Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Published 2/02/2011
8 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection
 

Summary

Здесь мы опишем метод эффективно расширить и очистить большое количество человеческих NK клеток и оценить их функцию.

Cite this Article

Copy Citation

Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells . J. Vis. Exp. (48), e2540, doi:10.3791/2540 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Выделение МНПК от Баффи Coat

Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) получаются плавучей центрифугирования плотности на Ficoll-Paque от здоровых доноров лейкомассы образцы полученных лейкафереза.

  1. Ficoll-Paque центрифугирования делается как протокол на одного производителя с незначительными изменениями.
  2. Добавить PBS к нормальной донорской крови-банк лейкомассы до конечного объема 140 мл (типичное пальто Баффи объем 40-70 мл).
  3. Слой 35 мл образца пальто Баффи на 15 мл Ficoll-Paque (4 трубы).
  4. Центрифуга при 400g в течение 20 минут без тормозов.
  5. Восстановление МНПК от Ficoll-Paque: плазма интерфейс, не выбрасывайте эритроцитов на дне Ficoll-Paque.
  6. Вымойте МНПК три раза PBS, центрифугирования каждый раз при 400g в течение 10 минут.
  7. МНПК могут быть использованы непосредственно для НК расширения ячейки на этом этапе или NK клетки могут быть выделены путем RosetteSep (раздел 4)
  8. Оставшиеся МНПК могут быть заморожены в ФБС, содержащего 10% ДМСО в жидком азоте.
  9. Аспирируйте Ficoll и собирать эритроциты, начиная с шага 5 на две трубки центрифуги 50 мл, мыть три раза PBS (добавляют к 50 мл отметки), каждый раз аспирата супернатант скимминга верхней части слоя РБК удалить гранулоцитов.
  10. Эритроциты могут быть использованы непосредственно для RosetteSep  очистки НК-клеток (см. раздел 4) или храниться в равном объеме решение Alsever это при 4 ° C для дальнейшего использования (эритроциты можно хранить в течение не более 4 недель).

2. Н. К. сотовый расширения

Расширение NK клетки может быть начато использование МНПК или очищенной NK клеток. Количество МНПК использоваться для расширения может варьироваться в зависимости от количества НК клетки желаемого в конце трехнедельного расширения, обратитесь к представителю результаты разделе. (См. примечание 1)

СТИМУЛЯЦИЯ 1

День 0

  1. Для каждого 5x10 6 МНПК быть расширен, считать и облучать 10x10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр.
  2. Сообщение облучения, мыть клетки с PBS и ресуспендируют в НК ячейки расширения носителя (NKEM).
  3. Семенной 5x10 6 МНПК с 10х10 6 облученных К562 CL9 mIL21 (1:2) в 40 мл NKEM в T75 колбу и поместить его в вертикальном положении в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.

Дни 3 и 5

  1. Восстановление клетки центрифугированием при 400g в течение 5 мин и заменить половину средств массовой информации со свежими NKEM (добавление свежей Ил-2 для всего объема средств массовой информации) и продолжить культуры.

СТИМУЛЯЦИЯ 2

День 7

  1. Подсчитайте количество клеток в культуре в конце недели.
  2. Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2)
  3. Для каждого 5x10 6 ячеек, которые будут restimulated, считать и облучать 5x10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр.
  4. Добавить равное количество облученных К562 CL9 mIL21 (1:1) и ресуспендируют в NKEM на 2.5x10 5 всего клеток / мл (см. Примечание 3).
  5. Семенной клеток в колбах T75 (максимум 50 мл на флакон).

Дни 10 и 12

  1. Подсчитайте количество клеток.
  2. Изменение всей СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).

День 14

  1. В конце две недели расширения подсчета количества клеток в культуре.
  2. Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2)
  3. Если экспансия началась с МНПК NK клетки могут быть очищены на данном этапе расширение с помощью протокола RosetteSep очистки (см. раздел IV). Если расширение началось из очищенных натуральных киллеров переходите к стимуляции 3.
  4. После очистки отложить 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии для проверки чистоты NK клеток (как в шаге 8).
  5. Приступить к стимуляции 3, используя все очищенные клетки NK (См. примечание 4).

СТИМУЛЯЦИЯ 3

  1. Ресуспендируют NK клеток с облученным К562 CL9 mIL21 (1:1) в NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).

Дни 17 и 19

  1. Подсчитайте количество клеток.
  2. Изменение СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3).

