Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Bioengineering
 

Summary

Sviluppo di saggi di costume sulla piattaforma ViBE per più sensibili, riproducibili, i risultati automatizzati in matrici complesse è descritto. La cartuccia universale consente di test per essere facilmente adattati per essere utilizzati con test personalizzati. Questa versatilità consente un rapido sviluppo e validazione di test romanzo o versioni automatizzate di test manuali esistenti, esemplificata in questo video.

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Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

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Abstract

Test personalizzati per specifiche proteine ​​sono spesso limitati a rilevamento manuale che richiede tempo e le tecniche di quantificazione, quali ELISA o Western blot a causa della complessità dello sviluppo su piattaforme alternative. BioScale proprietaria membrana acustica microparticelle (AMMP), la tecnologia permette immunologici panino di essere facilmente sviluppati per l'uso sulla piattaforma ViBE, fornendo una migliore sensibilità, la riproducibilità e il funzionamento automatico. Fornito come esempio, questo protocollo delinea le procedure per lo sviluppo di una consuetudine ovariche di criceto cinese-Host proteina cellulare (CHO-HCP) test. I principi generali descritti qui possono essere seguiti per lo sviluppo di una grande varietà di saggi immunologici.

Un AMMP antigene concentrazione saggio misura misurando i cambiamenti nella frequenza di oscillazione causata dal legame di microparticelle alla superficie del sensore da calcolare. È composto da quattro componenti principali: (1) una cartuccia che contiene un funzionalizzato otto chip del sensore (2) anticorpo marcato microparticelle magnetiche, (3) anticorpo aptene tag che si lega alla superficie del chip funzionalizzati (4) campioni contenenti l'antigene di interesse. BioScale biosensore è un dispositivo di risonanza che contiene otto membrane individuale con percorsi separati fluidica. Le membrane cambiare frequenza di oscillazione in risposta ad accumulare massa in superficie e questo cambiamento di frequenza è utilizzato per quantificare la quantità di massa aggiunto.

Per facilitare l'uso in una vasta gamma di immunodosaggi è funzionalizzati il ​​sensore con un anticorpo anti-aptene. Anticorpi specifici test vengono modificati attraverso la coniugazione covalente di un tag aptene di un anticorpo e biotina all'altro. L'etichetta biotina viene utilizzato per associare l'anticorpo di streptavidina accoppiata sfere magnetiche che, in combinazione con l'aptene-anticorpo tag, vengono utilizzati per catturare l'analita in un panino. Il complesso si lega al chip attraverso l'interazione anti-hapten/hapten. Alla fine di ogni test eseguire i sensori sono pulite con un acido diluito che permette l'analisi sequenziale di colonne da una piastra da 96 pozzetti.

Qui vi presentiamo il metodo per lo sviluppo di una consuetudine CHO-HCP test AMMP per lo sviluppo dei bioprocessi. Lo sviluppo di test AMMP o modificare i test esistenti in saggi AMMP in grado di fornire prestazioni migliori (riproducibilità, sensibilità) in campioni complessi e tempi operatore ridotto. Il protocollo viene illustrata la procedura per lo sviluppo e la sezione di discussione su risultati rappresentativi. Per una spiegazione più approfondita analisi e di ottimizzazione dei parametri di personalizzazione contatto BioScale. Questo kit offre generico test di sviluppo bioprocessi come proteina residua A, titolo del prodotto, e CHO-HCP.

Protocol

1. Microparticelle di preparazione

  1. Anticorpi etichette con Biotina NHS Chimica
  2. Determinazione del grado di biotinilazione
  3. Perle streptavidina coniugato con anticorpo biotinilato
    1. Risospendere le sfere nel flacone originale con il vortex per 1-2 minuti
    2. Aliquota il volume desiderato di perline in una provetta
    3. Lavare le perle 3 volte con PBST:
      1. Collocare la provetta contenente le perline sul magnete per 2 minuti
      2. Eliminare il surnatante tramite aspirazione con il tubo sul magnete. Fare attenzione a non disturbare le perline
      3. Togliere la provetta dal magnete e aggiungere 1 ml PBST
      4. Vortex per 20 secondi per risospendere le sfere
      5. Centrifugare per 5 secondi per rimuovere le perle dal tappo
      6. Ripetere altre due volte 2.3.1-2.3.5
    4. Dopo il terzo lavaggio posto il tubo sul magnete e aspirare il PBST
    5. Aggiungi anticorpo biotinilato ai talloni, risospendere
    6. Se necessario, portare il volume delle anticorpo biotinilato fino a 300 ml con PBS. Se il volume anticorpo è già superiore a 300 ml non aggiungere alcun PBS
    7. Incubare la sospensione tallone / anticorpo per 30 minuti a temperatura ambiente mediante l'agitatore vortex o rotatori tubo
    8. Lavare 3 volte con PBST come nel punto 3.
    9. Blocco con perline biotinilato BSA
      1. Dopo il terzo lavaggio aggiungere 10 mg / mg biotinilato BSA, regolare il volume a 300 ml con PBS, se necessario, e incubare con agitazione per 30 minuti
    10. Lavare 3 volte con PBST come nel punto 3
    11. Risospendere le sfere in 100 ml di PBS/0.05% BSA. Azoturo di sodio possono essere aggiunti per la conservazione a lungo termine
  4. Utilizzando protocolli standard di NHS fluorescina, fluoresceinate l'anticorpo rivelatore
  5. Determinare il grado di Fluorescination

2. HCP - Sviluppo

  1. Preparare le soluzioni di lavoro:
    1. Anticorpo marcato con fluoresceina (Fl-Ab): La maggior parte CHO-HCP saggi uso Fl-Ab ad una concentrazione finale di 400 ng / ml. Il Fl-Ab è aggiunto come ¼ del volume saggio finale, quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è di 1,6 mg / ml. Preparare questa soluzione diluendo magazzino Flab con BioScale Bead / flab diluente.
    2. Perle: la maggior parte CHO-HCP saggi uso perline ad una concentrazione finale di 2x10 5 pedine / ml. Il reagente tallone costituisce ¼ del volume saggio finale, quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è 8x10 5 pedine / ml. Preparare questa soluzione diluendo magazzino tallone con BioScale Bead / flab diluente. Vortex lo stock tallone bene per assicurarsi che tutte le perle sono in sospensione prima di rimuovere una frazione.
    3. Esecuzione di buffer: La composizione del tampone di corsa può essere ottimizzata per gli anticorpi utilizzati per sviluppare il test, tuttavia diversi CHO-HCP test sono stati sviluppati utilizzando 10 mM tampone HEPES, 1% di Tween, pH 7.5. BioScale ha sviluppato un additivo per il tampone di corsa (in dotazione con il kit di sviluppo) che si aggiunge al buffer ad una concentrazione di 1% prima dell'uso.
  2. Diluire calibratori e campioni con diluente campione BioScale.

3. ViBE di configurazione del sistema

  1. Girare la workstation ViBE su
  2. Collegare l'alimentazione del sistema e dei rifiuti
  3. Il primo sistema
  4. Inserire una cartuccia ViBE
  5. Far passare il tubo
  6. Preparare modello di analisi compilando il foglio denominato "Setup campione". BioScale offre la possibilità di avere un modello di analisi per ogni dosaggio Workstation ViBE. Questo permette all'utente di modificare e salvare note specifiche nella scheda "Note" del modello di saggi diversi tenere un registro completo dell'esperimento.
  7. Modello di analisi configurazione iniziale: Inizia compilando il tavolo (angolo in alto a sinistra) del range di concentrazione degli standard nel saggio in "Setup campione" foglio.
  8. Successivamente, inserire ulteriori informazioni nella tabella a destra degli standard (impostazione della colonna semplici Per saperne, One Aggiungi reagenti e due configurazioni reagente Aggiungi) per indicare la workstation ViBE come campioni lunghi bisogno di incubare, come è il volume di reagente deve essere trasferita , per quanto tempo l'accumulo campione deve essere, e se condizionamento del sensore e la decontaminazione di sonde e cartucce sono necessari, ecc
  9. Compila il layout del pannello.
  10. Carico del campione / i reagenti in piastre. Il ViBE fornirà i volumi necessari per la piastra reagente. Volume del campione può variare, ma a metà di un volume dosaggio totale di 120 microlitri è un buon punto di partenza.
  11. Applicare copertine piatto. Caricare le piastre sul ponte workstation.
  12. Eseguire il test di avvio procedura guidata, passare attraverso procedura guidata e avviare test.

