مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

Bioengineering
 

Summary

يوصف تطوير المقايسات على منصة مخصصة لVIBE أكثر حساسية والنتائج واستنساخه في مصفوفات الآلي المعقدة. خرطوشة عالمي يسمح المقايسات تكييفها بسهولة للاستخدام مع فحوصات مخصصة. هذا التنوع يتيح التطور السريع والتحقق من صحة الرواية أو الإصدارات المقايسات الآلي دليل المقايسات القائمة ، والمتمثلة في هذا الفيديو.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

غالبا ما تكون محدودة فحوصات مخصصة للبروتينات فريدة لاكتشاف دليل تستهلك الوقت والتقنيات الكميات مثل ELISA أو البقع الغربية نظرا لتعقيد وضع على منصات بديلة. BioScale غشاء الصوتية الملكية MicroParticle (AMMP) التكنولوجيا يسمح المناعية شطيرة المتقدمة بسهولة للاستخدام على منصة VIBE ، وتوفير أفضل الحساسية ، واستنساخ ، وتشغيل الآلي. على النحو المنصوص عليه على سبيل المثال ، هذا البروتوكول يحدد الإجراء مخصص لوضع الهامستر الصيني بروتين الخلية المبيض ، المضيف (تشو المندوبية) مقايسة. ويمكن تتبع المبادئ العامة التي وردت هنا من أجل تطوير مجموعة واسعة من المناعية.

وهو مستضد AMMP التدابير تركيز الفحص عن طريق قياس التغيرات في وتيرة التذبذب الناجمة عن ربط المجهرية الدقيقة لسطح حساس لحساب. وهو يتألف من أربعة عناصر رئيسية هي : (1) خرطوشة تحتوي على رقاقة الاستشعار functionalized ثمانية (2) الأجسام المضادة المسماة المغناطيسي المجهرية الدقيقة ، (3) ناشبة الأضداد الموسومة التي تربط على سطح الرقاقة functionalized (4) تحتوي على عينات من مستضد الفائدة. جهاز الاستشعار البيولوجي BioScale هو جهاز الرنين أن يحتوي على ثمانية مسارات فردية مع الأغشية fluidic منفصلة. الأغشية تغيير التردد التذبذب ردا على تراكم الكتلة على السطح ، ويستخدم هذا التردد لتغيير quantitate مقدار كتلة المضافة.

لتسهيل استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المناعية هو functionalized المجس مع الأضداد المضادة للالناشبة. يتم تعديل مقايسة الأضداد محددة من خلال اقتران التساهمية من علامة ناشبة لأحد الأجسام المضادة والبيوتين إلى أخرى. يستخدم التسمية البيوتين لربط الأجسام المضادة لstreptavidin الخرز المغناطيسي الذي يقترن ، في تركيبة مع الأضداد الموسومة ناشبة ، تستخدم لالتقاط الحليلة في شطيرة. مجمع بربط الشريحة من خلال التفاعل anti-hapten/hapten. في نهاية كل تجربة تشغيل أجهزة الاستشعار يتم تنظيفها مع حمض مخفف تمكين التحليل المتسلسل من أعمدة من لوحة 96 - جيدا.

هنا ، نقدم طريقة لوضع مخصص مقايسة AMMP تشو المندوبية العمليات الحيوية من أجل التنمية. ويمكن تطوير أو تعديل المقايسات AMMP المقايسات القائمة في المقايسات AMMP تقديم أداء أفضل (استنساخ ، والحساسية) في عينات معقدة وتقليل الوقت المشغل. بروتوكول يبين الخطوات من أجل التنمية واستعراض نتائج مناقشة الفرع التمثيلي. للحصول على شرح أكثر تعمقا التحسين مقايسة والمعلمات الاتصال BioScale التخصيص. تقدم هذه المجموعة عام المقايسات تطوير العمليات البيولوجية مثل البروتينات المتبقية ألف عيار المنتج ، وتشو المندوبية.

