Développement de ovaire de hamster chinois-hôte dosages de protéines cellulaires utilisant la technologie acoustique microparticules membranaires

Bioengineering
 

Summary

Développement de tests personnalisés sur la plate-forme ViBE pour les plus sensibles, reproductibles, des résultats automatisé dans des matrices complexes est décrite. La cartouche universelle permet des dosages pour être facilement adapté pour une utilisation avec des dosages personnalisés. Cette polyvalence permet un développement rapide et la validation de nouveaux tests ou de versions automatisées de tests existants manuel, illustré dans cette vidéo.

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Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

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Abstract

Dosages personnalisés pour les protéines uniques sont souvent limitées à la détection manuelle du temps et des techniques de quantification telles que ELISA ou Western blot en raison de la complexité du développement sur les plates-formes de substitution. BioScale de membrane exclusive microparticules acoustique (PMMA) technologie permet immunodosages sandwich pour être facilement développé pour une utilisation sur la plate-forme ViBE, offrant une meilleure sensibilité, la reproductibilité et un fonctionnement automatisé. À titre d'exemple, ce protocole définit la procédure d'élaboration d'une coutume chinoise protéine cellulaire d'ovaire de hamster-Host (CHO-HCP) dosage. Les principes généraux énoncés ici peuvent être suivies pour le développement d'une grande variété de dosages immunologiques.

Une concentration de dosage d'antigène AMMP mesures en mesurant les changements dans la fréquence d'oscillation provoquée par la liaison de microparticules à la surface du capteur pour calculer. Il se compose de quatre éléments principaux: (1) une cartouche qui contient une puce de capteur fonctionnalisés huit (2) anticorps marqué microparticules magnétiques, (3) d'anticorps haptène marqués qui se lie à la surface de la puce fonctionnalisés (4) échantillons contenant l'antigène de intérêt. Biocapteur BioScale est un appareil de résonance qui contient huit membranes individuels avec des chemins séparés fluidiques. Les membranes changement de fréquence d'oscillation en réponse à la masse qui s'accumule sur la surface et ce changement de fréquence est utilisée pour quantifier la quantité de masse ajoutée.

Pour faciliter l'utilisation dans une grande variété de tests immunologiques de la sonde est fonctionnalisé avec un anticorps anti-haptène. Anticorps spécifiques de dosage ont été modifiés par la conjugaison covalente d'un tag haptène à un anticorps et de la biotine à l'autre. L'étiquette biotine est utilisé pour lier l'anticorps à la streptavidine couplée billes magnétiques qui, en combinaison avec l'anticorps haptène marqué, sont utilisés pour capturer l'analyte dans un sandwich. Le complexe se lie à la puce grâce à l'interaction anti-hapten/hapten. A la fin de chaque essai exécuté les capteurs sont nettoyés avec un acide dilué permettant l'analyse séquentielle des colonnes d'une plaque de 96 puits.

Ici, nous présentons la méthode pour développer une coutume CHO-HCP test AMMP pour le développement de bioprocédés. Développer des dosages PMMA ou en modifiant des dosages existants dans des dosages PMMA peut offrir de meilleures performances (reproductibilité, sensibilité) dans des échantillons complexes et le temps de l'opérateur réduit. Le protocole décrit les étapes de développement et de la section de discussion critiques des résultats représentatifs. Pour une explication plus approfondie de l'optimisation des essais et des paramètres de personnalisation de contact BioScale. Ce kit offre générique de tests de développement de bioprocédés comme les protéines résiduelles Un titre produit, et CHO-HCP.

