טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

סידן הוא שליח בכל מקום במערכת העצבים, חיוני מפעילה שחרור הנוירוטרנסמיטר ושינויים חוזק סינפטי. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת Ca 2 +-אינדיקטורים לתוך מסופי תסיסנית עצב. אנחנו גם מדגימים המצאה של המנגנון הנדרש ולהדגיש נקודות קריטיות להצלחת הטכניקה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

סידן משחק תפקידים רבים במערכת העצבים אבל אף מרשים יותר כמו ההדק לשחרור נוירוטרנסמיטר, ואף אחד עמוק יותר כשליח חיוני הפלסטיות הסינפטית התומכת בלמידה ובזיכרון. כדי להמשיך להבהיר את הבסיס המולקולרי של Ca 2 + תלויי מנגנוני הסינפטי, מערכת מודל נדרש כי הוא גם נזיל גנטית נגיש מבחינה פיזיולוגית. תסיסנית melanogaster מספק מודל כזה. במערכת זו, מקודדים גנטית אינדיקטורים פלורסנט זמינים לזהות Ca 2 + שינויים מסופי העצב. עם זאת, אינדיקטורים אלה מוגבל רגישות Ca 2 + ולעתים קרובות להראות תגובה שאינו ליניארי. האינדיקטורים פלורסנט סינתטי מתאימים יותר למדידת Ca מהירה 2 + שינויים הקשורים לפעילות עצבית. כאן אנו להפגין טכניקה לטעינת dextran-מצומדות סינתטי Ca 2 + אינדיקטורים לתוך מסופי העצב לחיות הזחלים תסיסנית. דגש מיוחד מושם על אותם היבטים של פרוטוקול הקריטי ביותר להצלחה של טכניקה, כמו למשל איך להימנע הפרשות חשמל סטטי לאורך עצבים מבודדת, בשמירה על בריאות הכנת בתקופות טעינה ממושכת, והבטחת הישרדות האקסון ידי מתן Ca 2 + כדי לקדם את האיטום של קצות האקסון ניתק. זיקה נמוכה dextran-מצומדות Ca 2 +-אינדיקטורים, כגון fluo-4 ו rhod, זמינים אשר מראים יחס גבוה אות לרעש בזמן מינימלית לשבש presynaptic Ca 2 + דינמיקה. Dextran-נטיה מסייע במניעת Ca 2 + אינדיקטורים להיות מוחרם לתוך אברונים כגון מיטוכונדריה. הטכניקה הטעינה יכול להיות מיושם באופן שווה, הזחלים עוברים ומבוגרים.

Protocol

  1. בחר מנה לנתיחה נקי כי לא נחשף כל fixatives.

  2. לנתח נודד 3 rd instar הזחל תסיסנית בינוני של שניידר תסיסנית המכילה Ca 2 + ו-L-גלוטמין, (לא לחתוך שום עצבים או שרירים סיבי נזק מס '7, 6, 13 או 12).

  3. בחר זכוכית מילוי-פיפטה עם טיפ 12 מיקרון (קוטר פנימי).

  4. באמצעות מזרק צינורות (להפעיל לחץ שלילי פיפטה) להבטיח את קצה פיפטה אינו חסום.

  5. בחר פלסטיק דק מילוי-נימה שניתן להוסיף לאורך פיפטה מזכוכית.

  6. צייר ~ 1 ס"מ של 5 מ"מ dextran-מצומדות Ca 2 +-אינדיקטור לתוך חוט הפלסטיק.

  7. חותכים את כל העצבים קטע.

  8. תמיכה פיפטה על הרמפה שיאפשר את קצה פיפטה הגישה קו האמצע הגחון של הזחל גזור.

  9. צייר את הקצוות של עצב קטע מספר 4, בלי לצבוט את העצב, לתוך סוף פיפטה (כולל כמות קטנה של המדיום של שניידר).

  10. הסר את צינורות והכנס את חוט הניילון לתוך פיפטה עד סוף החוט בתוך 50 מיקרון של סוף לחתוך של העצב (אל תיגע עצב).

  11. הוצא מספיק Ca 2 +-חיווי על עצב את הסוף כדי להגביר את עוצמת הקול של המדיום של שניידר על ידי כ -33% (הריכוז הסופי צריך להיות <2 מ"מ). חשוב - זה חייב להסתיים תוך 5 דקות של חיתוך העצב.

  12. מניחים את הכנת בחושך בטמפרטורת החדר בעוד המון עצב.

  13. לאחר 40 דקות להסיר את Ca 2 +-אינדיקטור באמצעות חוט להט.

  14. השאירו את פיפטה במקום ולמלא אותו לחלוטין עם המדיום שניידר טריים, כמו זה ישמש ליישם פולסים מגרה לעצב.

  15. אפשר Ca 2 +-אינדיקטור לאזן בתוך העצב במשך לפחות 60 דקות, אך לא יותר מ 4 שעות, לפני תחילת Ca 2 + הדמיה.

  16. שוטפים את ההכנה עם מדיום חדש של שניידר כל 30 דקות בזמן שהוא equilibrating.

  17. 20 דקות לפני הדמיה להחליף בינוני של שניידר עם פתרון No.6 Hemolymph-Like (HL6; מקלאוד et al 2002;. 2003).

  18. L-חומצה גלוטמית או גלוטמט ניתן להוסיף פתרון HL6 ב 7mm כדי להרדים קולטני גלוטמט postsynaptic למנוע העצבים עורר התכווצות שרירים (מקלאוד et al 2004;. רייף et al 2002;. 2005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics