L'isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Biology
 

Summary

Un protocole optimisé pour l'isolement des cellules souches de la glande salivaire de souris est décrite. La méthode emploie digestion enzymatique et mécanique, et permet d'isoler les cellules contenant salispheres avec des caractéristiques de cellules souches.

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Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

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Abstract

Mature glandes salivaires d'origine à la fois humains et de souris comprendre un minimum de cinq types de cellules, chacune d'elles facilite la production et l'excrétion de salive dans la cavité buccale. Cellules acineuses séreuses et muqueuses sont les protéines et les muqueuses des usines produisant de la glande, respectivement, et de représenter l'origine de la production de salive. Une fois synthétisés, les différentes enzymatiques et d'autres composants protéiques de la salive sont sécrétées par une série de cellules canalaires portant épithéliales de type morphologique, jusqu'à l'expulsion éventuelle de la salive à travers un conduit d'importants dans la cavité de la bouche. La composition de la salive est également modifié par les cellules canalaires pendant ce processus.

Dans la manifestation de maladies telles que le syndrome de Sjögren, et dans certaines situations cliniques telles que la radiothérapie pour les cancers de la tête et du cou, la production de salive par les glandes est considérablement réduite 1,2. La xérostomie qui en résulte, une sensation subjective de bouche sèche, affecte non seulement la capacité du patient à avaler et à parler, mais encourage également le développement de la carie dentaire et peut être socialement invalidante pour celui qui souffre.

La restauration de la production de salive dans les conditions ci-dessus cliniques représente donc un besoin clinique non satisfait, et comme tel, plusieurs études ont démontré la capacité de régénération des glandes salivaires 3-5. Suite à l'isolement des cellules souches, comme les populations de cellules de différents tissus au sein de la souris et le corps humains 6-8, nous avons montré en utilisant la méthode décrite que les cellules souches isolées à partir de glandes salivaires de souris peut être utilisée pour sauver la production de salive dans salivaires irradiées glandes 9,10. Cette découverte ouvre la voie pour le développement de base de cellules souches thérapies pour le traitement de la xérostomie conditions chez les humains, et aussi pour l'exploration de la glande salivaire comme un microenvironnement des cellules contenant des multipotentes auto-renouvellement des capacités.

Protocol

1. Préparation Régent

  1. Tampon: 1% (p / v) de sérum albumine bovine dans une solution saline équilibrée de Hank
  2. Reconstituer les enzymes. L'enzyme hyaluronidase: 40mg / ml, dissous dans du tampon. Collagénase II: 23 mg / mL, dissous dans du tampon. Utiliser des solutions fraîchement préparées enzyme fraîche pour chaque isolement. Une fois dissous, conserver à 4 ° C jusqu'à leur utilisation pour la digestion.
  3. 50 mM de chlorure de calcium dans l'eau distillée. Stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 uM taille des pores.
  4. Souris moyennes salivaires des glandes de la culture (MSG): DMEM: F12 avec de la pénicilline (100 UI / ml), streptomycine (100 ug / ml), glutamax (2 mM), facteur de croissance épidermique-2 (20 ng / ml), facteur de croissance des fibroblastes l'insuline -2 (20 ng / ml), N2 complément (1%), (10 pg / ml) et la dexaméthasone (1 uM).

2. Digestion des tissus mécanique et enzymatique

  1. Peser les glandes salivaires disséquées.
  2. Hacher les glandes en une pâte homogène à l'aide des ciseaux de dissection stériles courbes dans une petite boîte de Petri.
  3. Recueillir tissus hachés dans 14 ml tubes, en utilisant 1 ml de tampon par les tissus sous-maxillaire 80mg. Rincez les boîtes de Pétri nettoyage de tissus en utilisant certains des tampons.
  4. Ajouter un autre 1 mL de tampon par 80 mg de tissu, suivis de 25 uL solution de collagénase enzyme II, 25 uL solution enzyme hyaluronidase et 250 uL solution de chlorure de calcium par 80 mg de tissu. Si vous travaillez avec de grandes quantités de tissu, les étapes 2.4 à 2.9 peuvent être effectuées dans des flacons T25 culture de tissu pour plus de commodité.
  5. Incuber dans un bain-marie secouant fixée à 37 ° C pendant 20 minutes. Retirer les tubes et les triturent à la pipette pour mélanger soigneusement l'enzyme à travers le tissu nouveau.
  6. Remplacer dans un autre bain-marie pendant 20 min.
  7. Recueillir les tissus par centrifugation à 400 xg, pendant 8 minutes. Rejeter le surnageant.
  8. Remettre en suspension dans 2 mL de tampon pour chaque tissu de 80 mg, et répétez l'enzyme et l'ajout de chlorure de calcium comme ci-dessus. Incuber 20 minutes en secouant bain-marie. Retirer les tubes et les triturent à la pipette pour mélanger soigneusement les enzymes.
  9. Incuber pour la finale de 20 min en secouant bain-marie. Recueillir les cellules par centrifugation comme ci-dessus, éliminer le surnageant.

3. Étapes de lavage

  1. Resuspendre chaque 80 mg de tissu en 2 mL de tampon et une pipette de laver le tissu sans enzymes.
  2. Centrifuger comme précédemment à collecter. Rejeter le surnageant.
  3. Répétez les laver en utilisant une mémoire tampon mL par 80 mg de tissu. Centrifugeuse à recueillir, éliminer le surnageant.

4. Filtrage

  1. Solution de tissus Remettre en suspension dans 1 ml de tampon par 80 mg de tissu.
  2. Ajouter la solution à 100 um taille des pores du filtre placé sur le tube Falcon de 50 ml. Ne pas appliquer plus de 3 ml de solution tissus hachés par colonne, comme des filtres peuvent être bloquées. Laisser s'infiltrer à travers. Enlever la matière filtrée accroché sur le dessous du filtre à la pipette, et ajouter à filtrat.
  3. Utilisez une seringue avec une aiguille de calibre 26 pour prendre filtrat de 50 ml tubes et d'appliquer des filtres à 50 um taille des pores sur les tubes de 5 ml. Laisser filtrer à travers, en aidant en desserrant les couvercles si nécessaire.
  4. Tubes à centrifuger comme précédemment à collecter. Rejeter le surnageant.

5. Placage et moyennes

  1. Combiner tous les pastilles dans un seul volume. Comptez utilisant compteur de cellules automatisé ou hémocytomètre.
  2. Cellules de la plaque à une densité de 0,4 x 10 6 cellules par puits de 12 puits plaque, ou 2,67 x 10 6 cellules par flacon de culture tissulaire T25. Ajouter une moyenne MSG ml à chaque puits ou 6 ml dans chaque flacon T25.
  3. Incuber à 37 ° C. Sphères doit être clairement visible par jour 2.

6. Les résultats représentatifs:

Après deux à trois jours de culture, de petits agrégats de cellules (salispheres) sera apparente dans les cultures. Salispheres va continuer à croître en taille, sur une période de dix jours dans la culture. Représentant des images de microscopie à contraste de phase d'salispheres sont présentés dans la figure 1. Les cellules en prolifération exprimant des protéines marqueurs de cellules souches associées peuvent être isolés à partir de ces sphères, de manière optimale entre l'isolement jours après 3-5, et sont capables de différenciation en cellules fonctionnelles salive, acineuses produisant.

Figure 1
Figure 1. Salisphere la formation in vitro. Après la digestion mécanique et enzymatique en utilisant le protocole actuel, les sphères de la taille croissante peut être trouvé dans les cultures flottant. Les panneaux sont représentatives d'images de microscopie à contraste de phase de sphères de quelques jours 0 (A), 4 (B), 7 (C) et 10 (D). Barre d'échelle = 50 microns.

Discussion

La méthode de culture de tissus décrit ici représente un protocole reproductible pour l'isolement des cellules souches contenant salispheres des glandes salivaires de souris. Les études utilisant des cellules isolées de cette manière ont mis en évidence la capacité de régénération de la glande salivaire cellules souches 9. La transplantation d'une centaine de c-kit + cellules dérivées de la salispheres induite récupération fonctionnelle des glandes salivaires de souris irradiées. Ces données sont intéressantes et fournissent un point de départ pour l'enquête sur les cellules souches pour la thérapie basée xérostomie. Beaucoup de pistes restent à explorer cependant, y compris le profil d'expression marqueur protéique complète des cellules souches, la capacité des glandes sous-maxillaires pour sauver la fonction des glandes parotides irradiés salivaires et vice versa, et la caractérisation de la putatifs dans une niche de cellules souches in vivo des les cellules. Finalement, la traduction de ce protocole d'échantillons de tissus humains et le potentiel ultérieur pour le traitement de la xérostomie chez les patients humains en utilisant des cellules isolées est l'application la plus excitante de la méthode décrite.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

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References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
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    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

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