Protocol

1. Préparation de microparticules

  1. Anticorps étiquette utilisant la biotine NHS Chimie
  2. Détermination du degré de biotinylation
  3. Conjugué avec des billes de streptavidine anticorps biotinylé
    1. Resuspendre les perles dans le flacon d'origine par vortex pendant 1-2 minutes
    2. Aliquoter le volume souhaité de perles dans un tube à centrifuger
    3. Laver les billes 3 fois avec PBST:
      1. Placer le tube contenant les billes sur l'aimant pendant 2 minutes
      2. Retirer le surnageant par aspiration avec le tube sur l'aimant. Soyez prudent de ne pas perturber les perles
      3. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 1 ml de PBST
      4. Vortex pendant 20 secondes pour remettre en suspension les perles
      5. Centrifuger pendant 5 secondes pour enlever les perles de la PAC
      6. Répéter deux fois plus 2.3.1-2.3.5
    4. Après le troisième lavage lieu le tube sur l'aimant et aspirer le PBST
    5. Ajouter anticorps biotinylé aux billes et resuspendre
    6. Si nécessaire porter le volume de l'anticorps biotinylé jusqu'à 300 uL de PBS. Si le volume d'anticorps est déjà supérieure à 300 ul ne pas ajouter de PBS
    7. Incuber la suspension de billes / anticorps pendant 30 minutes à température ambiante sur l'agitateur vortex ou le tube des rotateurs
    8. Laver 3 fois avec PBST comme dans l'étape 3.
    9. Bloc perles avec biotinylé BSA
      1. Après le troisième lavage ajouter 10 pg / mg de BSA biotinylé, ajuster le volume à 300 ul avec du PBS, si nécessaire, et incuber sous agitation pendant 30 minutes
    10. Laver 3 fois avec PBST comme dans l'étape 3
    11. Resuspendre les perles dans 100 uL de BSA PBS/0.05%. L'azide de sodium peut être ajouté pour le stockage à long terme
  4. Utilisation de la norme du NHS protocoles fluorescéine, fluoresceinate l'anticorps détecteur
  5. Déterminer le degré de Fluorescination

2. HCP - Développement

  1. Préparer des solutions de travail:
    1. Anticorps marqué à la fluorescéine (FL-Ab): La plupart des cellules CHO-HCP dosages utilisent Fl-Ab à une concentration finale de 400 ng / mL. Le FL-Ab est ajouté en tant que ¼ du volume d'essai final, donc la concentration de la solution de travail est de 1,6 mg / ml. Préparer cette solution en diluant avec de stock Flab BioScale billes / Flab diluant.
    2. Perles: La plupart des cellules CHO-HCP dosages utilisent des billes à une concentration finale de 2x10 5 billes / mL. Le réactif perles constitue ¼ du volume d'essai final, donc la concentration de la solution de travail est 8x10 5 billes / mL. Préparer cette solution en diluant stock de billes avec billes BioScale / Flab diluant. Vortex du stock de perles et de s'assurer que toutes les perles sont en suspension avant de retirer une partie aliquote.
    3. Tampon: La composition du tampon de migration peut être optimisé pour les anticorps utilisés pour développer le test, mais plusieurs CHO-HCP tests ont été développés en utilisant 10 mM de tampon HEPES, 1% de Tween, pH 7,5. BioScale a développé un additif pour le tampon courant (fournie avec le kit de développement) qui est ajouté au tampon à une concentration de 1% avant de l'utiliser.
  2. Diluer étalons et d'échantillons avec le diluant échantillon BioScale.

3. ViBE Système Set Up

  1. Tournez le Workstation Vibe
  2. Branchez l'alimentation du système et des déchets
  3. Premier système
  4. Insérez une cartouche ViBE
  5. Route des tubes
  6. Préparer modèle de test en remplissant la feuille intitulée «Exemple de configuration". BioScale offre la possibilité d'avoir un modèle de test pour chaque dosage Workstation ViBE. Cela permet à l'utilisateur de modifier et enregistrer des notes spécifiques dans les "Notes" feuille de modèle pour des dosages différents conserver un dossier complet de l'expérience.
  7. Modèle de test initial mis en place: Commencez par remplir le tableau (en haut à gauche) de la gamme de concentration de ces normes dans le test dans le "Setup Sample" feuille.
  8. Ensuite, entrer des informations supplémentaires dans le tableau à droite de l'normes (Configuration simple colonne Lire, Ajouter un réactif et réactif Deux configurations Ajouter) pour charger le Workstation ViBE combien de longs échantillons doivent incuber, quel volume de réactif doit être transféré , combien de temps l'accumulation de l'échantillon doit être, et si conditionné capteur et la décontamination des sondes et des cartouches sont nécessaires, etc
  9. Remplissez le disposition de la plaque.
  10. Charger l'échantillon / réactifs en plaques. La Vibe fournira les volumes nécessaires à la plaque de réactif. Le volume d'échantillon peut varier, mais dans la moitié d'un volume de dosage total de 120 uL est un bon point de départ.
  11. Appliquer couvre la plaque. Charge plaques sur le pont poste de travail.
  12. Exécutez le test de démarrage Assistant, passez par l'assistant et commencer dosage.