4. Rappresentante Risultati

Figura 1
Figura 1: immunodosaggio a sandwich AMMP Su una workstation ViBE, un saggio AMMP misura la concentrazione di antigene. Il segnale è misurato quando il tallone-antigene-anticorpo aptene si lega al sensore tramite l'aptene / anti-aptene interazione. Rigenerazione porta il sensore torna allo stato all'inizio rimuovendo il immunocomplessi.

Figura 2
Figura 2: CHO-HCP curva di calibrazione Assay AMMP

Figura 2 è un esempio di una curva di calibrazione CHO HCP saggio AMMP. Analisi può essere effettuata in campioni provenienti da tutto il flusso di purificazione compreso il reattore con alta precisione e riproducibilità.

Figura 3
Figura 3: Proteina A AMMP curva di calibrazione di analisi

Figura 3 è una curva di calibrazione per una proteina residua un test AMMP, eseguita con una proteina VIBE residua un kit di analisi. Lo stesso kit può essere utilizzato per un test veloce con un periodo di incubazione di 30 minuti, o per risultati più sensibili e più ampia gamma dinamica, con un periodo di incubazione più lungo, senza perdita di precisione o accuratezza, entrambi i quali sono in genere migliori di equivalente ELISA nel utenti ' mani

Figura 4
Figura 4: Prodotto titolo AMMP Assay

La stazione di lavoro ViBE può essere utilizzato anche per un saggio titolo del prodotto, i risultati mostrati in figura 4. Eseguita in modo diverso rispetto saggi AMMP, questo test non richiede trattamento del campione diverso da semplice diluizione o perline, e quantificazione è stata verificata in "no rotazione" campioni contenenti oltre 10 milioni di cellule in un ampio intervallo di Viabilità.

Figura 5
Figura 5: Curva Assay AMMP standard per la GST-Gadd34 biomarker test

Mostrata in Figura 5 è una curva standard di segnale ottenuto dal Bioanalyzer ViBE (Pannello A) o utilizzando la tecnologia AlphaScreen ricombinante GST-Gadd34. Risultati su piattaforma ViBE sono stati circa un registro più sensibili utilizzando gli stessi anticorpi. AMMP sfrutta la misura di un minor numero di particelle più grandi ma ancora beneficia soluzione di acquisizione e complessa fase di formazione di rilevamento.

Figura 6
Figura 6: Curva Assay AMMP standard per la GST-Gadd34 a campione del tumore

Nella Figura 6, l'induzione di Gadd34 da CWR22 xenotrapianti è stato testato in presenza o in assenza di un inibitore del proteasoma boronate come analizzato sia dal ViBE Bioanalyzer (Pannello A) o AlphaScreen (Pannello B). La piattaforma ViBE è stato in grado di produrre sensibili, risultati riproducibili in xenotrapianti tumorali in vivo, mentre il segnale è stato spento con AlphaScreen mcg maggiore di proteine.

Questo esempio mostra la potenza della tecnologia AMMP in campioni molto complessi. Grazie al chip di rilevamento sensibili e ad alta efficienza del magnete vicino al chip, basso numero di microparticelle magnetiche possono pulire in modo efficace e riproducibile per target bassa abbondanza tra la complessità del lisato cellulare (compresi i reagenti lisi) e detriti sangue.

Discussion

Gli esempi precedenti dimostrano AMMP I risultati altamente sensibile quantitativa in campioni complessi. Questa performance, al momento della consegna con la facilità e il controllo della formattazione dei reagenti nel sistema è abilitante per una varietà di applicazioni. Tali domande possono essere specifici per un target, come in Gadd34 nel tumore, o generico per uno spettro di obiettivi, come nella rilevazione delle proteine ​​della cellula ospite e la quantificazione in campioni che attraversano il torrente purificazione. La bassa piattaforma ViBE testa combinata con AMMP altamente flessibile fornisce un potente strumento per la distribuzione di saggi critici.

Disclosures

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Bioscale, Inc che produce alcuni degli strumenti e dei reagenti utilizzati in questo articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

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