaktadır. Seröz ve mukoza asiner hücrelerinin sırasıyla protein ve mukoz bezi üreten fabrikalar ve tükürük üretimi kökeni temsil eder. Sentezlenmiş, tükürük çeşitli enzimatik ve diğer protein bileşenleri, tükürüğün ağız boşluğuna önemli bir kanal vasıtasıyla nihai uzaklaştırma kadar duktal hücrelerin epitel-tipi morfolojisi taşıyan bir dizi aracılığıyla salgılanan. Tükürüğün bileşimi de bu işlem sırasında duktal hücreler tarafından değiştirilir.

Sjögren sendromu gibi hastalıkların belirtisi ve bezleri tarafından baş ve boyun kanserleri, tükürük üretimi için radyoterapi gibi bazı klinik durumlarda, dramatik bir şekilde 1,2 azalır . Ağız kuruluğu, ağız kuruluğu öznel bir duygu, yutmak ve konuşma yeteneği hastanın sadece etkiler, ama aynı zamanda diş çürüğü gelişmesine teşvik eder ve dertli sosyal zayıflatıcı olabilir.

Bu nedenle tükürük üretimi yukarıda bahsedilen klinik koşullarda restorasyon karşılanmamış bir klinik ihtiyaç temsil eder ve tükürük bezleri 3-5 rejeneratif kapasitesi gibi çeşitli çalışmalar göstermiştir . Izolasyon, fare ve insan bedenleri 6-8 içinde çeşitli dokulardan hücrelerinin, kök hücre benzeri popülasyonlarının Ayrıca, fare tükürük bezleri izole edilen kök hücreleri, ışınlanmış tükürük tükürük üretimini kurtarmak için kullanılabilir olması açıklanan yöntemi kullanarak göstermiştir bezleri 9,10. Bu keşif, kendini yenileyen multipotent yetenekleri ile hücreler içeren bir mikro olarak tükürük bezi keşfi için de insanlarda xerostomic koşulların tedavisi için kök hücre tabanlı tedavilerin geliştirilmesi için önünü açıyor.

Protocol

1. Regent Hazırlık

  1. Tampon:% 1 (w / v) Hank dengeli tuz solüsyonu sığır serum albumin
  2. Sulandırın enzimler. Hyaluronidase enzim: 40 mg / mL tampon içinde çözünmüş. Kollajenaz II: 23mg / mL tampon içinde çözünmüş. Her izolasyonu için taze taze hazırlanan enzim çözümleri kullanın. çözünmüş, mağaza, 4 ° C sindirimi için kullanmak kadar.
  3. Distile su ile 50 mM kalsiyum klorür. Filtre 0.2 um gözenek boyutu filtre ile sterilize.
  4. Fare tükürük bezi (MSG) kültür ortamı: DMEM: penisilin ile F12 (100 IU / ml), streptomisin (100 mg / ml), glutamax (2 mM), epidermal büyüme faktörü-2 (20 ng / ml), fibroblast büyüme faktörü -2 (20 ng / ml), N2 takviyesi (% 1), insülin (10 mg / ml) ve deksametazon (1 mcM).

2. Mekanik ve enzimatik Doku Sindirim

  1. Tükürük bezleri diseke tartılır.
  2. Bezleri, küçük bir petri steril kavisli diseksiyonu makas kullanarak homojen bir hamuru içine doğrayın.
  3. 80mg submandibular doku başına 1 ml tampon kullanarak, 14 mL tüplerde kıyılmış doku toplayın. Tampon kullanarak bazı doku temiz petri kaplarına durulayın.
  4. 25 mcL kollajenaz II enzim çözeltisi, 25 mcL hiyalüronidaz enzim çözeltisi, 80 mg doku başına 250 mcL kalsiyum klorür çözeltisi ile 80 mg doku başına tampon başka bir 1 ml ekleyin. 2.9 T25 kolaylık sağlamak için doku kültürü şişeleri yapılabilir büyük miktarda doku ile çalışıyorsanız, 2.4 adım.
  5. 20 dakika boyunca 37 ° C sallayarak su banyosunda inkübe edin. Tüpleri çıkarın ve tekrar doku ile iyice enzim karışımı pipet ile çiğnemek.
  6. 20 dakika su banyosunda değiştirin.
  7. 8 dakika boyunca, 400 xg'de santrifüj yoluyla doku toplayın. Süpernatant atın.
  8. Her biri 80 mg doku için 2 mL tampon içinde süspanse edin ve yukarıdaki gibi enzim ve kalsiyum klorür yanı sıra tekrarlayın. , Su banyosunda sallayarak 20 dakika inkübe edin. Tüpleri çıkarın ve iyice karıştırın enzimler pipet ile çiğnemek.
  9. Su banyosu sallayarak son 20 dakika inkübe edin. Yukarıdaki gibi santrifüj hücreleri toplayın supernatant atın.

