在Sf9细胞,并在海兔感觉神经元PKC移位实时成像

Neuroscience

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Summary

在这段视频中,我们证明在使用PKCS荧光标记的活细胞PKC移位可视化。

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Farah, C. A., Sossin, W. S. Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2516, doi:10.3791/2516 (2011).

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Abstract

蛋白激酶CS(PKCS)丝氨酸苏氨酸激酶,发挥核心作用,在规范的多种细胞过程,如细胞的生长和学习记忆。有四种已知脊椎动物中的PKC亚型的家庭:古典PKCS(α,βI,βII和γ),新颖的I型PKCS(ε,η),小说II型PKCS(δ和θ),非典型PKCS(ζ和ι )。古典PKCS被激活的Ca 2 +和diacylclycerol(DAG),而小说PKCS是由DAG的激活,但独立的Ca 2 +。既不钙2 +和 DAG的非典型PKCS被激活。在海兔californica,我们的模型系统来研究记忆的形成,有三个中枢神经系统特定PKC亚型从每个主要类别之一,即传统的PKC的美国总统轮船我的小说类型我PKC的美国总统轮船II和非典型PKC的美国总统轮船三。 PKCS脂激活蛋白激酶和外信号激活古典与新颖的PKCS已经经常与PKC从胞浆易位到质膜相关。因此,在活细胞中实时蛋白激酶C移位可视化已成为一个宝贵的工具,阐明导致PKC激活的信号转导通路。例如,这项技术已允许我们建立不同的PKC亚型转运不同条件下的调解不同类型的突触可塑性和激活PKC的美国总统轮船II,5 - 羟色胺(5HT)需要DAG和磷脂酸(PA)的生产易位1-2。更重要的是,相同的神经元的能力,可视化多次允许我们,例如,在精致的细节 3 PKC反应来衡量的脱敏。在这个视频中,我们展示了准备的Sf9细胞培养的每一步,海兔感觉神经元的文化已另一视频第4条所述,表示在Sf9 细胞,并在海兔感觉神经元和PKC的易位的生活成像PKCS荧光标记反应不同的活化剂,使用激光扫描显微镜。

Protocol

1。昆虫细胞单层培养的制备及保养

  1. 在组织培养罩的Sf9细胞培养和维护。
  2. Sf9细胞来源于草地夜蛾卵巢细胞(Sf21细胞),可作为冷冻细胞购自Invitrogen Grace的媒体。
  3. 广场8毫升Grace的昆虫培养基(1X),其中30%小牛血清(FBS),已在一个倾斜的脖子75 厘米2细胞培养瓶中加入。
  4. 在37℃水浴融化Sf9细胞冷冻管迅速来回移动管(约1-2分钟)。
  5. Sf9细胞转移到75厘米的2细胞培养瓶和岩石板,用手轻轻地均匀地分发细胞。
  6. 孵育1-2小时在27℃直至细胞附着。
  7. 删除旧的介质,含30%FBS和10毫升freshGrace的昆虫媒介取代。
  8. 孵育27℃直至细胞融合。
  9. 为了保持单层培养,Sf9细胞融合烧瓶中删除旧培养基,加入含10%胎牛血清的Grace的昆虫媒介的5毫升。
  10. 烧瓶的侧轻轻敲击几次分离Sf9细胞。
  11. 使用10 mL的吸管和一个移液器,移液器媒体一次轻轻的向上和向下,喷洒烧瓶壁吹打下来。将细胞15毫升无菌Polysterene管。
  12. Grace的昆虫媒介的8毫升与10%FBS(1:5稀释维持数期增长)在新的75厘米 2细胞培养瓶和岩石板手轻轻的Sf9细胞悬液,加入2毫升。
  13. 孵育27℃直至细胞融合。

2。 PKCS荧光标记在Sf9细胞中的表达

  1. 对于实时成像实验,文化的Sf9细胞上的35毫米MatTek玻璃底部文化disheswith一个14毫米,盖玻片厚度为0.16至0.19毫米的玻璃表面。
  2. PKCS荧光蛋白标记的表达的Sf9细胞,利用Cellfectin II转染试剂在下面详细的修改制造商的以下建议。
  3. 第1天:电镀细胞之前,对待每个MatTek菜Grace的昆虫媒介为至少30分钟,含10%胎牛血清。
  4. Sf9细胞计数从第11步使用hemacytometer(以上)。
  5. 板0.05 × 10 6细胞上的每一个总体积150μLMatTek玻璃盖玻片。允许细胞附着在室温下30分钟。
  6. 加入2毫升Grace的补充慢慢地在同一时间,以避免细胞分离到每道菜1毫升含10%胎牛血清。
  7. 孵育27℃过夜。
  8. 从这点上,利用昆虫细胞与质粒DNA转染的制造商的建议。
  9. 第2天:转染的Sf9细胞与荧光标记的使用PKCS Cellfectin二转染试剂。我们经常合作与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和单体红色荧光蛋白(MRFP)(先前已经描述2,5质粒的构建的细节)标签系统PKCS表示。一次在一个荧光蛋白的表达产量约70-80%,表达细胞转染后72小时。两个荧光蛋白的共表达减少约30%,共同表达细胞转染效率。当共同表达EGFP标记的蛋白激酶C和MRFP标签的蛋白激酶C,使用最佳的蛋白表达MRFP标签蛋白的2倍更多的质粒DNA。
  10. 现场演奏成像48-72小时后转染(最佳蛋白的表达,等待72小时)。

3。 海兔感觉神经元中表达的荧光标记的PKCS

  1. 海兔的神经元细胞培养制备已在视频文章赵和他同事4。
  2. PKCS荧光蛋白标记的表达在海兔感觉神经元,用显微注射过程的详细。
  3. 准备在蒸馏水中的1%快绿(FCF)原液,过滤器使用注射器和一个28毫米的注射器过滤器(0.20微米)。分装并储存于-20 ° C
  4. 微量注射的感觉神经元可进行1天或2天,后分离的神经元,但我们发现,等待2天,可以更好的细胞黏附盖玻片。
  5. 第2天,感觉神经元的隔离后,解冻快速绿色等分,并再次使用的注射器和注射器过滤器的28毫米(0.20微米)过滤。
  6. 准备在蒸馏水中的质粒DNA溶液中含有0.5%的快速绿色。可用于高0.4μg/μL的质粒DNA的浓度,但它是不建议去以上这些价值观。
  7. 过滤用1 ml注射器和4毫米的注射器过滤器(0.20微米)的质粒DNA /快速绿色解决方案。
  8. 离心15分钟用一个麦克风的质粒DNA在16110 XG /快速的绿色解决方案rocentrifuge。
  9. 准备使用电极拉马的神经元显微注射(萨特火焰山/布朗微管拖轮,P - 97型)电极是雪亮的。使用一箱长丝,拉1毫米外径,内径0.75毫米和100毫米的长度内丝(世界精密仪器TW100F - 4)采用薄壁玻璃毛细管玻璃微电极。对于拉动显微注射电极的更多信息,请参阅萨特电极食谱
  10. 填写每个电极与2μL质粒DNA /使用microloader枪头(Eppendorf公司CA32950 - 050),快速的绿色解决方案。
  11. 转让MatTek玻璃底培养皿中含有海兔的神经元文化,以显微注射站。
  12. 显微注射站包括以下内容:一个自制的大玻璃舞台举行振动隔离表(动力学系统隔振工作站),与外部的卤素灯照明的立体范围,显微(萨特赫胥黎墙型微操作机器人的培养皿它允许在三个轴粗,超细定位),一个电极连接到气动泵(世界精密仪器的Pico - PV820气动泵)的持有人。气动泵的压力输入连接到一个压缩的氮气罐。
  13. 一个微电极插入微电极支架。
  14. 一个立体显微镜下观看,插入到细胞核内的微尖。
  15. 提供短期的氮压力脉冲(持续时间10至100毫秒,20磅/英寸2),直到原子核变得uniformely绿色。
  16. 4小时在室温下孵育细胞,并保持在4℃,直到使用。为了达到最佳的PKC易位,执行生活成像实验20 - 24小时后注射。

4。可视化在生活Sf9细胞,并在海兔感觉神经元PKC的易位

  1. 成像,我们使用的Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜与AXIOVERT 200。
  2. Sf9细胞和海兔感觉神经元以下除外:Sf9细胞与x63油浸物镜成像,而海兔感觉神经元与X40油浸物镜成像成像协议。 Sf9细胞成像维持在26-27 摄氏度的温度控制腔, 而海兔感觉神经元是在室温保持18-20摄氏度左右成像
  3. 我们用一个30兆瓦的氩激光(488nm激发)50%的激光输出图像与EGFP蛋白激酶C和一个氦氖激光(543nm激发)MRFP蛋白标记的图像的PKC标签。氩和氦氖激光线衰减到4%,和50%的传输输出分别成像和针孔前调整到一个。
  4. 重要的是有稳定成像舞台上的培养皿,以避免运动或振动。
  5. 删除从盘留在菜总量的1毫升10毫升吸管轻轻使用1毫升培养基。
  6. 在细胞的细胞核中可以看出中间部分图片。
  7. 设置了10-20共聚焦图像,拍摄一张照片,每30秒的时间序列。
  8. 启动时间序列。
  9. 2张照片(后30秒的时间点)后,添加1毫升的药物(2X浓度)的使用P1000的吸管细胞之上轻轻落降。该药物是不断增加约30秒。
  10. 有些药物诱导快速移位,可立即显示下列药物治疗(在60秒的时间点),而其他诱发一个缓慢的易位,这是唯一的最佳治疗后(1电影和电影2)5-10分钟。
  11. 如果药物需要被冲走,使用2 × 10 mL的吸管做洗,上下吹打洗涤缓冲液,轻轻一个吸管的菜一边和对方pipeting媒体。
  12. 如果洗一直有效,如果该药物的影响是可逆的的,蛋白激酶C在30-60秒内将恢复到细胞质。
  13. 作为LSM文件保存的电影。
  14. 美国国立卫生研究院使用Image J软件打开LSM的文件和量化的图像前和后的药物治疗。定量已在别处1。

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Discussion

我们已经描述了一种技术,实时图像PKCS荧光标记的易位在Sf9细胞, 并在海兔感觉神经元。 Sf9细胞提供了一个简单的系统形象PKC的易位,因为培养和转染他们是相当平直向前。相比之下,微量注射海兔感觉神经元需要一些时间来掌握,最多几个月。有关这项技术的困难,包括电极堵塞。过滤注射液和离心它通常会帮助,但有时气泡在电极形成却使。我们发现,使用microloader枪头填补电极代替毛细作用,有助于最大限度地减少气泡的形成。关于活成像,两个因素需要成像会议期间要严格控制温度和运动。温度波动可能会影响易位,并应考虑使用一个温度控制厅。要避免在成像运动,振动隔离表都可以使用。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是支持由加拿大卫生研究所(CIHR)批准机构韦恩南Sossin。阿玲A.法拉是从全宗德拉RECHERCHE EN桑特魁北克(FRSQ)和康拉德哈灵顿奖学金博士后奖学金获得者。作者想感谢乔安娜探条,玛格丽特黑斯廷斯和玛格丽特Labban与视频拍摄和图形概述帮助马德琳里士满池帮助。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Sf9 frozen cells Spodoptera frugiperda ovarian cells Invitrogen B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid Reagent GIBCO, by Life Technologies 11605-094 Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask Tool Corning 430720 Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum Reagent CanSera CS-C08-500 Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe Tool BD Biosciences 309604 Use to filter Fast Green solution
Syringe Tool BD Biosciences 309602 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter Tool Corning 431229 Use to filter Fast Green solution
Filter Tool Corning 431212 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish Tool MatTek Corp. P35G-1.5-14-C Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent Reagent Invitrogen 10362-100 Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF Reagent Sigma-Aldrich F-7252 Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries Tool World Precision Instruments, Inc. TW100F-4 Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip Tool Eppendorf CA32950-050 Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump Tool World Precision Instruments, Inc. SYS-PV820 Part of microinjection station
Micr–lectrode holder Tool World Precision Instruments, Inc. MPH6S Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator Tool Sutter Instrument Co. MP-85 Use to position micr–lectrode in the three-axis

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References

  1. Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
  2. Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
  3. Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
  4. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. (2009).
  5. Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).

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