День 21

  1. По истечении трех недель расширения подсчета количества клеток в культуре.
  2. Восстановление 1x10 6 клеток для анализа потока цитометрии для полного ячейки NK панели антител фенотипирование (см. Таблицу 1).
  3. Замораживание клеток в ФБС, содержащий 10% ДМСО при максимальной плотностью 5х10 7 клеток на флакон для будущего использования.

3. Н. К. сотовый Цитотоксичность Пробирной

  1. Оттепель флакон НК-клеток и семян NKEM, за день до ЧПrforming цитотоксичность анализа, чтобы восстановление.
  2. Для каждого НК анализа цитотоксичности клеток с использованием одной линии клеток-мишеней, 6x10 5 NK клеток и 3х10 5 клеток-мишеней не требуется (см. примечание 5).
  3. Подготовка CAM-Медиа путем разбавления кальцеин-AM (акции 1 мг / мл в ДМСО) в NKEM (См. примечание 6).
  4. Ресуспендируют 10 6 клетки-мишени в 1 мл CAM-медиа (см. Примечание 7).
  5. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, при периодическом встряхивании.
  6. Ресуспендируют NK клеток на 1x10 6 клеток / мл и добавить 200uL НК клеточной суспензии для каждого из 3 скважин U-дно 96-луночного планшета соответствующие до 10: 1 E: T соотношение показано на рисунке 1. (См. Примечание 8)
  7. Добавить 100 мкл полной СМИ, чтобы все оставшиеся лунки за исключением "Максимум".
  8. Добавить 100 мкл 2% Тритон Х-100 на "Максимум".
  9. Выполните серийные разведения NK клеток для последующей 5 E: T отношений путем передачи 100 мкл клеток каждый раз, хорошо перемешать. Отменить 100 мкл из последних скважин (E: T отношение 0.3125:1).
  10. Через 1 час загрузки кальцеин, мыть клетки-мишени в NKEM дважды, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. (См. Примечание 9)
  11. Пересчет клеток-мишеней и ресуспендируют в 1х10 5 клеток / мл.
  12. Добавить 100 мкл клеток-мишеней в каждую лунку (1x10 4 / а). Центрифуга в течение 1 мин на 100 г инициировать ячейки контакта.
  13. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов.
  14. Смешайте культуры осторожно с помощью пипетки с 100 мкл pipetter для того, чтобы равномерно приостановить выпущен кальцеин, замедления вращения пластины на 100 г в течение 5 минут для осаждения клеток и передачи 100 мкл надосадочной к новой пластинкой заботясь, чтобы избежать пузырей. Поп пузыри, которые могут форму с помощью тонкой иглы.
  15. Прочитано пластины с использованием флуоресцентных читателя пластины (возбуждение фильтра 485 нм, эмиссия фильтр 530 нм). Нижняя читать рекомендуется.
  16. Рассчитать процент Конкретные Лизис по формуле [(тестовый релиз-спонтанное выделение) / (максимальное релиз - спонтанное выделение)] х 100.

4. Н. К. сотовый Очистка RosetteSep

  1. Возьмите 100-кратного избытка эритроцитов, что и МНПК или расширенных клеток, в 50 мл трубки (100:1 РБК: МКПК).
  2. Если вы используете свежие эритроциты приступить непосредственно к следующему шагу, или если эритроциты хранились в растворе Alsever с, подсчитать количество эритроцитов и промыть соответствующий (100-кратного избытка) количество эритроцитов с PBS с добавлением 2% ЭТС три раза, центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут каждый раз.
  3. Комбинат эритроцитов с МНПК с шагом 1,7 или расширенных клетки шагом 2,10 в PBS + 2% ЭТС для конечного объема 1 мл на 5x10 7 из МНПК или расширенных клеток.
  4. Добавить 1 мкл из RosetteSep  человеческих клеток NK обогащению Коктейль на 1x10 6 из МНПК или расширенных клеток.
  5. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут с нежным смешивания каждые 5 минут.
  6. Добавить равным объемом PBS + 2% смеси FBS мягко и слой поверх Ficoll-Paque.
  7. Повторите шаги Ficoll-Paque центрифугирования описано для изоляции РВМС (раздел I).
  8. Граф Н. К. клетки восстановились после очистки и отложите 5x105 клеток для phenotpying методом проточной цитометрии для НК ячейки чистоты (Шаг 8).

5. Примечания

ПРИМЕЧАНИЕ 1. НК-клеток может быть расширен непосредственно из МНПК, или от RosetteSep  очищенной NK клеток. Мы отметили, аналогичные эффективность расширения, но некоторые доноры могут иметь очень низкие НК номера сотовых в результате чего трудности очистки от RosetteSep до расширения.

ПРИМЕЧАНИЕ 2. Мы обычно используют CD56-FITC, CD16-PE и CD3-PE-Cy5 для фенотипирование в ходе расширения, перечисляя НК-клеток, как те, которые CD3-отрицательных и CD16-CD56 или-положительными.

ПРИМЕЧАНИЕ 3. При каждом изменении СМИ или стимуляции, ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 5 / мл держать РВМС / NK на номера сотовых или менее 2 миллионов на мл на пике стадии расширения. Это позволит предотвратить истощение питательных веществ и помочь в достижении максимального расширения и выживания.

Примечание 4. НК скорость расширения доноров зависимых и в конце стимуляции 1 или 2 части клетки могут быть заморожены, а часть еще больше расширить в зависимости от экспериментальных нужно. У нас были хорошие успехи в использовании замороженных клеток для разложения на более позднее время.

ПРИМЕЧАНИЕ 5. В целях обеспечения права на ошибку мы рекомендуем использовать не менее 7х10 5 NK клетки ресуспендировали в 700 ULS из NKEM и 4x10 5 кальцеин-АМ окрашенные клетки-мишени ресуспендировали в 4 мл NKEM для создания цитотоксичность анализа. При использовании многоканальной пипетки для посева клеток-мишеней больших объемов ячеек (до 6x10 5 в 6 мл) могут потребоваться в зависимости от размера средств массовой информации бассейна используется. Также рекомендуется НК номера сотовых специально для E: T отношения шоу в протокол, для использования более высоких E: T соотношение увеличенияНК номера сотовых на мл соответственно (например, для 40:1 E: T соотношение использования 4x10 6 клеток / мл)

ПРИМЕЧАНИЕ 6. Рекомендуется выполнять предварительные кальцеин-АМ загрузки титрования для линии клеток-мишеней выбора, используя следующие разведения 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 и 1:100 для достижения оптимальной разницу между максимальной и спонтанное освобождение.

ПРИМЕЧАНИЕ 7. При использовании приверженцем клеточной линии, как цель, сначала подготовить суспензии отдельных клеток с использованием не-ферментативной клеточной диссоциации буфера. При выполнении ADCC, готовят дубликаты трубки клеток-мишеней в CAM-медиа.

ПРИМЕЧАНИЕ 8 При выполнении ADCC, добавить же NK клетки 3 скважины соответствующей 10:01 E:. Т для ADCC. Повторите эти действия для дополнительных доноров. Повторите эти действия для дополнительных клеток-мишеней.

Примечание 9. При выполнении ADCC эксперимента, после 45 минут загрузки кальцеин, добавьте 10ug из антител, специфичных для стимулирования ADCC против клеток-мишеней. После 15 минут, промойте клетки-мишени в полной среде в два раза, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. Ресуспендируют клеток 1х10 5 клеток / мл и приступить к следующему шагу в протокол.

6. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ

Рисунок 2
Рисунок 2. Когда расширение выполняется согласно схеме, описанной выше, с использованием 5x106 МНПК в качестве исходного материала, типичные НК клетка дает диапазон от 1x10 9 до 10 10 клетки (донора зависимыми изменчивость). На рисунке показана НК ячейки раза расширения (п = 19) по сравнению с НК клетки, присутствующие в оригинальный продукт (средний + / - квартиль).

Рисунок 3
Рисунок 3. Расширены клетки NK выражения различных NK-клеточных рецепторов, которые сопоставимы с невспененные первичной NK клеток с несколькими исключениями (CD11b, CD160 и CD244).

Рисунок 4
Рисунок 4. МНПК восстановление после Баффи пальто доноров зависимым и может варьироваться от 6 до 300x10 800x10 6. NK клетки могут включать в себя 2% - 18% МНПК. Для очистки RosetteSep расширенного клеток, восстановления чистых натуральных киллеров на 14 день составляет от 40-70%. Следуя рекомендуется протокол расширения и очистки, Н. К. чистоты ячейка 99% можно ожидать.

Рисунок 5
Рисунок 5. Расширенное НК-клеток показали, цитотоксичности против ряда опухолевых клеточных линий, включая нейробластома, борьбы с отмыванием денег, остеосаркома и меланома (представительных AML убийство показано в процентах конкретных лизис).

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Лоуренса Купер, Harjeet Сингх, и Ленка Hurton за их работу по созданию начальной К562 AAPC и mIL21 векторов синтеза.

Финансирование этих работ было предоставлено UT MD Anderson врач ученый Программа, Фонд святого Baldrick, и легенды Friendswood.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

90% RPMI 1640 Cellgro
10% Fetal Bovine Serum Gibco
1x Penicillin / Streptomycin Cellgro
1x L-Glutamine Gibco Filter Sterilize media before use.
50 U/ mL IL2 Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.
Name Company Catalog Number Comments

PBMC and NK Cell Isolation

Ficoll-Paque GE Healthcare
Alsever's solution Sigma)
RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail Stemcell Technologies)
Name Company Catalog Number Comments

NK Cell Cytotoxicity Assay

Calcein-AM Invitrogen
Name Company Catalog Number Comments

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below:

Tube 1: (total volume 100)

Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 555748 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 555749 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 557224 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 340442 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 2: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: NKp30 PE BD Pharmingen 558407 Volume: 5
Antibody: NKp44 PE BD Pharmingen 558563 Volume: 5
Antibody: NKp46 PE BD Pharmingen 557991 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD16 Alexa 647 BD Pharmingen 557710 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 70

Tube 3: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: KIR2DL1 PE R&D Systems FAB1844P Volume: 5
Antibody: KIR2DL2/3 PE Miltenyi Biotec 130-092-618 Volume: 5
Antibody: KIR3DL1 PE R&D Systems FAB12251P Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: NKG2D APC BD Pharmingen 558071 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 70

Tube 4: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD11b PE BD Pharmingen 555388 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD27 APC BD Pharmingen 558664 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 5: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD266 (DNAM-1) PE BD Pharmingen 559789 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD160 Alexa647 eBiosciences 51-1609-42 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 6: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD244 (2B4) PE BD Pharmingen 550816 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD197 (CCR7) APC eBiosciences 17-1979-42 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKenna, D. H. Jr Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience. Transfusion. 47, 520-520 (2007).
  2. Koehl, U. ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children. Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).
  3. Klingemann, H. G., Martinson, J. ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications. Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).
  4. Ayello, J. Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering. Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).
  5. Carlens, S. A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells. Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).
  6. Boissel, L. Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells. Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).
  7. North, J. Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation. J Immunol. 178, 85-85 (2007).
  8. Berg, M. Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells. Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).
  9. Fujisaki, H. Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy. Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).
  10. Fujisaki, H. Replicative potential of human natural killer cells. Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).
  11. Gong, W. Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15. Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).

Comments

8 Comments

  1. I found this video very interesting:) thank you so much for such a wonderful information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2011 - 2:10 PM
  2. You are very welcome! it was perhaps the most fun I have had in writing a paper :-)
    Let me know if we can be of any help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2011 - 3:41 PM
  3. Very interesting protocol. Would it be possible to obtain your K56² Cl9 mIL²1 cell line? If so, how should one proceed to make that happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 5:55 AM
  4. We have shared the cell line with many investigators in the US and abroad. Please contact me directly at dalee@mdanderson.org and I can initiate the process. You may also see our recent publication in PLoSONE with more detailed phenotypic and functional analysis using this expansion system at http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0030²64

    Reply
    Posted by: Dean L.
    January 23, 2012 - 9:42 PM
  5. I'm very interested in this ,rencenly I have been searching for data about NK cells,and thank you for sharing the information.

    Reply
    Posted by: zhang y.
    February 28, 2013 - 5:10 AM
  6. I found your article very interesting; and I am sure it will be very useful for my research.
    I have a question: how do you calculate the fold increase in NK-cell numbers, when you start from PBMC?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Uriel M.
    April 7, 2015 - 9:35 PM
  7. Thank you. I will be happy to elaborate on how we calculate fold expansion of NK cells. Please contact me at sssomanchi@mdanderson.org.

    Reply
    Posted by: Srinivas S.
    April 20, 2015 - 5:14 PM
  8. Thank you for this comprehensive video. It was really useful.
    In our lab we made an analogous feeder cell line: derivative of K562 with expression of 4-1BBL and mbIL21. I have performed a set of experiments with donor's PBMC according to your methodology. As a result we have got some problems with viability of donor's cells. So, if it is convenient for you, can we discuss our results in details?

    Reply
    Posted by: Alexandr M.
    March 21, 2017 - 9:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats