Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Biology
 

Summary

Un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l'isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

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Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

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Abstract

Maturo ghiandole salivari di origine umana e topo comprendono un minimo di cinque tipi di cellule, ognuna delle quali facilita la produzione e l'escrezione di saliva nella cavità orale. Cellule acinari sierose e mucose sono le proteine ​​e mucose fabbriche della ghiandola, rispettivamente, e rappresentano l'origine della produzione di saliva. Una volta sintetizzate, le varie componenti enzimatiche e le altre proteica della saliva sono secreti attraverso una serie di cellule epiteliali duttali cuscinetto tipo morfologia, fino alla eventuale espulsione della saliva attraverso un condotto grande nella cavità della bocca. La composizione della saliva è anche modificata dalle cellule duttali durante questo processo.

Nella manifestazione di malattie come la sindrome di Sjögren, e in alcune situazioni cliniche come il trattamento di radioterapia per i tumori testa e collo, produzione di saliva da parte delle ghiandole è drasticamente ridotto 1,2. La xerostomia risultante, una sensazione soggettiva di secchezza delle fauci, colpisce non solo la capacità del paziente di deglutire e parlare, ma incoraggia anche lo sviluppo della carie dentale e può essere socialmente debilitanti per il paziente.

Il restauro della produzione di saliva in condizioni cliniche di cui sopra rappresenta dunque un bisogno insoddisfatto clinico, e come tali diversi studi hanno dimostrato la capacità di rigenerazione delle ghiandole salivari 3-5. Ulteriormente l'isolamento di cellule staminali simili a popolazioni di cellule provenienti da tessuti diversi all'interno del mouse e corpi umani 6-8, abbiamo dimostrato con il metodo descritto che le cellule staminali isolate dalle ghiandole salivari del mouse può essere utilizzato per salvare la produzione di saliva in salivari irradiati ghiandole 9,10. Questa scoperta apre la strada per lo sviluppo di cellule staminali a base di terapie per il trattamento di condizioni xerostomic negli esseri umani, e anche per l'esplorazione della ghiandola salivare come un microambiente che contengono cellule multipotenti con capacità auto-rigenerante.

Protocol

1. Reggente di preparazione

  1. Buffer: 1% (w / v) di BSA in soluzione salina bilanciata di Hank
  2. Ricostituire enzimi. Enzima ialuronidasi: 40 mg / mL, sciolta in tampone. Collagenasi II: 23mg / ml, sciolta in tampone. Usa appena soluzioni enzima preparato fresco per ogni isolamento. Quando sciolto, conservare a 4 ° C fino all'utilizzo per la digestione.
  3. 50 mM di cloruro di calcio in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterilizzare 0,2 uM dimensione dei pori.
  4. Topo ghiandola salivare (MSG) terreno di coltura: DMEM: F12 con penicillina (100 UI / ml), streptomicina (100 mg / ml), glutamax (2 mm), fattore di crescita epidermico-2 (20 ng / mL), il fattore di crescita dei fibroblasti -2 (20 ng / mL), N2 supplemento (1%), l'insulina (10 mg / mL) e desametasone (1 mM).

2. Tissue Digestione meccanica e enzimatica

  1. Pesare le ghiandole salivari sezionato.
  2. Tritare ghiandole in una polpa omogenea utilizzando forbici sterili dissezione curve in un piccolo piatto di Petri.
  3. Raccogliere tessuto tritata in 14 mL, utilizzando 1 ml di buffer per 80 mg di tessuto sottomandibolare. Lavare i piatti di Petri pulita di tessuto utilizzando alcuni buffer.
  4. Aggiungere un altro 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto, seguito da 25 microlitri soluzione enzima collagenasi II, 25 microlitri soluzione enzimatica ialuronidasi e 250 microlitri di soluzione di cloruro di calcio per 80 mg di tessuto. Se si utilizzano grandi quantità di tessuto, a pochi passi 2,4-2,9 possono essere eseguite in tessuto fiasche T25 cultura per convenienza.
  5. Incubare a bagnomaria agitazione a 37 ° C per 20 minuti. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente enzima attraverso il tessuto nuovo.
  6. Sostituire a bagnomaria per 20 minuti.
  7. Raccogliere i tessuti per centrifugazione a 400 xg, per 8 minuti. Gettare il surnatante.
  8. Risospendere in 2 mL di tampone per ogni 80 mg di tessuto, e ripetere enzima e il cloruro di calcio aggiunta come sopra. Incubare 20 minuti in agitazione bagnomaria. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente gli enzimi.
  9. Incubare per 20 minuti finali in agitazione bagnomaria. Raccogliere le cellule per centrifugazione come sopra, scartare il surnatante.

3. Fasi di lavaggio

  1. Risospendere ogni 80 mg di tessuto in 2 mL di tampone e pipetta per lavare il tessuto privo di enzimi.
  2. Centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante.
  3. Ripetere il lavaggio con buffer di 1 ml per 80 mg di tessuto. Centrifuga per raccogliere, scartare il surnatante.

4. Filtraggio

  1. Risospendere soluzione tessuto in 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto.
  2. Aggiungi soluzione a 100 micron di dimensioni dei pori del filtro posto sopra tubo da 50 ml Falcon. Non applicare più di 3 ml di soluzione di tessuto macinato per colonna, i filtri possono essere bloccati. Permettono di filtrare attraverso. Rimuovere il materiale filtrato appeso inferiore del filtro con la pipetta, ed aggiungere al filtrato.
  3. Usare siringa con 26 gauge a prendere filtrato dalla 50mL tubi e applicare i filtri a 50 micron dimensione dei pori, il 5 mL. Permettono di filtrare, assistendo allentando coperchi, se necessario.
  4. Provette da centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante.

5. Placcatura e medie imprese

  1. Combina tutti i pellets in un unico volume. Conte con contatore automatico di cellule o emocitometro.
  2. Cellule germi a densità di 0,4 x 10 6 cellule per pozzetto di 12 pozzetti, o 2,67 x 10 6 cellule per T25 fiasco di coltura tissutale. Aggiungere 1 ml MSG medio in ciascun pozzetto o 6 ml per ogni pallone T25.
  3. Incubare a 37 ° C. Sfere devono essere chiaramente visibili di giorno 2.

6. Rappresentante dei risultati:

Dopo due o tre giorni di cultura, piccoli aggregati di cellule (salispheres) sarà evidente nelle culture. Salispheres continuerà a crescere in dimensioni per un periodo di dieci giorni nella cultura. Rappresentante immagini microscopio a contrasto di fase di salispheres sono mostrati in Figura 1. Le cellule in proliferazione delle cellule staminali che esprimono proteine ​​associate marcatore può essere isolato da questi ambiti, in modo ottimale tra i giorni 3-5 isolamento post, e sono in grado di differenziazione in funzionali, le cellule acinari saliva produce.

Figura 1
Figura 1. Salisphere formazione in vitro. A seguito di digestione meccanica ed enzimatica utilizzando il protocollo attuale, sfere di dimensioni crescenti si possono trovare nelle culture galleggiante. I pannelli sono rappresentative immagini microscopio a contrasto di fase di sfere dai giorni 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra di scala = 50 micron.

Discussion

Il metodo di coltura tissutale qui descritto rappresenta un protocollo riproducibile per l'isolamento di cellule staminali contenenti salispheres dalle ghiandole salivari di topi. Gli studi che utilizzano cellule isolate in questo modo hanno evidenziato la capacità rigenerativa delle cellule staminali della ghiandola salivare 9. Il trapianto di un centinaio di c-Kit + cellule derivate dal salispheres indotto il recupero funzionale delle ghiandole salivari di topo irradiati. Questi dati sono entusiasmanti e di fornire un punto di partenza per lo studio della terapia con cellule staminali a base di xerostomia. Molte strade rimangono da esplorare però, compresa la piena profilo di espressione delle proteine ​​marker delle cellule staminali, la capacità delle ghiandole sottomandibolari per salvare la funzione delle ghiandole salivari, parotidi irradiati e viceversa, e la caratterizzazione dei putativi di nicchia delle cellule staminali in vivo di le cellule. In ultima analisi, la traduzione di questo protocollo di campioni di tessuto umano e il potenziale successive per la terapia di xerostomia nei pazienti umani con le cellule isolate è l'applicazione più interessante del metodo descritto.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

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References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
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    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

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