محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الكالسيوم هو رسول في كل مكان في الجهاز العصبي ، وضرورية لتحريك الافراج العصبي والتغييرات في قوة متشابك. هنا نظهر تقنية لتحميل كا 2 + - المؤشرات في محطات العصب ذبابة الفاكهة. نظهر أيضا تصنيع أجهزة المطلوبة ، والتأكيد على النقاط الحرجة للنجاح في هذه التقنية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الكالسيوم يلعب أدوارا عدة في الجهاز العصبي ولكن لا شيء أكثر إثارة للإعجاب من حيث الزناد لاطلاق سراح العصبي ، ولا شيء أكثر عمقا من أن رسول ضروري ليونة متشابك التي تدعم التعلم والذاكرة لمزيد من توضيح الأسس الجزيئية للكا 2 + التي تعتمد على آليات متشابك ، لا بد من نموذج النظام على حد سواء ليونة وراثيا ويمكن الوصول إليها من الناحية الفسيولوجية. ذبابة الفاكهة السوداء البطن يوفر مثل هذا النموذج. في هذا النظام ، وراثيا ترميز الفلورسنت المؤشرات المتوفرة لكشف كا 2 + التغيرات في المحطات الطرفية العصبية. ومع ذلك ، فقد تقتصر هذه المؤشرات حساسية للكا 2 + وغالبا ما تظهر استجابة غير خطية. تتلاءم بشكل أفضل المؤشرات لقياس الفلورسنت الاصطناعية كا السريع 2 + التغييرات المرتبطة بالنشاط العصبية. هنا نظهر تقنية لتحميل ديكستران - مترافق الاصطناعية كا 2 + المؤشرات في محطات العصب يرقات ذبابة الفاكهة تعيش في. هناك تركيز خاص على تلك الجوانب من البروتوكول الأكثر أهمية لنجاح هذه التقنية ، مثل كيفية تجنب التصريف الكهرباء الساكنة على طول الأعصاب معزولة ، والحفاظ على الصحة من إعداد أثناء فترات تحميل طويلة ، وضمان بقاء محور عصبي من خلال توفير كا 2 + لتعزيز ختم النهايات محوار مقطوعة. انخفاض تقارب ديكستران - مترافق كا 2 + ، المؤشرات ، مثل fluo - 4 وrhod ، التي تتوفر تظهر إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء في حين تعطيل الحد الأدنى من الكالسيوم قبل المشبكي 2 + الديناميات. ديكستران - اقتران يساعد على منع كا 2 + يجري عزلها المؤشرات في عضيات مثل الميتوكوندريا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على حد سواء لتحميل الأجنة واليرقات والبالغين.

Protocol

  1. حدد طبق تشريح النظيفة التي لم تتعرض إلى أي مثبتات.

  2. تشريح يتجول 3 يرقة ذبابة الفاكهة الثالثة في طور مرحلي متوسطة ذبابة الفاكهة التي تحتوي على الكالسيوم شنايدر 2 + و L - الجلوتامين ، (لا قطع الأعصاب أو أي ألياف العضلات الضرر رقم 7 ، 6 ، 13 أو 12).

  3. حدد ملء كوب - ماصة مع طرف ميكرون 12 (القطر الداخلي).

  4. استخدام حقنة وأنابيب (لتطبيق الضغط السلبي على ماصة) ضمان عدم عرقلة الطرف ماصة.

  5. حدد غرامة البلاستيك ملء - خيوط التي يمكن إدراجها أسفل طول ماصة الزجاج.

  6. رسم ~ 1 سم من 5 ملم ، مترافق ديكستران كا 2 + ، مؤشر إلى خيوط البلاستيك.

  7. قطع كل قطعة الأعصاب.

  8. دعم ماصة على منحدر من شأنها أن تسمح للطرف ماصة من الاقتراب من خط الوسط البطنية من اليرقة تشريح.

  9. رسم نهاية القطع من الجرأة في الجزء No.4 ، دون معسر العصب ، في نهاية ماصة (وتشمل كمية صغيرة من متوسطة شنايدر).

  10. إزالة أنابيب وتضاف خيوط البلاستيك في ماصة حتى نهاية الخيط هو في حدود 50 ميكرون من نهاية قطع العصب (تجنب ملامسة العصب).

  11. إخراج كافية كا 2 + ، مؤشر على العصب المنتهية لزيادة حجم شنايدر المتوسطة بنحو 33 ٪ (التركيز النهائي ينبغي أن يكون <2mm و). هام -- يجب أن تكتمل في غضون 5 دقائق وهذا من قطع العصب.

  12. إعداد مكان في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، بينما يحمل العصبية.

  13. بعد 40 دقيقة إزالة كا 2 + ، مؤشر باستخدام خيوط.

  14. مغادرة ماصة في مكان وملء تماما مع شنايدر المتوسطة الطازجة ، كما سيتم استخدامها لتطبيق هذه النبضات إلى تحفيز الأعصاب.

  15. السماح للكا 2 + ، مؤشر للتوازن في العصب لا يقل عن 60 دقيقة ، ولكن لا أكثر من 4 ساعات ، قبل أن تبدأ كا 2 + التصوير.

  16. شطف مع إعداد المتوسطة الطازجة شنايدر كل 30 دقيقة في حين أنه من equilibrating.

  17. قبل 20 دقيقة من التصوير استبدال شنايدر المتوسطة مع حل NO.6 الدملمف على غرار (HL6 ؛ ماكلويد وآخرون 2002 ، 2003).

  18. يمكن إضافة L - حمض الغلوتاميك أو الغلوتامات HL6 إلى حل في لتوعي 7mM بعد المشبكي مستقبلات الغلوتامات لمنع العصب أثار تقلص العضلات (ماكلويد وآخرون 2004 ؛. Reiff وآخرون 2002 ، 2005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics