अनुवाद कार्यात्मक और स्ट्रक्चरल विश्लेषण Peptidyl tRNAs युक्त Ribosomes के अलगाव

Biology
 

Summary

नवजात peptidyl - tRNAs युक्त ribosomes के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक प्रमुख बाधा एक ही नमूनों में अन्य ribosomes की उपस्थिति में किया गया है ribosomes, विशिष्ट mRNA विश्लेषण किया जा रहा अनुक्रम के अनुवाद में शामिल नहीं है. हम एक सरल पद्धति विकसित की शुद्ध, विशेष रूप से, ब्याज की नवजात peptidyl-tRNA युक्त ribosomes.

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Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498, doi:10.3791/2498 (2011).

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Abstract

Protocol

1. नि: शुल्क निकालें तैयार सेल.

  1. एक सूखी Escherichia गोली बैक्टीरिया कोलाई के दो ग्राम मध्य लॉग चरण संस्कृतियों धो रहे हैं, बफर का आधा लीटर के साथ दो बार, से प्राप्त एक युक्त 10 मिमी Tris-एसीटेट, 8.0 पीएच, 14 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, 60 मिमी पोटेशियम एसीटेट, और 50 μg / 5000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा एमएल (PMSF) 4 ° phenylmethanesulphonylfluoride सी. धोने के बाद, बैक्टीरियल गोली बफर ए के 40 एमएल में resuspended है
  2. बैक्टीरियल कोशिकाओं को एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करने के लिए बाधित कर रहे हैं, 6000 साई दबाव आवेदन. यह दबाव 600 इकाइयों के एक एक इंच पिस्टन का उपयोग करने के लिए मेल खाती है. बाधित निलंबन एक साफ ग्लास ट्यूब (50 एमएल) में एकत्र किया जाता है.
  3. बाधित निलंबन 1 मिमी dithiotreitol (डीटीटी) के साथ इलाज किया जाता है और 30 मिनट के लिए 30,000 XG पर centrifuged है. centrifugation प्रक्रिया को दोहराया है, जिसके परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला का उपयोग. अंतिम सतह पर तैरनेवाला (1 एमएल) microtubes में तिरस्कृत है. अंत में, aliquots एक सूखी बर्फ इथेनॉल मिश्रण या तरल नाइट्रोजन का उपयोग जमे हुए हैं, और कर रहे हैं -60 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस

2. सेल मुफ्त RF2 के समाप्त अर्क की तैयारी.

  1. एक sepharose 4B घोल मोती प्रोटीन के 4.5 एमएल एक विरोधी RF2 कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक rotating पहिया, का उपयोग कर विरोधी सीरम के 5 एमएल के साथ मिश्रित कर रहे हैं. मिश्रण 2500 पर centrifuged है antiserum से मोती अलग XG. सतह पर तैरनेवाला discarding करने पर, इन विरोधी RF2 एंटीबॉडी (विरोधी मोती - RF2) युक्त मोती बाद बफर बी के 1 एमएल 35 मिमी युक्त resuspension द्वारा धोया Tris-एसीटेट 7.8 पीएच, 10 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, 30 मिमी अमोनियम एसीटेट, 60 मिमी पोटेशियम ग्लूटामेट और 5 leupeptin proteinase अवरोध करनेवाला के μg / एमएल. विरोधी RF2 मोती तो एक ही ऊपर संकेत शर्तों का उपयोग centrifugation द्वारा बफर बी से अलग कर रहे हैं. धोने प्रक्रिया में दो बार दोहराया है.
  2. सेल मुक्त निकालने की एक एमएल विरोधी RF2 मोतियों की एक rotating पहिया 4 बजे, का उपयोग कर 150 μL के साथ मिलाया जाता है डिग्री सेल्सियस, दो घंटे के लिए. मिश्रण 10,000 XG पर centrifuged है मोतियों से सेल मुक्त निकालने अलग. सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और इलाज विरोधी RF2 मोती के एक और 150 μL के साथ फिर से. यह प्रक्रिया एक बार और जिसके परिणामस्वरूप सेल मुक्त समाधान निकालने के साथ दोहराया है. अंतिम सेल मुक्त समाधान निकालने (100 μL) microtubes में तिरस्कृत है. aliquots एक सूखी बर्फ इथेनॉल मिश्रण या तरल नाइट्रोजन का उपयोग करने के लिए जमे हुए हैं, और कर रहे हैं -60 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस

3. एक डीएनए खाका के तैयार करना.

  1. एक 1 एमएल प्लाज्मिड दृश्यों अनुवादित युक्त टेम्पलेट (चित्र 1) का मिश्रण 600 femtomoles द्वारा पीसीआर प्रतिक्रिया 1 छवि, प्रत्येक dNTP 0.2 micromoles और के 50 यू में संकेत oligodeoxynucleotides में से प्रत्येक के 0.4 nanomoles के साथ, तैयार Taq- Stratagene कंपनी द्वारा आपूर्ति बफर में डीएनए पोलीमरेज़ प्रदर्शन का पालन शर्तों के तहत प्रवर्धन प्रतिक्रिया: 2 मिनट के लिए 94 ° सी (94 ° 30 एस सी, 55 ° 30 एस सी, 72 ° सी 1 मिनट के लिए, 30 के लिए ) चक्र और 72 ° C 12 मिनट के लिए.
  2. 1 / 10 3 एम सोडियम एसीटेट की मात्रा, 5.2 पीएच, और बर्फ के ठंडे इथेनॉल के 2 खंडों को जोड़कर डीएनए precipitating द्वारा पीसीआर उत्पादों शुद्ध. एक बार और अधिक तेज़ी प्रक्रिया दोहराएँ. Diethyl-pyrocarbonate (DEPC) इलाज पानी की 100 μL में डीएनए Resuspend.
    सामान्यतया, यह प्रक्रिया एक 600 बीपी डीएनए उत्पाद के 100 μg पैदावार.
  3. Agarose जैल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों की अखंडता को सत्यापित करें.

4. बायोटिन लेबल mRNA की तैयारी.

  1. DEPC इलाज पानी में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में पीसीआर उत्पन्न डीएनए टुकड़ा के एटीपी, CTP, GTP, UTP के 0.3 micromoles, बायोटिन-16-UTP 50 nanomoles, और 10 μL के 0.5 micromoles के साथ 5 μg मिश्रण से एक 100 μL तैयार T7 Promega कंपनी द्वारा आपूर्ति बफर में एंजाइम मिश्रण के 37 पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते ° C 3 घंटे के लिए.
    प्राप्त mRNA की राशि यों, डीएनए टेम्पलेट RNase मुक्त DNase जोड़ने के द्वारा समाप्त किया जाना चाहिए. 37 पर प्रतिक्रिया डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. एम 3 सोडियम एसीटेट, 5.2 पीएच, और ठंड इथेनॉल की 2 मात्रा का 1 / 10 मात्रा जोड़कर शाही सेना precipitating द्वारा mRNA उत्पादों शुद्ध. एक बार और अधिक तेज़ी प्रक्रिया दोहराएँ. DEPC इलाज - पानी के 100 μL में mRNA Resuspend.
    आमतौर पर, एक 600 NT के बायोटिन की 1-2 मिलीग्राम के बीच इस प्रक्रिया पैदावार mRNA उत्पाद लेबल.
  3. Agarose जैल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा बायोटिन लेबल mRNA उत्पादों की अखंडता को सत्यापित करें.

5. अनुवाद Ribosomes युक्त एक Peptidyl-tRNA के अलगाव.

