カルシウムインジケータ付きのロードショウジョウバエの神経終末

Biology

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Summary

カルシウムはシナプス強度の神経伝達物質の放出や変更をトリガするための不可欠な神経系におけるユビキタスメッセンジャー、です。ここでは、+ -の指標ショウジョウバエの神経終末へのCa 2をロードするためのテクニックを示しています。我々はまた、必要な装置の製造を実証し、技術の成功のための重要なポイントを強調する。

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Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (6), e250, doi:10.3791/250 (2007).

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Abstract

カルシウムは神経伝達物質の放出のためのトリガー、および学習と記憶をサポートしているシナプス可塑性に不可欠なメッセンジャーとしてのより深いなしとしてより多くの印象的な神経系がどれもの多くの役割を果たしている。さらに、Ca 2 +依存性のシナプスメカニズムの分子基盤を解明するために、モデルシステムは、遺伝的に可鍛性および生理学的にアクセス可能の両方であることが必要です。キイロショウジョウバエはそのようなモデルが用意されています。このシステムでは、遺伝的に符号化された蛍光指示薬は、神経終末でのCa 2 +変化を検出するために用意されています。しかし、これらの指標は、Ca 2に対する感度が限られている+としばしば非線形応答を示す。合成蛍光指示薬は、より急速なCa 2 +は神経活動に伴う変化を測定するのに最適です。ここでは、ショウジョウバエの幼虫のライブの神経終末へのデキストランコンジュゲートの合成のCa 2 +インジケーターをロードするためのテクニックを示しています。特に重点がこのような拡張ローディング期間中に準備の健康を維持し、分離された神経に沿って、静電気の放電を回避する方法として、技術の成功に最も重要なプロトコルのこれらの側面に配置、およびCa 2を提供することにより、軸索の生存を確保しています+断絶された軸索終末のシールを促進する。このような蛍光- 4とrhodなどの低親和性デキストランコンジュゲートのCa 2 + -指標、、最小限の前シナプスのCa 2 +動態を中断しながら、高い信号対雑音比を示している使用可能です。デキストランコンジュゲーションは、+の指標がこのようなミトコンドリアなどの細胞小器官に隔離されているのCa 2を防ぐのに役立ちます。ローディング技術は幼虫、胚や大人にも同様に適用することができます。

Protocol

  1. 任意の固定液にさらされていないクリーンな解剖皿を選択します。

  2. シュナイダーのショウジョウバエのカルシウムを含有する培地+とL -グルタミンの放浪の第3齢幼虫ショウジョウバエの幼虫を解剖、(あらゆる神経や損傷の筋線維番号7、6、13または12をカットしないでください)。

  3. 12ミクロンの先端(内径)と、ピペットに充填ガラスを選択します。

  4. 注射器とチューブを使用すると、(ピペットに負圧を適用するために)ピペットの先端がふさがれていないことを確認してください。

  5. ガラスピペットの長さを挿入することができる微細なプラスチック製の充填、フィラメントを選択します。

  6. プラスチック製のフィラメントに5mMのデキストランコンジュゲートのCa 2 +インジケーターの〜1cmを描く。

  7. すべてのセグメントの神経を切る。

  8. ピペットの先端が解剖幼虫の腹側正中線に近づくことを可能にするランプでピペットをサポートしています。

  9. ピペットの終わり(シュナイダーの培地の少量を含む)に、神経をつまむことなく、第4セグメントに神経の切断端を描画します。

  10. チューブを外し、フィラメントの端が神経の切断面の50ミクロン(神経を触れないように)以内になるまでピペットにプラスチック製のフィラメントを挿入する。

  11. イジェクト十分なカルシウムの約33%(最終濃度は、<2mMのはず)でシュナイダーの培地の量を増加させる神経終末上に+ -インジケータ。重要 - これは、神経を切断してから5分以内に完了する必要があります。

  12. 神経負荷しながら、室温で暗所で準備を置きます。

  13. 40分には、フィラメントを使用してのCa 2 + -インジケータを削除した後。

  14. 代わりにピペットを残し、これが神経に刺激パルスを適用するために使用されるため、新鮮なシュナイダーの培地で完全にそれを埋める。

  15. のCa 2 +インジケーター少なくとも60分間神経で平衡させるが、これ以上の4よりも時間は、Ca 2 +イメージングを開始する前に。

  16. それは均衡している間30分ごとに新鮮なシュナイダーの培地で準備をすすぐ。

  17. イメージングの前に20分第六ソリューション(;マクラウドら2002; 2003年HL6)ライク血リンパとシュナイダーの培地を交換してください。

  18. L -グルタミン酸またはグルタミン酸は、神経誘発筋収縮(。。Reiffら2002; 2005年マクラウドら2004)を防ぐために、後シナプスのグルタミン酸受容体を脱感作するために7mmのでHL6溶液に添加することができます。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Schneider’s Insect Medium Reagent Sigma-Aldrich S0146 must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate Reagent Sigma-Aldrich G1626

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References

  1. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
  2. Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
  3. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  4. Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
  5. Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).

Comments

6 Comments

  1. I would like to know what do you use as dissection pins for the larvae, and where do you get them from?
    With thanks
    Eyal Gruntman
    Cold Spring Harbor Labs, NY

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 4:10 PM
  2. Hello Eyal. You can purchase the entomology pins from Fine Science Tools (FST) at Foster City, CA (Cat. No.²600²-10).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 5:41 PM
  3. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 27, 2009 - 2:18 PM
  4. Would you please provide me the catalogue numbers for the micro-instruments used in the larva dissection? I am starting similar dissections and have found considerable difficulty with the available intruments.
    Thanks,
    Mike Quinn
    Brock University, ON

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 4:54 PM
  5. Hello Mike. We use scissors from Fine Science Tools (FST) (Cat.No.15000-08) and No. 5 forceps, also from FST (Dumoxel).

    Reply
    Posted by: Greg M.
    January 19, 2010 - 5:14 PM
  6. Thanks Greg.
    Cheers

    Reply
    Posted by: Michael Q.
    January 19, 2010 - 9:43 PM

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