4. Les résultats représentatifs

Figure 1
Figure 1: immunoessai sandwich AMMP Sur un poste ViBE, un test mesure la concentration d'antigène AMMP. Le signal est mesuré lorsque l'anticorps-antigène-billes haptène se lie à la sonde à travers l'haptène / anti-haptène interaction. Régénération apporte le capteur revient à l'état commence par enlever les complexes immuns.

Figure 2
Figure 2: CHO-HCP courbe de calibration du dosage du PMMA

Figure 2 ci-dessus est un exemple d'une courbe CHO HCP AMMP calibration du dosage. L'analyse peut être effectuée dans les échantillons de l'ensemble du flux d'épuration, y compris le réacteur avec une grande précision et la reproductibilité.

Figure 3
Figure 3: Protéines Une courbe de calibration Assay AMMP

La figure 3 est une courbe de calibration pour une protéine résiduelle Une analyse du PMMA, réalisée avec une protéine résiduelle VIBE une trousse de dosage. Le même kit peut être utilisé pour un rapide essai avec une période d'incubation de 30 minutes, ou pour des résultats plus sensibles et plus large gamme dynamique, avec une période d'incubation plus longue, sans perte de précision ou de précision, qui tous deux sont généralement mieux que leurs équivalents en ELISA dans des usagers les mains

Figure 4
Figure 4: Produit Titer AMMP Assay

La station de travail ViBE peut également être utilisé pour un dosage Titer produit, résultats présentés dans la figure 4. Réalisée différemment que d'autres dosages PMMA, ce test ne nécessite pas de traitement de l'échantillon autre que la dilution simple, ou de perles, et la quantification a été vérifié dans "sans essorage" échantillons contenant plus de 10 millions de cellules sur une large gamme de viabilités.

Figure 5
Figure 5: courbe standard de dosage AMMP pour le dosage de la TPS-GADD34 biomarqueur

Montre la figure 5 est une courbe standard de signal obtenu par le BioAnalyzer ViBE (Groupe A) ou la technologie en utilisant AlphaScreen recombinant GST-GADD34. Résultats sur la plate-forme ViBE ont été d'environ un journal plus sensibles en utilisant les mêmes anticorps. AMMP s'appuie sur la mesure de moins de particules plus grandes mais encore les avantages de la capture en phase solution et la formation de complexes de détection.

Figure 6
Figure 6: Courbe AMMP dosage standard pour la TPS-GADD34 dans l'échantillon de la tumeur

Dans la figure 6, l'induction de GADD34 partir CWR22 xénogreffes a été testé dans la présence ou l'absence d'un inhibiteur du protéasome boronate que analysées soit par le BioAnalyzer ViBE (Groupe A) ou AlphaScreen (Groupe B). La plate-forme ViBE était capable de produire sensibles, des résultats reproductibles dans le in vivo xénogreffes tumorales tandis que le signal a été stoppée avec AlphaScreen mg de protéine accrue.

Cet exemple montre la puissance de la technologie dans des échantillons de PMMA très complexe. Grâce à la puce de détection sensible et une grande efficacité de l'aimant à proximité de la chips, un faible nombre de microparticules magnétiques peuvent efficacement et de façon reproductible récupérer des cibles de faible abondance au milieu de la complexité de lysées cellulaire (y compris les réactifs de lyse) et les débris de sang.

Discussion

Les exemples qui précèdent montrent PMMA est très sensible des résultats quantitatifs dans des échantillons complexes. Cette performance, lorsqu'ils sont livrés avec la facilité et le contrôle de la mise en forme des réactifs dans le système est propice à une variété d'applications. Ces applications peuvent être spécifiques d'une cible, comme dans GADD34 dans la tumeur, ou générique pour un large éventail de cibles, comme dans la détection des protéines de la cellule hôte et la quantification dans des échantillons qui traverse le ruisseau de purification. La plate-forme ViBE faible surcharge combinée avec PMMA extrêmement souple offre un outil puissant pour offrir des tests critiques.

Disclosures

Les auteurs de cet article sont employés par Bioscale, Inc qui produit certains des instruments et des réactifs utilisés dans cet article.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

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