3. Yıkama Adımlar

  1. 2 mL tampon ve enzimler serbest doku yıkamak için pipet her biri 80 mg doku tekrar
  2. Toplamak için önceden santrifüjleyin. Süpernatant atın.
  3. 80 mg doku başına 1 ml tampon kullanarak yıkayın tekrarlayın. Santrifüj toplamak supernatant atmak için.

4. Süzme

  1. 80 mg doku başına 1 ml tampon içinde süspanse edin doku çözüm.
  2. 50 ml Falcon tüp üzerine yerleştirilen 100 mikron gözenek boyutlu filtre çözüm ekleyin. Filtreler bloke olabilir, kıyılmış doku çözüm kolon başına en fazla 3 mL uygulanır. Yoluyla sızmasına izin verin. Pipet filtre alt asılı filtre malzemelerini çıkarın ve süzüntü eklemek.
  3. 50ml tüpler süzüntü 5 ml tüpler 50 mikron gözenek boyutu filtreleri almak ve uygulamak, 26 gauge iğne ile şırınga kullanın. Gerekirse kapaklarının gevşemesine yardımcı olmak, süzülmeye bırakın.
  4. Santrifüj tüpleri önceden toplamak için. Süpernatant atın.

5. Kaplama ve Ortam

  1. Bir hacim içine tüm pelet birleştirin. Otomatik Hücre sayıcı veya haemocytometer kullanarak güvenin.
  2. Plaka hücrelerinin yoğunluğu 0.4 x 10 6 12 plaka her hücre, ya da 2.67 x 10 6 hücre T25 doku kültürü şişesi başına. Her T25 şişeyi her iyi veya 6 ml 1 ml MSG orta ekleyin.
  3. 37 inkübe ° C Küreler 2 gün açıkça görünür olmalıdır.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

2-3 gün sonra kültür hücreleri (salispheres) küçük agrega kültürlerin belirgin olacaktır. Salispheres kültür on gün bir süre içinde boyut olarak büyümeye devam edecektir. Salispheres Temsilcisi faz kontrast mikroskobu görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Proliferatif hücreler kök hücre ile ilişkili protein işaretleyicileri ifade, bu alanlarda en iyi günde 3-5 yazılan izolasyon arasında izole edilmiş, ve fonksiyonel, tükürük üreten asiner hücreleri farklılaşma kapasitesine sahip olabilir.

Şekil 1
Şekil 1 in vitro Salisphere oluşum. Bugünkü protokolünü kullanarak mekanik ve enzimatik sindirim ardından, artan büyüklükte küreler yüzer kültürlerde bulunabilir. Paneller gün 0 (A), 4 küre temsilcisi faz kontrast mikroskobu görüntüleri (B), 7 (C) ve 10 (D). Ölçek çubuğu = 50 mm.

Discussion

Burada anlatılan doku kültürü yöntemi kök hücre içeren farelerin tükürük bezleri salispheres izolasyonu için tekrarlanabilir bir protokol temsil. Bu şekilde izole hücreler kullanılarak yapılan çalışmalar, tükürük bezi kök hücreler 9 rejeneratif kapasitesi sermiştir . Salispheres türetilen c-Kit + hücreler yüz Nakli ışınlanmış fare tükürük bezlerinin fonksiyonel iyileşmeye neden olmuştur. Bu veriler, heyecan verici ve kserostomi için kök hücre tabanlı tedavi soruşturulması için bir başlangıç ​​noktası sağlamak. Birçok caddeler, ancak kök hücrelerin tam işaretleyici protein ekspresyon profili, ışınlanmış tükürük bezleri parotis ve tersi işlevi kurtarmak için submandibular bezleri yeteneği ve in vivo kök hücre niş varsayılan karakterizasyonu da dahil olmak üzere keşfedilmeyi beklemektedir hücreler. Sonuçta, bu protokolün, insan doku örnekleri ve izole hücreler kullanarak insan hastalarda kserostomi tedavisi için sonraki potansiyel çeviri açıklanan yöntemin en heyecan verici bir uygulamadır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics