Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Immunology and Infection

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Summary

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

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Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544, doi:10.3791/2544 (2011).

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Abstract

La enfermedad de Lyme es una infección producida por la espiroqueta Borrelia burgdorferi patógeno, que se mantiene en la naturaleza por un ciclo de infección por garrapatas de roedores 1. Un modelo murino transmitida por garrapatas 2 ha sido desarrollado para estudiar la enfermedad de Lyme en el laboratorio. Mientras que las garrapatas ingenuo puede estar infectada con B. burgdorferi por la alimentación de los ratones infectados, el proceso de muda lleva varias semanas o meses en completarse. Por lo tanto, el desarrollo de las técnicas de infección más rápida y eficiente de garrapatas, tales como un procedimiento basado en la microinyección, es una herramienta importante para el estudio de la enfermedad de Lyme 3,4. El procedimiento requiere sólo unas horas para generar garrapatas infectadas y permite el control sobre la entrega de cantidades iguales de las espiroquetas en una cohorte de garrapatas. Esto es particularmente importante en la generación de B. garrapatas burgdorferi infectados por el proceso natural de alimentación con ratones no garantiza 100% la tasa de infección y, posiblemente, resultados en la variación de la carga de patógenos entre las garrapatas alimentadas. Por otra parte, la microinyección se puede utilizar para infectar a las garrapatas con B. burgdorferi aislados en los casos en que una cepa atenuada es incapaz de establecer la infección en ratones y por lo tanto no puede ser adquirida de forma natural por las garrapatas 5. Esta técnica también se puede utilizar para ofrecer una variedad de otros materiales biológicos en las garrapatas, por ejemplo, anticuerpos específicos o de ARN de doble cadena 6. En este artículo, vamos a demostrar la microinyección de garrapatas ninfas con in vitro cultivados en B. burgdorferi. También se describe un método para la localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino de garrapatas mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia.

Protocol

1. Microinyección de ninfas garrapatas Ixodes scapularis

1. Preparación de las agujas

  1. Fabricar varias agujas de microinyección de calefacción y tirar de un tubo de vidrio capilar mm (Instrumentos del Mundo de precisión) en un dispositivo de cristal micropipeta extractor (Narishige). Retire con cuidado los tubos capilares frágiles.
  2. Tienda sacó agujas (con la punta hacia arriba) en la cinta adhesiva en una placa de Petri.

2. La preparación de B. burgdorferi

  1. Crecer B. burgdorferi en medios de cultivo BSK 7 hasta una concentración de alrededor de 10 7 células por ml. Las espiroquetas son contados bajo un microscopio de campo oscuro por el uso de una cámara de recuento de Petroff-Hausser (Hausser científica).
  2. Pellet B. burgdorferi por centrifugación a 3.000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  3. Quitar el sobrenadante y resuspender el precipitado completamente en los medios de comunicación BSK suavemente pasando por una de 200 l micropunta estéril a una concentración final de 10 9 células por ml. Dado que las células se resuspenden en alta densidad celular, y podría agruparse, la suspensión celular se debe utilizar para la microinyección de inmediato.

3. Preparación de las garrapatas

  1. Lugar claro, cinta de doble cara adhesiva sobre un portaobjetos de vidrio.
  2. Trabajo sobre una estera pegajosa, retire con cuidado las garrapatas ninfas del envase con un cepillo pequeño.
  3. Introducir el número de garrapatas que se inyecta en la cinta adhesiva, lado ventral hacia arriba, en la misma dirección.

4. Garrapatas inyección

  1. Carga de 5 l de la B. burgdorferi la cultura en la aguja sacó capilar mediante un 20 l microloader punta de la pipeta (Eppendorf). Inspeccione la aguja de burbujas de aire atrapadas y volver a cargar la aguja con el cultivo de bacterias, si es necesario.
  2. Ver la garrapata en el microscopio binocular de disección y se centran en el área de la garrapata apertura anal. Toque suavemente la punta de la aguja capilar con el fin de romper el tubo, cuando el diámetro es ligeramente más pequeño que el de la apertura anal de la garrapata, que forman la aguja de microinyección. Este paso es fundamental ya que cualquier intento de inyectar las garrapatas con una punta de la aguja no apropiado causas de mortalidad por lesiones y posibles de la garrapata inyecta.
  3. Coloque la garrapata inmovilizado bajo el microscopio binocular de disección y se centran en la apertura anal, que está cubierto por dos placas móviles anal. Con unas pinzas finas, toque suavemente y aplicar una presión muy leve a una zona cerca de la abertura anal. Esto permitirá la separación de las placas anales y la apertura del poro anal que se conecta al intestino. Con cuidado, inserte la punta de la aguja ligeramente en la apertura anal a través de la apertura forzada de las placas anales. Inserción de la aguja debe mantenerse al mínimo, ya que la punta de vidrio podría dañar el intestino grueso semitransparente que se conecta con el recto. El uso de un microinyector equipado con pedal automático (Eppendorf), inyectar B. burgdorferi solución utilizando los siguientes parámetros: 1,000 hectopascales (hPa) la presión de inyección, tiempo de inyección de 0,2 segundos y 8 de compensación de presión hPa. Cada marca recibe una sola inyección.
  4. Después de la microinyección, la garrapata debe comportarse similar al estado de pre-inyección. Por ejemplo, la garrapata debe arrastrarse en respuesta a estímulos.
  5. Por lo general, permiten a las garrapatas a recuperarse durante 48 horas en una cámara fijada en 24 ° C con 16 horas / 8 horas de luz / oscuridad régimen de fotoperíodo y el 95% de humedad. Si una cámara no está disponible, las garrapatas inyectadas podrían ser almacenados a temperatura ambiente en condiciones de humedad dentro de un envase hermético, como una cámara de desecador regular. Si es necesario, el tiempo de recuperación de las garrapatas también pueden reducirse a unas pocas horas antes de utilizarse para la alimentación de los ratones.

2. B. burgdorferi de localización por microscopía de inmunofluorescencia confocal

1. Las garrapatas de disección

  1. Coloque una gota de tampón fosfato salino (PBS) en un portaobjetos de vidrio limpio para la disección y la otra en un portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina (Sigma) para la microscopía. Se prepara otro portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva de doble cara.
  2. Quite la marca del envase y el lugar en la cinta adhesiva de doble cara con un cepillo pequeño.
  3. Vista y el enfoque de la garrapata en el microscopio de disección. Coloque una hoja de afeitar aguda en la marca entre el primer y segundo par de patas. Presione con firmeza el corte de la señal en dos piezas permite el acceso al abdomen. Inmediatamente, se sumergen en el abdomen en una gota de PBS.
  4. Con unas pinzas muy finas, coge el exoesqueleto dorsal y ventral de todo el sitio del corte. Saque con cuidado el escudo dorsal hacia arriba y lejos de la garrapata marrón exponer los divertículos intestinales de color. Tenga cuidado de mantener las garrapatas de disección en la PBS en todo momento.
  5. El bollo semi-transparente la glándula salivaljas se encuentran a ambos lados de la región anterior del intestino, y se puede quitar en este momento, si así lo desea. Sosteniendo el exoesqueleto que permanecen en el lugar con unas pinzas, extraiga cuidadosamente el intestino fuera del abdomen.
  6. Limpie cuidadosamente el intestino, eliminando los tejidos atrapados (por ejemplo, la tráquea).
  7. Con la punta de unas pinzas finas, de forma rápida transferencia de los intestinos de garrapatas en una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio con poli-L-lisina. Separar el intestino en pedazos más pequeños con hojas finas o presionando suavemente con la punta de unas pinzas finas. Con cuidado aspirar el exceso de PBS en todo el tejido intestinal.
  8. Permitir que los tejidos intestinales de aire seco a temperatura ambiente.
  9. Fijar el intestino de garrapatas al sumergir en acetona durante 10 minutos. Deje secar al aire a temperatura ambiente. Las diapositivas se pueden almacenar en este paso por varios meses a -20 ° C en un recipiente hermético.

2. Tinción

  1. Utilizando un pañuelo de papel, retire el exceso de humedad en todo el tejido y dibujar un círculo alrededor de la barriga de garrapatas secas por un pap-pluma o cualquier otro dispositivo revestimiento barrera hidrofóbica. Esto ayudará a mantener las soluciones de tinción durante las etapas de incubación posterior.
  2. Cubren el intestino marque con una o unas pocas gotas de tampón de bloqueo (0,05% Tween-20, 5% de suero de cabra en PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El suero utilizado para bloquear depende de la fuente del animal huésped para el anticuerpo. No permita que se seque la diapositiva a partir de ahora.
  3. Poco a poco aspirar el tampón de bloqueo. Incubar el intestino con primaria adecuada y / o soluciones de secundaria de anticuerpos. Usamos isotiocianato de fluoresceína (FITC) - anticuerpo anti-B. burgdorferi de anticuerpos (Kirkegaard & Perry Laboratories) a una dilución 1:100 en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Cubra el recipiente con papel de aluminio para limitar la exposición a la luz.
  4. Retire la solución de anticuerpos por aspiración suave. Incubar el intestino con un colorante fluorescente a los tejidos marque la etiqueta, tal como 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o yoduro de propidio. Normalmente se usan 20 mg / ml de yoduro de propidio (Sigma) en PBS durante 5 min. a temperatura ambiente.
  5. Lavar 3 veces con 0,05% de Tween-20 en PBS.
  6. Monte la diapositiva en glicerina tamponada que contiene un reactivo Antifade como Slowfade (Invitrogen) y con cuidado cubrir con un cubreobjetos. Las diapositivas se pueden almacenar en este paso por unos meses a 4 ° C en un recipiente hermético. La imagen y localizar B. burgdorferi bajo un microscopio confocal.

3. Resultados representante

Posición de una marca de ninfa para la microinyección y una imagen que representa B. localización burgdorferi en el intestino de garrapatas se presenta en la Figura 1.

Figura 1
Figura 1. Microinyección y la localización de la B. burgdorferi en el intestino de garrapatas.
(A) Vista ventral de una ninfa I. garrapata scapularis posicionado para la microinyección. Culo de apertura (cabeza de flecha), con aguja insertada microinyección (flecha) se muestra con una lupa en el recuadro. Una pinza fina se utiliza para aplicar una presión suave para el cuerpo, lo que permitió la separación de las placas anales y la apertura del poro anal para la microinyección. La aguja se llena con una solución de azul brillante de Coomassie para mejorar la visibilidad. (B) Los resultados representativos de la imagen confocal de inmunofluorescencia B. burgdorferi en intestino de garrapatas. Región anterior de un divertículo del intestino se muestra. Núcleos intestinal y espiroquetas (flecha) se marcan con yoduro de propidio (color rojo) o FITC-conjugado anti-B. burgdorferi (color verde), respectivamente. Bar = 20 micras.

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Discussion

Aquí se demuestra un procedimiento basado en la microinyección de infección rápida y eficiente de las garrapatas Ixodes ninfa con el patógeno bacteriano B. burgdorferi. También describe un procedimiento confocal de inmunofluorescencia para la detección de B. burgdorferi en el intestino de garrapatas en el lugar. A pesar de nuestra demostración consiste en tripa de ninfa, procedimientos similares se aplican también a otras etapas de desarrollo de las garrapatas, tales como larvas o adultos 8,9. Sin embargo, debido a su menor tamaño, la técnica puede ser relativamente difícil para su uso en las larvas, pero debe estar bien aplicable para su uso en las garrapatas adultas. Otros métodos de infección artificial de las garrapatas con B. burgdorferi han sido desarrollados, tales como la alimentación a través de tubos capilares de vidrio de 10 o por inmersión en el medio de cultivo 11. Estos métodos son eficaces, simples y relativamente barato. Sin embargo, estos procedimientos se basan en la transferencia relativamente incontrolada de B. burgdorferi en garrapatas individuales y por lo tanto potencialmente son limitados en la generación de cohortes de las garrapatas infectadas con la misma carga de patógenos. El último inconveniente puede ser superado por mucho más los procedimientos de entrega vigilada, tales como la microinyección. En nuestro laboratorio, que habitualmente utilizan este procedimiento para transferir B. burgdorferi en garrapatas con las tasas de infección de casi el 100%, y la mayoría de las garrapatas sobreviva a este procedimiento. Garrapatas inyectadas se puede mantener en el laboratorio durante varias semanas o meses, o inmediatamente les permite engullir en ratones y transmitir B. burgdorferi infección. La eficiencia y la cinética de la B. burgdorferi de transmisión de las garrapatas microinyección son similares a los de las garrapatas infectados naturalmente, y por lo tanto, artificial procedimientos infección de garrapatas es probable que ayudará en nuestros esfuerzos para estudiar la garrapata la borreliosis de Lyme. Además, las técnicas de microinyección similares también se han aplicado para propósitos relacionados con la experimentación, por ejemplo, el ARN de interferencia mediada por la manipulación genética de las garrapatas 6,9,12.

Microinyección de los estados inmaduros de las garrapatas es un procedimiento relativamente delicado. Por tanto, es importante verificar que las garrapatas inyectadas con B. burgdorferi son sanos antes de proceder a la siguiente serie de experimentos. Después de inyectar las garrapatas que se han retractado de las piernas y no responden a los estímulos, tales como el aire exhalado o tocar con un pincel, no debe ser utilizado para otros experimentos. Lo más probable es muerto oa punto de morir por el trauma de la inyección. Hemos encontrado que el tamaño de la punta de la aguja y los parámetros de inyección son los dos factores críticos en el procedimiento, como puntas de aguja más grande y los volúmenes de inyección podría potencialmente ruptura de la pared intestinal resultando en la mortalidad de garrapatas alta. También es importante señalar que la configuración de microinyección se describen aquí son sobre todo optimizado para la inyección de B. burgdorferi en suspensión en BSK medios de comunicación. Otros materiales biológicos, como los anticuerpos o las soluciones concentradas de ARN, podrían diferir en la viscosidad del fluido. Para otros materiales, la configuración óptima de la microinyección, sobre todo la presión de inyección y el tiempo de inyección, es necesario determinar empíricamente.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Agradecemos sinceramente a los miembros del laboratorio Pal para asistencia en la preparación de esta manifestación. Este estudio fue apoyado por subvenciones PHS AI076684 y AI080615 de los NIH / NIAID.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes World Precision Instruments, Inc. TW100F-4
Vertical glass puller Narishige International PC-10
Petroff-Hausser counting chamber Hausser Scientific 3900
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
Femtojet microinjector Eppendorf 920010504
Foot control FemtJet Eppendorf 920005098
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP665-1 Filter-sterilized

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References

  1. Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
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Comments

1 Comment

  1. great!

    Reply
    Posted by: sanger w.
    November 24, 2011 - 2:45 AM

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