开发自定义的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白检测使用声膜微粒子技术

Bioengineering
 

Summary

自定义检测更敏感,重复性好,自动化的结果复杂基质中的ViBE平台上的发展是描述。通用墨盒可以检测,可以很容易地使用自定义检测适应。这种多功能性,使快速发展和验证新颖的实验或现有的手工检测的自动化版本,在这个视频为例。

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Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

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Abstract

定制独特的蛋白质检测耗时的手动检测和定量分析技术,如ELISA或Western印迹由于备用平台上开发的复杂性往往是有限的。 BioScale专有的声学膜微粒(AMMP)技术允许夹心免疫分析可以很容易地使用盛传平台上开发,提供更好的灵敏度,重现性好,自动化操作。作为一个例子,这个协议概述了开发一个自定义的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白(CHO - HCP)检测程序。这里列出的一般原则可以遵循的多种免疫的发展。

AMMP检测措施,通过测量振荡频率的变化所造成的微粒具有约束力的传感器的表面来计算的抗原浓度。它包括四个主要部分组成:(1),其中包含一个功能化的8个传感器芯片的墨盒(2)抗体标记的磁性微粒,(3)半抗原标记官能芯片表面(4)样品中含有的抗原抗体结合兴趣。 BioScale的生物传感器是一个共振的设备,其中包含8个单独的流体路径的个别薄膜。在表面上的大规模积累和使用这个频率的变化是定量适量补充质量反应膜改变振荡频率。

为了方便使用多种传感器的免疫功能化与抗半抗原抗体。检测特异性抗体是通过共价结合到一个半抗原标记的抗体和生物素的其他修改。生物素标签是用来绑定的抗体,链霉亲和,与半抗原标记的抗体结合,是用来捕获待测在三明治加上磁珠。复杂的结合通过anti-hapten/hapten交互芯片。在每次实验结束运行,传感器是用稀的酸可从96孔板的列的顺序分析清洗。

在这里,我们现在开发一个自定义的CHO - HCP AMMP生物工艺开发的检测方法。发展AMMP检测到AMMP检测或修改现有的检测,可以提供更好的性能在复杂的样品,并减少操作时间(重现性,灵敏度)。该协议显示了发展的步骤,并讨论部分评论代表性的结果。对于检测的优化和定制参数更深入的解释,请联系BioScale。这个套件提供了通用的生物过程,如残留的产品滴度,蛋白A,CHO - HCP的发展分析。

Protocol

1。微粒的制备

  1. 标签抗体,用生物素NHS的化学
  2. 的生物素化程度的测定
  3. 与生物素抗体的共轭链霉亲和素珠
    1. 1-2分钟涡旋重悬在原瓶珠
    2. 离心管分装成所需的珠子数量
    3. 洗磁珠3次,用PBST:
      1. 放置2分钟,其中包含磁铁珠管
      2. 吸磁铁管取出上清液。要小心,不要破坏珠
      3. 取出磁铁管,并加入1 mL PBST
      4. 20秒的旋涡悬浮珠
      5. 离心5秒,删除第珠
      6. 重复2.3.1-2.3.5两倍多
    4. 后的第三洗放在磁铁管,吸PBST
    5. 添加生物素抗体的珠子和重悬
    6. 如果必要的话,带来的生物素抗体量高达300μL用PBS。如果抗体量已大于300μL,不添加任何PBS
    7. 30分钟,在室温下孵育旋涡振动筛或管肩珠/抗体悬挂
    8. 用PBST洗3次,在第3步。
    9. 与生物素标记的牛血清白蛋白座珠
      1. 第三洗净后增加10微克/毫克生物素标记的牛血清白蛋白,调节音量至300μL,用PBS如有必要,搅拌孵育30分钟
    10. 用PBST洗3次,在第3步
    11. 在100μLPBS/0.05%BSA重悬珠。长期贮存,可加入叠氮化钠
  4. 使用标准的NHS的荧光协议,fluoresceinate探测器抗体
  5. 确定的Fluorescination程度

2。 HCP - 发展

  1. 准备工作的解决方案:
    1. 荧光标记抗体(FL - AB):大多数CHO HCP的检测使用FL -抗体的终浓度为400纳克/毫升。 FL - Ab是添加作为最终的检测量的四分之一,因此工作溶液的浓度为1.6微克/毫升。准备BioScale珠/松弛稀释剂稀释松弛股票这个解决方案。
    2. 珠:大多数CHO HCP的检测,使用珠在2X10 5珠/ ml的终浓度。珠试剂构成最终的检测量的四分之一,因此工作溶液的浓度 8x10的5珠/毫升。准备BioScale珠/松弛稀释剂稀释珠股票这个解决方案。涡珠的股票,以确保所有的珠子悬浮之前卸下等分。
    3. 运行缓冲液:运行缓冲液的组成可能要用于开发检测的抗体进行了优化,然而几个CHO HCP的检测已开发利用10 mM的HEPES缓冲液,1%吐温,pH值7.5。 BioScale已研制出一种添加剂为运行缓冲液(与开发套件提供),这是加入浓度为1%,在使用前的缓冲区。
  2. BioScale样品稀释液稀释的标准品和样品。

3。的ViBE系统设置

  1. 打开盛传工作站
  2. 连接系统的供应和废物
  3. 总理系统
  4. 插入的ViBE盒
  5. 管道路由
  6. 准备通过填写标有“示例设置”表检测模板。 BioScale提供的能力有一个检测模板为每个的ViBE工作站检测。这允许用户编辑和保存模板不同的分析,保持一个完整的实验记录表的“注释”中的具体说明。
  7. 初始检测模板设置:首先填写表(左上角)的浓度范围在“示例设置”表的检测标准。
  8. 下一步,输入表中的其他信息标准的权利(简单列读取设置,一个试剂添加,两种试剂的添加设置)指示多久样品需要孵化盛传工作站,试剂量是多少转移,样本的积累,需要多久,是否是必要的传感器信号调理和净化探头和碳粉盒等
  9. 填写板布局。
  10. 装入样品/试剂板。盛传将提供所需的试剂板卷。样品量可以有所不同,但在一个120μL的总检测量的一半,是一个很好的起点。
  11. 应用板覆盖。加载到工作站甲板板。
  12. 运行检测启动向导,通过向导,并开始实验。

4。代表性的成果

图1
图1:AMMP三明治免疫测定法 一个的ViBE工作站上,AMMP检测措施抗原浓度。信号测量珠抗原半抗原抗体结合时,传感器通过半抗原/抗半抗原的相互作用。再生带来的传感器回到开始的状态,消除免疫复合物。

图2
图2:CHO - HCP AMMP含量的校正曲线

上面的图2是一个CHO HCP AMMP检测校准曲线的一个例子。可以分析样品中,来自全国各地的净化流,包括反应器,精度高,重复性。

图3
图3:蛋白A AMMP含量的校正曲线

图3是一个补遗蛋白A AMMP与VIBE剩余蛋白A检测试剂盒进行检测,校准曲线。在相同的套件可以被用来为一1 30分钟的孵育期更快的检测,或者更敏感的结果,并与1,不丧失精度或准确度较长的孵化期,这两者是通常优于相当于ELISA法在用户的更宽的动态范围“手

图4
图4:产品滴度AMMP含量

盛传工作站也可用于一个产品滴度检测,结果如图4所示。不同的表现比其他AMMP实验,这个实验并不需要样品处理较简单的稀释,或珠,并已在“旋转”包含广泛的存活率超过10万个单元格的样品定量验证。

图5
图5:AMMP含量GST - Gadd34生物标志物检测的标准曲线

在图5所示的是一种信号盛传生物分析仪(A组)或使用重组GST - Gadd34的AlphaScreen技术获得的标准曲线。盛传平台上的结果约日志使用相同的抗体更敏感。 AMMP利用测量较大的颗粒较少,尚未从溶液相捕获和检测复合物的形成仍好处。

图6
图6:AMMP含量为GST - Gadd34在肿瘤样本的标准曲线

在图6中,CWR22异种移植诱导Gadd34从测试盛传生物分析仪(A组)或的AlphaScreen(B组)分析了硼蛋白酶抑制剂的存在或缺乏。盛传平台能够生产的AlphaScreen信号,而体内的肿瘤异种移植的淬火,增加微克蛋白质,灵敏度高,重复性的结果。

这个例子显示了在高度复杂的样品AMMP技术的力量。由于敏感的检测芯片和磁铁靠近芯片的高效率,低磁性微粒可以有效地再现清除之中裂解细胞(包括裂解试剂)和血液碎片的复杂性,低丰度的目标。

Discussion

前面的例子表明AMMP的高度敏感复杂样品的定量结果。这格式化成试剂系统的易用性和控制交付时的表现,使各种应用。这些应用程序可能为特定目标,在Gadd34在肿瘤,或为目标的频谱,在宿主细胞蛋白的检测和定量样品中的跨净化流,通用。结合与高度灵活的AMMP的低开销的ViBE平台提供了一个功能强大的工具提供关键检测。

Disclosures

这篇文章的作者是受雇于Bioscale,公司产生一些本文中使用的仪器和试剂。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

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