  1. DEPC इलाज पानी में इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण में उन्नीस के प्रत्येक अमीनो एसिड सभी एमिनो एसिड को छोड़कर है कि एक रेडियोधर्मी एमिनो एसिड के द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा के 75 nanomoles साथ बायोटिन लेबल mRNA की 10-15 μg मिश्रण से एक के 500 μL तैयार , एक रेडियोधर्मी अमीनो एसिड (37MBq) के 50 μCi, और 20-5 RF2 समाप्त एक बफर प्रतिक्रिया 40 मिमी Tris-एसीटेट, 8.0 पीएच, 10 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, 175 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 10 मिमी अमोनियम एसीटेट, 2 मिमी डीटीटी, 2 मिमी एटीपी, 0.5 युक्त मिश्रण में सेल मुक्त निकालने के 0 μL GTP मिमी, 30 मिमी phosphoenolpyruvate (पीईपी), 0.3 U / एमएल पाइरूवेट kinase (पी), 3.5% polyethylene glycol 8000, 1 मिमी spermidine, 20 μg / एमएल folinic एसिड, और 250 μg / एमएल ई. से tRNA कोलाई. 37 पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते ° C 10 मिनट के लिए.
    प्रतिक्रिया घटकों के अलावा के क्रम बहुत महत्वपूर्ण है. सेल मुक्त निकालने बफर अमीनो एसिड और अंतिम कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए incubated ribosomes के सक्रियण की अनुमति मिश्रण युक्त समाधान के साथ पहली बार मिश्रित चाहिए. बाद में, बायोटिन - लेबल mRNAs जोड़ रहे हैं. संरचनात्मक विश्लेषण के लिए संशोधन रासायनिक प्रक्रियाओं का उपयोग, एक रेडियोधर्मी एमिनो एसिड के अलावा आवश्यक नहीं है.
  2. Streptavidin paramagnetic (एसएमबी) मोती बफर सी में निलंबित 35 मिमी Tris-एसीटेट, 8.0 पीएच, 10 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, 175 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 10 मिमी अमोनियम एसीटेट और 1 मिमी डीटीटी युक्त 3 एमएल - अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नए निलंबन सेते हैं.
  3. मिश्रण से एक चुंबकीय क्षेत्र (एमएफ) चुंबकीय जुदाई खड़ा का उपयोग कर लागू करने के द्वारा किसी अलग.
  4. Resuspend बफर सी में किसी और मोती फिर अलग एमएफ का उपयोग. इस धोने प्रक्रिया में दो बार दोहराएँ. बफर सी के 500 μL में मोती Resuspend, बर्फ पर निलंबन की दुकान, और अगले प्रक्रिया तुरंत प्रदर्शन.

6. पृथक Peptidyl-tRNA युक्त Ribosomes का विश्लेषण.

Peptidyl-tRNA के लिए

  1. लोड हो रहा है 50 मिमी Tris - एचसीएल, पीएच 6.8, 2.5% (v / v) ग्लिसरॉल हैं 4% सोडियम dodecyl सल्फेट, 2 मिमी डीटीटी और 0.2 मिलीग्राम से युक्त बफर के 10 μL के साथ एसएमबी के 10 μL (बफर सी में निलंबित) मिक्स एमएल / bromophenol नीले. 10% Tris - tricine polyacrylamide जैल में नमूने चलाकर मोतियों से जुड़ी घटकों संकल्प.
  2. एक वैक्यूम जेल ड्रायर का उपयोग कर जैल सूखी.
  3. एक एक्स - रे फिल्म सूख जेल उजागर द्वारा अखंडता और peptidyl tRNA के शुद्धीकरण सत्यापित करें.

Ribosomal शाही सेना के लिए

  1. 2 मिमी ethylenediaminetetraacetate (EDTA) DEPC इलाज पानी के साथ तैयार समाधान की μL 190, और पानी के साथ एक मनका निलंबन की 10 μL equilibrated, phenol के 200 μL जोड़ें. जोरदार vortexing द्वारा निलंबन मिक्स और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifugation द्वारा जैविक चरण से अकार्बनिक चरण अलग. एक नया microtube में शीर्ष पानी परत लीजिए.
  2. 1 / 10 3 एम सोडियम एसीटेट की मात्रा, 5.2 पीएच, 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन, समाधान, और ठंडा इथेनॉल के 2 मात्रा के 1 μL जोड़कर पानी की परत से शाही सेना वेग. DEPC पानी का इलाज के 10 μL में शाही सेना Resuspend.
  3. Agarose जैल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा ribosomal RNAs के अखंडता को सत्यापित करें.
    आमतौर पर, मोती निलंबन का 50 μL ribosomal शाही सेना के 1μg पैदावार.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 2 गुणवत्ता और अनुवाद प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए अलग ribosomes की कार्यक्षमता उल्लिखित का मूल्यांकन विश्लेषण की एक श्रृंखला के परिणाम प्रस्तुत करता है. एक अद्वितीय बैंड polyacrylamide जैल में हल का अवलोकन बायोटिन लेबल एसएमबी (2A चित्रा) से जुड़ी mRNAs करने के लिए बाध्य polypeptides की उपस्थिति का संकेत है. ribosomal RNAs की शुद्धि इस प्रक्रिया का उपयोग इन बायोटिन लेबल mRNAs करने के लिए बाध्य है, के रूप में अच्छी तरह से (चित्रा 2B) ribosomes की उपस्थिति स्थापित करता है. Puromycin के अलावा, एक एंटीबायोटिक है कि ribosome की गतिविधि peptidyl transferase लाती है, नवजात 1 peptidyl - tRNAs की दरार में परिणाम. यह polyacrylamide जैल में पृथक पॉलीपेप्टाइड (चित्र 2C) के प्रवास पैटर्न में बदलाव के रूप में मनाया जाता है. साथ में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि बायोटिन लेबल एसएमबी के लिए संलग्न mRNAs peptidyl - tRNAs के साथ कार्यात्मक ribosomes शामिल हैं.