Protocol

1. إعداد MicroParticle

  1. أجسام التسمية به البيوتين NHS الكيمياء
  2. تحديد درجة Biotinylation
  3. المتقارن الخرز Streptavidin مع جسم Biotinylated
    1. Resuspend حبات في القنينة الأصلي لمدة 1-2 دقائق vortexing
    2. قسامة حجم المطلوب من الخرز في أنبوب microcentrifuge
    3. تغسل حبات 3 مرات مع PBST :
      1. وضع أنبوب يحتوي على حبات على مغناطيس لمدة 2 دقيقة
      2. إزالة طاف التي تطلع مع أنبوب على المغناطيس. يجب الحرص على عدم تعطيل الخرز
      3. إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة 1 مل PBST
      4. دوامة لمدة 20 ثانية لresuspend الخرز
      5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان لإزالة الغطاء من الخرز
      6. 2.3.1-2.3.5 كرر مرتين
    4. بعد غسل المكان الثالث في أنبوب على المغناطيس ونضح في PBST
    5. إضافة إلى الضد biotinylated الخرز وresuspend
    6. إذا لزم الأمر جعل حجم الأجسام المضادة biotinylated تصل إلى 300 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. إذا كان حجم الأجسام المضادة هي بالفعل أكبر من 300 ميكرولتر لا تضيف أي برنامج تلفزيوني
    7. احتضان تعليق حبة / الضد لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر دوامة أنبوب أو المدورة
    8. تغسل 3 مرات مع PBST كما في الخطوة 3.
    9. كتلة الخرز مع جيش صرب البوسنة biotinylated
      1. بعد غسل الثالثة ، يضاف 10 ميكروغرام / مغ biotinylated جيش صرب البوسنة ، وضبط حجم إلى 300 ميكرولتر مع PBS إذا لزم الأمر ، واحتضان مع الانفعالات لمدة 30 دقيقة
    10. تغسل 3 مرات مع PBST كما في الخطوة 3
    11. Resuspend الخرز في 100 ميليلتر من جيش صرب البوسنة PBS/0.05 ٪. يمكن إضافة أزيد الصوديوم للتخزين على المدى الطويل
  4. باستخدام معيار بروتوكولات فلوريسئين NHS ، fluoresceinate على الضد كاشف
  5. تحديد درجة Fluorescination

2. المندوبية -- التنمية

  1. إعداد حلول العمل :
    1. فلوريسئين جسم المسمى (FL - AB) : معظم تشو المندوبية المقايسات استخدام FL - آب بتركيز نهائي من 400 نانوغرام / مل. يضاف FL - أب كما ¼ من حجم الفحص النهائي ، وبالتالي فإن تركيز المحلول العمل هو 1.6 ميكروغرام / مل. يعد هذا الحل عن طريق تمييع شحم الأسهم مع الخرزة BioScale / مخفف شحم.
    2. الخرز : معظم تشو المندوبية المقايسات استخدام حبات بتركيز نهائي 2x10 5 حبات / مليلتر. الكاشف يشكل ربع حبة من حجم الفحص النهائي ، وبالتالي تركيز العمل هو الحل 8X10 5 حبات / مليلتر. يعد هذا الحل عن طريق تمييع الأسهم حبة حبة مع BioScale / مخفف شحم. دوامة السهم حبة جيدا للتأكد من كل حبات في تعليق مسبق لإزالة أحد قسامة.
    3. تشغيل المخزن المؤقت : تكوين المخزن المؤقت تشغيل قد تضطر إلى أن يكون الأمثل للأن الأجسام المضادة المستخدمة لتطوير الفحص ، ومع ذلك وضعت عدة تشو المندوبية المقايسات باستخدام 10 العازلة HEPES ملم ، 1 ٪ توين ، ودرجة الحموضة 7.5. وقد وضعت BioScale مضافة لتشغيل المخزن المؤقت (المرفق مع عدة التنمية) التي تضاف إلى المخزن المؤقت إلى تركيز من 1 ٪ قبل استخدامها.
  2. تمييع ومعايرة العينات مع عينة BioScale مخفف.

3. VIBE نظام تعيين لأعلى

  1. تشغيل محطة العمل على VIBE
  2. ربط نظام العرض والنفايات
  3. رئيس النظام
  4. اضافة الى وجود خرطوشة VIBE
  5. مسار أنابيب
  6. إعداد قالب الفحص عن طريق ملء ورقة كتب عليها "إعداد نموذج". BioScale يوفر القدرة على قالب واحد مقايسة لكل محطة عمل مقايسة VIBE. وهذا يسمح للمستخدم لتحرير وحفظ ملاحظات محددة في ورقة "ملاحظات" من القالب لفحوصات مختلفة الاحتفاظ بسجل كامل للتجربة.
  7. مجموعة أولية تصل مقايسة قالب : بيغن عن طريق ملء الجدول (أعلى الزاوية اليسرى) من مجموعة تركيز المعايير في مقايسة في ورقة "نموذج الإعداد".
  8. المقبل ، أدخل معلومات إضافية في الجدول إلى اليمين للمعايير (العمود البسيط الإعداد القراءة ، إضافة الكاشف واحد واثنين من الاجهزة الكاشف إضافة) لإرشاد محطة VIBE كيف عينات طويلة تحتاج إلى احتضان ، وكم هو حجم الكاشف على أن يتم تحويلها ، وكيف تراكم طويل العينة يجب أن يكون ، وما إذا كان تكييف أجهزة الاستشعار وإزالة التلوث من تحقيقات وخرطوشة ضرورية ، الخ
  9. ملء تخطيط لوحة.
  10. تحميل العينة / الكواشف في لوحات. سيتم توفير كميات VIBE المطلوبة لوحة كاشف. يمكن أن يختلف حجم العينة ، ولكن في نصف حجم فحص ما مجموعه 120 ميكرولتر هو مكان انطلاق جيدة.
  11. تطبيق يغطي لوحة. تحميل لوحات على سطح محطة العمل.
  12. تشغيل مقايسة بدء المعالج ، انتقل من خلال المعالج وبدء الفحص.

4. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1 : AMMP المناعية ساندويتش على محطة العمل VIBE ، وهي مقايسة AMMP التدابير تركيز المستضد. ويقاس عند إشارة الضد مستضد حبة ناشبة بربط جهاز استشعار عن طريق ناشبة / التفاعل مكافحة الناشبة. التجدد يرتفع مرة أخرى إلى استشعار الدولة بداية من خلال إزالة المعقدات المناعية.

الشكل 2
الشكل 2 : شو المندوبية معايرة الفحص AMMP منحنى

الشكل 2 أعلاه هو مثال لمنحنى CHO AMMP المندوبية معايرة الفحص. يمكن إجراء تحليل في عينات من جميع أنحاء تنقية دفق بما في ذلك المفاعل مع دقة عالية والتكاثر.

الشكل 3
الشكل 3 : البروتين معايرة الفحص AMMP منحنى

الرقم 3 هو منحنى المعايرة لبروتين المتبقية والفحص AMMP ، غناء مع بروتين VIBE المتبقية ألف طقم الفحص. يمكن استخدام طقم نفس أسرع مقايسة مع فترة حضانة لمدة 30 دقيقة ، أو لنتائج أكثر حساسية ونطاق أوسع ديناميكية مع فترة أطول الحضانة دون فقدان الدقة أو دقة ، وكلاهما وعادة ما تكون أفضل من لELISA ما يعادلها في المستخدمين يد

الشكل 4
الشكل 4 : المنتج AMMP الفحص العيار الحجمي

يمكن أيضا أن تستخدم محطة VIBE لمنتج مقايسة العيار الحجمي ، والنتائج هو مبين في الشكل 4. أداء مختلف عن AMMP فحوصات أخرى ، فإن هذا الفحص لا يتطلب العلاج عينة أخرى من تخفيف بسيط ، أو الخرز ، ولقد تم التحقق من الكميات في "لا تدور" العينات التي تحتوي على أكثر من 10 ملايين الخلايا خلال مجموعة واسعة من viabilities.

الشكل 5
الشكل 5 : AMMP منحنى الفحص القياسية لفحص العلامات البيولوجية GST - Gadd34

هو مبين في الشكل (5) هو منحنى مستوى إشارة التي حصل عليها BioAnalyzer VIBE (لوحة أ) أو باستخدام تكنولوجيا AlphaScreen المؤتلف GST - Gadd34. وكانت النتائج على منصة VIBE حوالي سجل أكثر حساسية باستخدام الأجسام المضادة نفسها. AMMP روافع قياس الجسيمات الأكبر بعد أقل من الفوائد لا تزال التقاط مرحلة الحل وكشف عن تشكيل تعقيدا.

الشكل 6
الشكل 6 : منحنى AMMP الفحص القياسية لضريبة السلع والخدمات ، في عينة الورم Gadd34

في الشكل (6) ، تم اختبار تحريض Gadd34 من CWR22 xenografts في وجود أو عدم وجود المانع a proteasome boronate وتحليلها من قبل أي من BioAnalyzer VIBE في (لوحة أ) أو AlphaScreen (لوحة باء). كانت منصة VIBE حساسة قادرة على انتاج والنتائج استنساخه في مروي كان الورم في الجسم الحي في حين xenografts إشارة AlphaScreen ميكروغرام مع زيادة البروتين.

هذا المثال يدل على قوة التكنولوجيا AMMP في عينات معقدة للغاية. يرجع ذلك إلى الكشف عن رقاقة حساسة وعالية الكفاءة من المغناطيس بالقرب من الرقائق ، ويمكن أن انخفاض أعداد المجهرية الدقيقة المغناطيسي بكفاءة وبتكاثر يبحثون عن هدف وفرة منخفضة وسط تعقيد الخلوية lysed (بما في ذلك كواشف تحلل) والحطام في الدم.

Discussion

الأمثلة السالفة الذكر لتبين النتائج AMMP الكمية حساسة للغاية في عينات معقدة. هذا الأداء ، عند تسليمها مع سهولة والسيطرة على الكواشف التنسيق في هذا النظام هو تمكين لمجموعة متنوعة من التطبيقات. قد تكون هذه التطبيقات لهدف محدد ، كما في Gadd34 في الورم ، أو عامة لطائفة من الأهداف ، كما هو الحال في الخلية المضيفة وكشف عن البروتين في عينات من الكميات التي تعبر تنقية دفق. فيبي انخفاض النفقات العامة جنبا إلى جنب مع AMMP منصة مرنة للغاية ويوفر أداة قوية لتقديم فحوصات حرجة.

Disclosures

ويعمل واضعو هذه المادة Bioscale ، وشركة التي تنتج بعض الأدوات والكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics