Isolering av Mouse Saliv celler Gland Stem

Biology
 

Summary

Ett optimerat protokoll för isolering av stamceller från mus spottkörteln beskrivs. Metoden använder enzymatiska och mekaniska matsmältningen, och tillåter isolering av salispheres som innehåller celler med egenskaper av stamceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mogna spottkörtlar för både människors och mus ursprung bestå av minst fem celltyper, som alla underlättar produktion och utsöndring av saliv i munhålan. Serös och slemhinnor acinar celler är det protein och slemhinnor producerar fabriker av körteln respektive och representerar ursprung salivproduktion. När syntetiseras, är de olika enzymatiska och andra proteinrika komponenter i saliv utsöndras genom en serie av duktal celler med epiteliala-typ morfologi, tills den slutligen fördrivningen av saliv genom en stor kanal in i hålrummet i munnen. Sammansättningen av saliven också ändras av duktal celler under denna process.

I manifestationen av sjukdomar som Sjögrens syndrom och i vissa kliniska situationer såsom strålbehandling för huvud-och halscancer salivproduktion från körtlar minskar dramatiskt 1,2. Den resulterande muntorrhet, en subjektiv känsla av muntorrhet, påverkar inte bara patientens förmåga att svälja och tala, utan främjar också utvecklingen av karies och kan vara socialt handikappande för patienten.

Restaureringen av salivproduktion i de ovan nämnda kliniska förhållanden utgör därför en otillfredsställda kliniska behov och som sådan ett flertal studier har visat på förnyelseförmåga spottkörtlarna 3-5. Vidare till isolering av stamceller-liknande populationer av celler från olika vävnader i musen och mänskliga kroppar 6-8 har vi visat med hjälp av den beskrivna metoden att stamceller isolerade från musen spottkörtlar kan användas för att rädda salivproduktion i bestrålade saliv körtlar 9,10. Denna upptäckt banar väg för utvecklingen av stamceller terapier för behandling av xerostomic förhållanden hos människor, och även för undersökning av spottkörtlarna som en mikromiljö som innehåller celler med multipotenta själv förnya kapacitet.

Protocol

1. Regent Förberedelser

  1. Buffert: 1% (w / v) bovint serumalbumin i Hanks balanserade saltlösning
  2. Rekonstituera enzymer. Hyaluronidas enzym: 40 mg / ml, upplöst i bufferten. Kollagenas II: 23 mg / ml, upplöst i bufferten. Använd nyberedda enzym lösningar färska för varje isolering. När upplöst, förvara vid 4 ° C fram till användning för matsmältningen.
  3. 50 mM kalciumklorid i destillerat vatten. Filtrera sterilisera genom en 0,2 um porstorlek filter.
  4. Mus salivkörtlarna (MSG) odlingsmedium: DMEM: F12 med penicillin (100 IU / mL), streptomycin (100 mikrogram / ml), glutamax (2 mm), epidermal growth factor-2 (20 ng / ml), fibroblast tillväxtfaktor -2 (20 ng / ml), N2 tillägg (1%), insulin (10 mikrogram / ml) och dexametason (1 M).

2. Mekanisk och Enzymatisk Tissue Digestion

  1. Väg dissekerade spottkörtlar.
  2. Hacka körtlar till ett homogent pappersmassa med användning av steril böjd dissektion sax i en liten petriskål.
  3. Samla malet vävnad i 14 ml rör med 1 mL buffert per 80 mg submandibular vävnad. Skölj petriskålar rent av vävnad med hjälp av några av bufferten.
  4. Lägg till ytterligare 1 mL buffert per 80 mg vävnad, följt av 25 mikroliter kollagenas II enzym lösning, 25 mikroliter hyaluronidas enzym lösning och 250 mikroliter kalciumkloridlösningen per 80 mg vävnad. Om att arbeta med stora mängder vävnad, steg från 2,4 till 2,9 kan utföras i T25 flaskor vävnadsodling för enkelhetens skull.
  5. Inkubera i en skakande vattenbad inställd på 37 ° C i 20 minuter. Ta bort rören och kör med pipett att blanda enzymet grundligt igenom vävnaden igen.
  6. Byt i vattenbad i ytterligare 20 minuter.
  7. Samla vävnad genom centrifugering vid 400 xg, i 8 minuter. Kassera supernatanten.
  8. Resuspendera i 2 ml buffert för varje 80 mg vävnad och upprepa enzym och kalciumklorid tillägg enligt ovan. Inkubera 20 minuter i skakvattenbad. Ta bort rören och kör med pipett att blanda enzymer ordentligt.
  9. Inkubera sista 20 min i skakvattenbad. Samla cellerna genom centrifugering som ovan, kassera supernatanten.

3. Tvätt steg

  1. Resuspendera varje 80 mg av vävnad i 2 ml buffert och pipett för att tvätta vävnad utan enzymer.
  2. Centrifugera som tidigare att samla in. Kassera supernatanten.
  3. Upprepa Tvätta med 1 ml buffert per 80 mg vävnad. Centrifugera att samla in, kassera supernatanten.

4. Filtrering

  1. Resuspendera vävnad lösning i 1 mL buffert per 80 mg vävnad.
  2. Tillsätt lösning på 100 ìm por-storlek filtret placeras över 50 ml Falcon rör. Applicera inte mer än 3 ml av malet vävnad lösning per kolumn, som filter kan bli blockerade. Låt sippra igenom. Ta bort filtreras material som hänger på undersidan av filtret med pipett, och lägga till filtratet.
  3. Använd spruta med 26 gauge nål för att ta filtrat från 50mL rör och gäller för 50 ìm porstorlek filter på 5 ml rör. Låt filtrera genom, att hjälpa genom att lossa locken vid behov.
  4. Centrifugrör som tidigare att samla in. Kassera supernatanten.

5. Plating och Medium

  1. Kombinera alla pellets i en volym. Räkna med hjälp av automatiserade celltalsräknare eller haemocytometer.
  2. Tavla celler vid täthet av 0,4 x 10 6 celler per brunn av 12-brunnar, eller 2,67 x 10 6 celler per T25 vävnadskultur kolv. Tillsätt 1 medelstor ml MSG till varje brunn eller 6 ml till varje T25 kolven.
  3. Inkubera vid 37 ° C. Sfärer bör vara klart synliga för dag 2.

6. Representativa resultat:

Efter två till tre dagar i kultur, kommer små aggregat av celler (salispheres) synas i de kulturer. Salispheres kommer att fortsätta att växa i storlek under en period av tio dagar i kulturen. Representant faskontrast mikroskopi bilder av salispheres visas i figur 1. Celler som förökar uttrycker stamceller-associerade markör proteiner kan isoleras från dessa områden, optimalt mellan dag 3-5 efter isolering och kan differentiering till funktionella, saliv producerande acinar celler.

Figur 1
Figur 1. Salisphere bildas in vitro. Efter mekanisk och enzymatisk spjälkning med hjälp av det nuvarande protokollet kan sfärer av ökande storlek finns i flytande kulturer. Panelerna är representativa faskontrast mikroskopi bilder av kloten från dag 0 (A), 4 (B), 7 (C) och 10 (D). Skala bar = 50 ìm.

Discussion

Den vävnadskultur metod som beskrivs här utgör en reproducerbar protokoll för isolering av stamceller som innehåller salispheres från spottkörtlarna hos möss. Studier med celler som isolerats på detta sätt har lyft fram förnyelseförmåga saliv celler körtel stamceller 9. Transplantation av hundra av c-Kit + celler som härrör från salispheres inducerad funktionell återhämtning av bestrålat musen spottkörtlar. Dessa data är spännande och ge en startpunkt för utredning av stamcellsbaserad terapi för muntorrhet. Många vägar kvar att utforska dock, inklusive full markör proteinuttryck profil stamceller, förmåga submandibular körtlar att rädda funktion bestrålade parotideallymfknutorna spottkörtlar och vice versa, och karakterisering av den förmodade in vivo stamceller nisch av cellerna. Ytterst är översättningen av detta protokoll till mänskliga vävnadsprover och den efterföljande potential för behandling av muntorrhet hos människor med hjälp av isolerade celler de mest spännande tillämpning av den beskrivna metoden.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics