人外周血NK细胞的扩展,纯化和功能评估

Published 2/02/2011
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Immunology and Infection
 

Summary

在这里,我们描述了一种方法,有效地扩大和净化人类NK细胞的大量和评估它们的功能。

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Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells . J. Vis. Exp. (48), e2540, doi:10.3791/2540 (2011).

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Abstract

自然杀伤(NK)细胞,发挥对各种传染病的微生物和肿瘤免疫监视的重要作用。 NK细胞在体外的能力,扩大有限已成为制约NK细胞免疫治疗的发展。在这里,我们描述了一个方法,有效地扩大功能NK细胞体外大量使用K562细胞表达膜结合IL21,作为人工抗原提呈细胞(AAPC )。

NK细胞收养疗法利用细胞耗尽的T细胞或NK细胞的阳性选择捐助的稳态leukapheresis获得的产品。该产品通常是在IL - 2激活过夜,然后管理翌日1。由于低频外周血NK细胞,NK细胞的数量相对较少,已交付的临床试验。

不能传播NK细胞在体外已为最佳的临床结果产生足够的细胞数量的限制因素。一些NK细胞的扩张(超过1-2周的5-10倍)通过高剂量IL - 2仅2。激活自体T细胞可以介导NK细胞扩张,想必也通过局部细胞因子3的释放。与间质的基质或人工抗原提呈细胞(AAPCS)的支持,可以支持扩展的NK细胞从外周血和脐带血 4 。结合NKp46和CD2抗体包被的磁珠激活NK细胞扩张(美天旎生物技术公司,奥本CA)是目前市场上销售,造成约100倍,在21天的扩张。

使用AAPC扩大或激活NK细胞的临床试验正在进行中,一个白血病细胞株CTV - 1素和激活NK细胞无显着扩大。一,二审利用NK细胞扩展的EB病毒拼箱,实现了平均490倍,扩大在21天6。第三,利用基于一个K562 AAPC转4 - 1BBL(CD137L)和膜结合IL - 15(MIL - 15)7,取得了在21天的平均NK扩张277倍。虽然,NK细胞扩大使用K562 - 41BBL - mIL15 AAPC高度细胞毒性, 在体外体内未展开的NK细胞相比,参与的ADCC,其增殖是有限的,归结到端粒缩短8由衰老。最近的NK细胞的350倍扩大使用K562细胞表达MICA,4 - 1BBL和IL15 9的报道。

我们的NK细胞扩展的方法描述,此处产生的NK细胞不衰老的迅速扩散,实现在21天的中位数为21,000倍扩张。

Protocol

1。从Buffy大衣的外周血单个核细胞的分离

外周血单个核细胞(PBMC)的聚蔗糖 - 帕确来自健康捐赠者巴菲外套leukapheresis派生样本的浮力密度离心获得。

  1. 聚蔗糖帕确离心作为生产商的协议稍作修改。
  2. PBS将正常的捐助者的血液银行捉鬼外套到终体积为140毫升(典型的棕黄色大衣量为40-70毫升)。
  3. 层35毫升15毫升(4管)聚蔗糖 - 帕确捉鬼外套样品。
  4. 在400克离心20分钟不带刹车。
  5. 恢复从聚蔗糖 - 帕确外周血:等离子接口,不放弃的聚蔗糖 - 帕确底部的红细胞。
  6. 洗净外周血单个核细胞用PBS洗3次,每次10分钟,离心于400克。
  7. 在这个阶段的NK细胞膨胀或NK细胞,外周血单个核细胞可以直接使用可以通过RosetteSep隔离(第4)
  8. 剩余的外周血单核细胞可以被冻结在FBS的液态氮中含10%DMSO。
  9. 吸聚蔗糖和收集到两个50 mL离心管中,从第5步中的红细胞,用PBS(添加50毫升大关)洗三次,每次吸出上清液略读红细胞层的顶部删除粒。
  10. RosetteSepNK细胞的纯化(参见第4节)的红细胞,可立即使用,或存储在同等体积的Alsever的解决方案,在4 ° C,为以后使用的红细胞(可存储最多为4周)。

2。 NK细胞扩张

使用外周血或纯化的NK细胞,NK细胞可以启动扩大。在结束了一个为期三周的扩张所需的NK细胞数量的基础上,量的扩张外周血可以是多种多样的,代表结果的详细信息部分。 (见注1)

刺激1

0天

  1. 对于每个5X10 6外周血扩大,数量和使用在100 Gy的伽玛辐照, 照射 10X10 6 K562 CL9 mIL21。
  2. 照射后,用PBS重悬在NK细胞扩张媒体(NKEM)洗细胞。
  3. 种子5X10 6外周血10X10 6照射K562 CL9 mIL21(1:2比例)在40毫升的NKEM在T75烧瓶中,并放置在一个孵化器直立在37 ° C和5%的CO 2 。

3和第5天

  1. 恢复细胞在400克离心5分钟,并更换新鲜NKEM媒体的一半(整个媒体音量加入新鲜的IL - 2),并继续文化。

刺激2

第7天

  1. 计数细胞的数量,在文化,在一个星期结束。
  2. 抛开5X10 5分型流式细胞仪检测细胞(见注2)
  3. 对于每个5X10 6 restimulated细胞,数量和使用伽玛辐照在100 Gy的照射5X10 6 K562 CL9 mIL21 。
  4. 在总额2.5 × 10 5细胞/ mL添加照射K562 CL9 mIL21(1:1比例),重悬在NKEM人数相等(见注3)。
  5. 种子细胞在T75烧瓶(最高,每50毫升容量瓶中)。

10和12天

  1. 计数的细胞数量。
  2. 更改与基于手机号码的新鲜NKEM的整个媒体(见注3)。

第14天

  1. 在两个星期的扩张结束计数文化中的细胞数量。
  2. 抛开5X10 5分型流式细胞仪检测细胞(见注2)
  3. 如果扩张开始从外周血NK细胞可以在这个阶段使用扩展RosetteSep净化协议(参考第四节)纯化。如果扩张开始从纯化的NK细胞进行刺激3。
  4. 净化后预留5 × 10 5细胞表型流式细胞仪验证的NK细胞(如在第8步)的纯度。
  5. 继续刺激使用纯化的NK细胞(见注4)3。

刺激3

  1. NK细胞悬浮照射K562 CL9 mIL21 NKEM根据手机号码(1:1比例)(见注3)。

17和19天

  1. 计数的细胞数量。
  2. 更改与基于手机号码的新鲜NKEM的媒体(见注3)。

第21天

  1. 在三个星期的扩张结束计数文化中的细胞数量。
  2. 恢复1 × 10 6流式细胞仪分析细胞完整的NK细胞表型抗体面板(见表1) 。
  3. 冻结在FBS的细胞用含10%DMSO在5X10 7%,以供将来使用的小瓶细胞的最大密度。

3。 NK细胞毒性试验

  1. 在NKEM解冻小瓶NK细胞和种子,前一天到PErforming细胞毒试验,以便恢复。
  2. 对于每个NK细胞的细胞毒作用,使用单一的目标细胞株,6x10 5 NK细胞 3X10 5靶细胞检测的要求(见注5)。
  3. 准备稀释钙黄绿素- AM NKEM(股票1 mg / ml的DMSO)(见注6)的CAM媒体。
  4. 重悬在1毫升CAM媒体10 6靶细胞(见注7)。
  5. 在37 ° C孵育1小时,偶尔晃动。
  6. 悬浮NK细胞在1 × 10 6细胞/ ml的细胞和NK细胞悬液200uL,每个U型底部的3口井的96孔板对应到10:1 E:T比例如图1所示。 (见注8)
  7. 新增完整的媒体100uL除了“最大”的所有其余井。
  8. 加入100uL 2%TRITON X - 100“最大”。
  9. 执行串行稀释度为5后续电子邮件的NK细胞,T细胞转移100uL每次比例,拌匀。丢弃从上井(E:T比值为0.3125:1)100uL。
  10. 钙黄绿素装载1小时后,在NKEM洗两次靶细胞,5分钟1200转离心。 (见注9)
  11. 重新点票的靶细胞和悬浮在1 × 10 5细胞/ mL。
  12. 每孔加入100μL靶细胞(1 × 10 4 /以及)。离心机在百克1分钟,以启动细胞接触。
  13. 在37 ° C和5%CO 2 4小时。
  14. 轻轻移液100μLpipetter以均匀暂停释放的钙黄绿素混合的文化,在百克降速盘5分钟沉淀细胞和照顾,以避免气泡100μL上清转移到一个新的板块。任何弹出的气泡,可能会形成使用细针。
  15. 用荧光酶标仪(485 nm处激发滤光片,发射滤波器530 nm)读取的板块。底部阅读建议。
  16. 根据具体裂解百分比计算公式[(测试版自发释放)/(最大释放 - 自发释放)] × 100。

4。由RosetteSep NK细胞净化

  1. 取外周血或扩大细胞,放入50 mL的管(100:1红细胞:PBMC)的100倍,多余的红细胞。
  2. 如果使用的新鲜红细胞直接进行下一步,如果在Alsever的解决方案中的红细胞计数,红细胞数量和洗适当(100倍超额)补充含2%FBS三次用PBS红细胞的数量,在1200转离心每次10分钟。
  3. 结合步骤1.7或在PBS 2.10步扩 ​​大细胞的外周血红细胞+ 2%胎牛血清的1毫升每5X10 7外周血或扩大细胞的最终体积。
  4. 添加RosetteSep1μL人类NK细胞富集外周血或扩大细胞每1 × 10 6鸡尾酒。
  5. 搅拌均匀,在室温下孵育20分钟,轻轻搅拌,每隔5分钟。
  6. 加入等体积PBS + 2%FBS混合轻轻上一层聚蔗糖 - 帕确顶部。
  7. PBMC中隔离所述的聚蔗糖帕确离心重复步骤(第一节)。
  8. 计数净化后回收的NK细胞和预留5x105细胞通过流式细胞仪检测NK细胞纯度(步骤8)phenotpying。

5。注释

注意:1。NK细胞可扩大直接从外周血单个核细胞,或从RosetteSep纯化NK细胞。我们已经注意到了类似的扩张效率,但一些捐助者可能具有非常低的NK细胞数量,造成困难净化RosetteSep前扩张。

注2:我们经常使用的表型CD56 - FITC,CD16 - PE,CD3 - PE - Cy5的扩张期间,列举那些CD3阴性,CD16或CD56阳性的NK细胞。

注3:在每个媒体的变化或刺激,悬浮细胞在2.5 × 10 5 /毫升,以保持在或低于2万每毫升外周血单核细胞/ NK细胞数量扩张的高峰阶段。这将防止营养物质的耗竭,并帮助实现最大的扩张和生存。

注4。NK的扩张速度是捐助者的依赖,在刺激1或2的细胞可以被冻结的部分月底和部分进一步扩大,根据实验的需要。我们有很好的成功,在使用冷冻细胞在稍后的时间扩展。

注5:为了让错误的空间,我们建议使用最低 7x10 5 NK细胞重悬在700 ULS NKEM和4 × 5钙黄绿素- AM染色目标4 NKEM毫升悬浮细胞设立的细胞毒试验。如果使用播种靶细胞的细胞量较高(6毫升6x10 5),可能需要的基础上正在使用的大小媒体盆地多道移液器。也是推荐的NK细胞数量是专为E:T比例显示在协议中,使用更高的发送:T比率增加NK细胞每毫升相应的号码(例如:40:1发送:T比值使用4 × 6细胞/ ml)

注6:我们建议进行了初步的首选目标细胞株的滴定钙黄绿素- AM加载,使用以下1:500,1:400稀释。 1:300,1:200和1:100,实现最大的和自发的释放之间的最佳差异。

注7:当使用贴壁细胞系作为目标,先准备单细胞悬液,使用非酶细胞分解缓冲区。如果执行的ADCC,准备在CAM媒体重复管的靶细胞。

注8,如果执行的ADCC,添加相同的NK细胞,以3口井,对应10:1 E: ADCC的T。重复更多的捐助者。重复额外的靶细胞。

注9:如果执行的ADCC实验,钙黄绿素装载45分钟后,添加诱导对靶细胞的ADCC的特定抗体10ug。 15多分钟后,靶细胞完全培养基清洗两次,5分钟1200转离心。悬浮细胞在1 × 10 5细胞/ mL,并在协议的下一步骤进行。

6。代表性的成果

图2
图2当膨胀是按照计划进行上文所述,典型的NK细胞产生范围从1x10 9 10 10个细胞(捐助者的依赖变异)为起始原料,采用5x106外周血单个核细胞。图中显示NK细胞倍的扩张(N = 19)相比,在原有的产品中存在的NK细胞(中位数+ / - 四分位数)。

图3
图3:扩大NK细胞表达不同的NK细胞受体与少数例外(CD11b表达,CD160和CD244)未展开的主要NK细胞相媲美的。

图4
图4。外周血从Buffy大衣的恢复是捐助者的依赖,范围可以从300x10 6 800x10 6 。 NK细胞可占2% - 18%的外周血单个核细胞。 RosetteSep扩大细胞的纯化,回收纯NK细胞从40-70%14天范围。通过以下建议扩大和净化的协议,NK细胞纯度达99%,可以预期的。

图5
图5。扩大NK细胞都表现出对肿瘤细胞株的范围,包括神经母细胞瘤,白血病,骨肉瘤和黑色素瘤(代表反洗钱杀害%的具体裂解所示)的细胞毒性。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

作者想感谢他们的工作,在创建初始K562 AAPC和mIL21融合向量劳伦斯库珀,Harjeet辛格和LENKA Hurton。

为这项工作提供了资金的UT MD安德森医师科学家计划,圣Baldrick的基金会,Friendswood的传奇。

Materials

Name Company Catalog Number Comments

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

90% RPMI 1640 Cellgro
10% Fetal Bovine Serum Gibco
1x Penicillin / Streptomycin Cellgro
1x L-Glutamine Gibco Filter Sterilize media before use.
50 U/ mL IL2 Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.
Name Company Catalog Number Comments

PBMC and NK Cell Isolation

Ficoll-Paque GE Healthcare
Alsever's solution Sigma)
RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail Stemcell Technologies)
Name Company Catalog Number Comments

NK Cell Cytotoxicity Assay

Calcein-AM Invitrogen
Name Company Catalog Number Comments

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below:

Tube 1: (total volume 100)

Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 555748 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 555749 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 557224 Volume: 5
Antibody: Isotype FITC BD Pharmingen 340442 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 2: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: NKp30 PE BD Pharmingen 558407 Volume: 5
Antibody: NKp44 PE BD Pharmingen 558563 Volume: 5
Antibody: NKp46 PE BD Pharmingen 557991 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD16 Alexa 647 BD Pharmingen 557710 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 70

Tube 3: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: KIR2DL1 PE R&D Systems FAB1844P Volume: 5
Antibody: KIR2DL2/3 PE Miltenyi Biotec 130-092-618 Volume: 5
Antibody: KIR3DL1 PE R&D Systems FAB12251P Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: NKG2D APC BD Pharmingen 558071 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 70

Tube 4: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD11b PE BD Pharmingen 555388 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD27 APC BD Pharmingen 558664 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 5: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD266 (DNAM-1) PE BD Pharmingen 559789 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD160 Alexa647 eBiosciences 51-1609-42 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

Tube 6: (total volume 100)

Antibody: CD56 FITC BD Pharmingen 340410 Volume: 5
Antibody: CD244 (2B4) PE BD Pharmingen 550816 Volume: 5
Antibody: CD3 PE-Cy5 BD Pharmingen 555341 Volume: 5
Antibody: CD197 (CCR7) APC eBiosciences 17-1979-42 Volume: 5
Antibody: FACS Buffer BD Pharmingen Volume: 80

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References

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Comments

8 Comments

  1. I found this video very interesting:) thank you so much for such a wonderful information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2011 - 2:10 PM
  2. You are very welcome! it was perhaps the most fun I have had in writing a paper :-)
    Let me know if we can be of any help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 19, 2011 - 3:41 PM
  3. Very interesting protocol. Would it be possible to obtain your K56² Cl9 mIL²1 cell line? If so, how should one proceed to make that happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 5:55 AM
  4. We have shared the cell line with many investigators in the US and abroad. Please contact me directly at dalee@mdanderson.org and I can initiate the process. You may also see our recent publication in PLoSONE with more detailed phenotypic and functional analysis using this expansion system at http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0030²64

    Reply
    Posted by: Dean L.
    January 23, 2012 - 9:42 PM
  5. I'm very interested in this ,rencenly I have been searching for data about NK cells,and thank you for sharing the information.

    Reply
    Posted by: zhang y.
    February 28, 2013 - 5:10 AM
  6. I found your article very interesting; and I am sure it will be very useful for my research.
    I have a question: how do you calculate the fold increase in NK-cell numbers, when you start from PBMC?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Uriel M.
    April 7, 2015 - 9:35 PM
  7. Thank you. I will be happy to elaborate on how we calculate fold expansion of NK cells. Please contact me at sssomanchi@mdanderson.org.

    Reply
    Posted by: Srinivas S.
    April 20, 2015 - 5:14 PM
  8. Thank you for this comprehensive video. It was really useful.
    In our lab we made an analogous feeder cell line: derivative of K562 with expression of 4-1BBL and mbIL21. I have performed a set of experiments with donor's PBMC according to your methodology. As a result we have got some problems with viability of donor's cells. So, if it is convenient for you, can we discuss our results in details?

    Reply
    Posted by: Alexandr M.
    March 21, 2017 - 9:48 AM

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