अनुवाद ribosomes युक्त विशिष्ट peptidyl - tRNAs के अलगाव peptidyl - tRNAs, एंटीबायोटिक दवाओं, और अन्य अणुओं के प्रभाव का अध्ययन परमिट, ribosome समारोह (चित्रा 3A) पर, और ribosome संरचना पर (3B चित्रा). उदाहरणों में यहाँ एंटीबायोटिक sparsomycin प्रस्तुत किया और एमिनो एसिड tryptophan (टीआरपी) RF2 पृथक ribosomes (चित्रा 3A) में नवजात tnaC-tRNA peptidyl-tRNA प्रेरित hydrolytic दरार रोकना. sparsomycin या ribosome साथ टीआरपी की बातचीत भी कुछ nucleotides कि अनुवाद ribosome (चित्र 3B) के 23S rRNA गठन में संरचनात्मक बदलाव लाती है. संक्षेप में, जैविक प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए प्राप्त सामग्री यहाँ वर्णित संरचनात्मक ribosome समारोह के विभिन्न आणविक कारकों के साथ अपनी बातचीत पर निषेध में शामिल संपर्कों के अतिरिक्त समझ प्राप्त करने में उपयोगी होते हैं.

"ove_content> चित्रा 1
चित्रा 1 प्रक्रिया करने के लिए उत्पादन और अनुवाद ribosomes peptidyl - tRNAs युक्त शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया. डीएनए ca टुकड़े. युक्त tnaC जीन और उसके सटे क्षेत्र, आंकड़े में दिखाया गया, लंबाई में 650 बीपी, बायोटिन, [(जैव) UMP] mRNA युक्त mRNAs की तैयारी में टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है है. ये डीएनए टुकड़े पीसीआर आंकड़े के शीर्ष पर संकेत oligodeoxynucleotides का उपयोग प्रक्रियाओं के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. रेखांकित अक्षरों nucleotide प्राइमर में इनकोडिंग T7 प्रमोटर के स्थान के निशान. बोल्ड पत्र अनुक्रम शाइन Dalgarno कि tnaC mRNA दृश्यों के अनुवाद में प्रयोग किया जाता है संकेत मिलता है. डीएनए टुकड़ा में T7 प्रमोटर T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जो (तीर) tnaC अनुक्रम और गैर कोडन अनुक्रम बहाव की नक़ल करने के लिए प्रयोग किया जाता है के द्वारा मान्यता प्राप्त है. ट्रांसक्रिप्शन rpoBC टर्मिनेटर दृश्यों (rpoBC "टी") के बाद जब शाही सेना पोलीमरेज़ डीएनए टुकड़ा के अंत से 3'तक पहुँचता है, समाप्त . स्टेम पाश rpoBC टर्मिनेटर की संरचना 3'-5 'इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल सेल मुक्त अर्क में exoribonuclease गतिविधि वर्तमान से mRNA बचाता है. पृथक [(जैव) UMP] mRNAs ठप, अनुवाद ribosomes उत्पन्न, इन विट्रो अनुवाद assays में उपयोग किया जाता है . tnaC अनुक्रम में [(जैव) UMP] mRNA एक ribosome जो स्टालों जब पिछले अमीनो एसिड शामिल है, रिलीज फैक्टर के मिश्रण से प्रतिक्रिया (RF2) अनुपस्थिति के कारण द्वारा अनुवादित है . ribosome - [(जैव) UMP] mRNA परिसरों कुल प्रतिक्रिया (एसएमबी) streptavidin चुंबकीय मोती है जो बाँध बायोटिन लेबल mRNA में शामिल nucleotides का उपयोग मिश्रण से अलग कर रहे हैं. SMBs के लिए बाध्य ribosome - [(जैव) UMP] mRNA परिसरों कुल प्रतिक्रिया मिश्रण से एक चुंबकीय क्षेत्र (एमएफ) का उपयोग करके निकाले जाते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 अलग परिसरों की स्ट्रक्चरल और कार्यात्मक विश्लेषण. इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं में) के साथ प्रदर्शन किया गया. [UMP (जैव)] mRNAs जिसमें tnaC जीन की शुरुआत codon एक बंद codon द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था. अंतिम उत्पादों streptavidin मोती का उपयोग कर अलग थे, के रूप में 1 अंजीर में संकेत दिया है. रिएक्शन उत्पादों और अलग अणुओं तो polyacrylamide जैल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया. tnaC-tRNA और tnaC पेप्टाइड बैंड के रूप में चिह्नित कर रहे हैं. बी) कुल शाही सेना ठप phenol के निष्कर्षण प्रक्रियाओं का उपयोग परिसरों से पृथक किया गया. प्रत्येक पृथक शाही सेना agarose जैल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा हल किया गया था. Ribosomal RNAs (rRNAs) संकेत कर रहे हैं. ) सी (+) के साथ या बिना पृथक परिसरों युक्त tnaC - tRNAs incubated रहे थे (-) 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.02 मिमी puromycin (Puro). tnaC पेप्टाइड - methionine [35S] (एक) या - प्रोलाइन [3H] (बी) का उपयोग अनुवाद के दौरान लेबल थे.

चित्रा 3
चित्रा 3 ribosomes युक्त tnaC-tRNA कि एंटीबायोटिक sparsomycin, या एमिनो एसिड tryptophan करने के लिए बाध्य कर रहे हैं की स्ट्रक्चरल और कार्यात्मक विश्लेषण. ए) पृथक tnaC - tRNAs युक्त परिसरों (+) के साथ या (बिना incubated रहे थे -) (मुक्केबाज़ी) sparsomycin या tryptophan (टीआरपी) के 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर. बाद में, मिश्रण RF2 के साथ मिलाया गया और 37 डिग्री 20 मिनट के लिए सी incubated. बी) 23S rRNA में मेथिलिकरण परिवर्तन का विश्लेषण ribosome भीतर बाध्यकारी अणुओं द्वारा प्रेरित किया. पृथक परिसरों थे (+) के साथ या बिना पूर्व incubated (-) 2 मिमी टीआरपी जहाज़ का मस्तूल या 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस फिर, एक alkylation एजेंट, डाइमिथाइल सल्फेट, जोड़ा गया था और एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated मिश्रण. कुल शाही सेना और निकाले प्राइमर विस्तार assays एक लेबल 23S rRNA जो 100 nucleotides संशोधित nucleotide से नीचे स्थान दिया गया है nucleotides के लिए पूरक oligodeoxynucleotide [32P] के साथ प्रदर्शन किया गया था. विस्तार assays के अंतिम उत्पादों polyacrylamide जैल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा सुलझाया गया. 23S rRNA टीआरपी या मुक्केबाज़ी की उपस्थिति से प्रभावित nucleotides संकेत कर रहे हैं.

Discussion

यह अलगाव की इस रिपोर्ट में वर्णित प्रक्रिया अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. दुर्भाग्य से, एक ही अनुवादित दृश्यों से उत्पादित की उपस्थिति कम peptidyl - tRNAs सुविधा नहीं बचा जा सकता है, जैसे peptidyl - tRNAs कुल पृथक सामग्री (चित्रा 2C) की 15-20% के अनुरूप कर सकते हैं. इन contaminants एकाग्रता में वृद्धि जब बायोटिन लेबल mRNA की उच्च सांद्रता का इस्तेमाल किया गया है या किया गया है जब सेल मुक्त अर्क का प्रयोग किया जाता पुराने हैं या कई बार फिर से इस्तेमाल किया हो सकता है. इसलिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है गुणवत्ता और इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रियाओं में एकाग्रता के घटकों के नियंत्रण के लिए. वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक उच्च दक्षता पुनर्गठन सेल मुक्त अर्क को उपलब्ध हैं कि एक ही (शुद्ध प्रणाली) प्रयोजनों के 18 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस पद्धति का उपयोग करके, बायोटिन-16-UMP बेतरतीब ढंग से लक्ष्य mRNA की लंबाई के साथ शामिल है. वहाँ एक संभावना है कि कुछ uridine इलाकों युक्त ORFs शामिल है यह अपने दृश्यों में nucleotide संशोधित, उनके अनुवाद को प्रभावित कर सकते है. Biotin-16-UTP/UTP के परिवर्तनीय रिश्तेदार सांद्रता mRNA की संश्लेषण के दौरान परीक्षण किया जा क्रम में सबसे कुशल अनुवाद प्राप्त करने के लिए है. बायोटिन लेबलिंग के वैकल्पिक तरीकों, 5'-अंत mRNAs का सबसे स्थिर अंत लक्ष्यीकरण इस्तेमाल किया जा सकता है. (I) बायोटिन 3'-NH2ATP (3'एमिनो, 3'-deoxyadenosine triphosphate) और टी -4 आरएनए 19 ligase का उपयोग mRNA की अंत - 5'करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. (Ii) 5'-अंत बायोटिन लेबल oligonucleotide टी -4 आरएनए ligase के रूप में 20 अच्छी तरह से उपयोग mRNA की 5'अंत करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. (Iii) 3'अंत बायोटिन लेबल oligodeoxynucleotides जो mRNA के अंत 5'पूरक अनुक्रम के अनुरूप भी अनुवाद परिसरों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये बायोटिन लेबल oligodeoxynucleotides किसी से जुड़ा हो सकता अलगाव के लिए पहले. बाद में किसी बायोटिन - लेबल oligodeoxynucleotides से जुड़ी अनुवाद प्रतिक्रिया के लिए उनके पूरक mRNA दृश्यों के साथ बातचीत की अनुमति मिश्रण के साथ मिलाया जा सकता है है. अलगाव के बाद, संकर शाही सेना डीएनए क्षेत्र - क्षेत्र और बायोटिन लेबल oligodeoxynucleotide और mRNA अनुक्रम के बीच hybridizing - RNase एच का उपयोग कर अपमानित किया जा सकता है, streptavidin मोतियों से ठप परिसरों को अलग. यह वैकल्पिक पद्धति परिसरों भविष्य संरचनात्मक विश्लेषण में उच्च संकल्प तरीकों का उपयोग करने के लिए नियोजित अनुमति दे सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

LRC-V. डॉ. Adriel डी. जॉनसन, एक अद्भुत प्रोफेसर जिनकी संख्या एक प्राथमिकता हमेशा छात्रों की शिक्षा की स्मृति करने के लिए इस पत्र समर्पित करना चाहती है. हम आपको याद आती है, Adriel. हम इस अध्ययन में वर्णित प्रयोगों प्रदर्शन करने में उसकी मदद के लिए जैकलिन मोरेनो के लिए आभारी हैं. इस अध्ययन में एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, MCB-0615390 से CY प्रदान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और शुरू हुआ LRC-V करने के लिए उपलब्ध कराई गई निधियों द्वारा. Huntsville में अलबामा के विश्वविद्यालय से.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris base Sigma-Aldrich 252859
Magnesium acetate Fluka 63049
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1501
Ammonium acetate Fluka 09688
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Protein A sepharose 4B slurry beads Sigma-Aldrich P9424
Leupeptin inhibitor Sigma-Aldrich L9783
Taq-DNA polymerase Stratagene, Agilent Technologies 201223
T7 Maxiprep kit Promega Corp. P1300
SMB Promega Corp. Z5482
Biotin-16-UTP Roche Group 1388908
ATP Sigma-Aldrich A7699
GTP Sigma-Aldrich G8877
PEP Sigma-Aldrich P7002
PK Sigma-Aldrich P7768
Polyethylenglycol 8000 Fluka 81268
Folinic acid Fluka 47612
Spermidine Fluka 85558
tRNA from E. coli Sigma-Aldrich R1753
DEPC Sigma-Aldrich D5758
Tricine Sigma-Aldrich T5816
L-amino acids Sigma-Aldrich LAA21
DTT Fluka 43815
magnetic separation stands Promega Corp. Z5342

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References

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Comments

1 Comment

  1. Although the method looks great, but I am wondering why the scientist in this video is not wearing gloves when he was handling the bacterial pellet at start

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    Posted by: Sultan A.
    May 6, 2016 - 7:26 PM

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