वयस्क - जन्म न्यूरॉन्स की एकता का अध्ययन

Published 3/25/2011
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Neuroscience
 

Summary

एक वयस्क पशुओं में नवजात दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं के एकीकरण का अध्ययन में वर्णित है. इस तकनीक एक इंजीनियर retrovirus नवजात न्यूरॉन्स, electrophysiological रिकॉर्डिंग द्वारा पीछा करने के लिए vivo में कार्यात्मक एकीकरण में निर्धारित लेबल का उपयोग करता है.

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Gu, Y., Janoschka, S., Ge, S. Studying the Integration of Adult-born Neurons. J. Vis. Exp. (49), e2548, doi:10.3791/2548 (2011).

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Abstract

Neurogenesis पार्श्व वेंट्रिकल की उप - निलय क्षेत्र (SVZ) में और जीवन भर hippocampal दांतेदार गाइरस के उप दानेदार (SGZ) क्षेत्र में वयस्क स्तनधारी दिमाग में होता है. पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि वयस्क hippocampal neurogenesis मिर्गी, एक प्रकार का पागलपन, अवसाद और चिंता (1) सहित विविध मस्तिष्क विकारों के साथ जुड़ा हुआ है. सामान्य और न्यायपालिका न्यूरॉन वयस्क जन्मे एकीकरण की प्रक्रिया का गूढ़ रहस्य इन रोगों के एटियलजि पर प्रकाश डाला और नए उपचारों के विकास को सूचित कर सकते हैं.

SGZ वयस्क neurogenesis भ्रूण और प्रसवोत्तर neuronal विकास दर्पण है, भाग्य विनिर्देश, प्रवास, synaptic एकीकरण, और परिपक्वता के चरणों सहित. हालांकि, पूर्ण एकीकरण एक लंबे समय तक, 6 सप्ताह की अवधि से अधिक होता है. प्रारंभिक वयस्क जन्मे SGZ दांतेदार ग्रेन्युल कोशिकाओं (DGCs) synaptic इनपुट GABAergic है, 14 दिनों के (2) पर glutamatergic इनपुट द्वारा पीछा किया. विशिष्ट कारक हैं जो दांतेदार गाइरस में वयस्क जन्म न्यूरॉन्स के सर्किट के गठन को विनियमित वर्तमान में अज्ञात रहे हैं.

हमारी प्रयोगशाला Moloney murine लेकिमिया वायरस के आधार पर एक प्रतिकृति की कमी रेट्रोवायरल सदिश का उपयोग करता है इन proliferating कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन और धारणा नियामक जीन देने. इस वायरल तकनीक उच्च संकल्प और सेल जन्म तिथि, वंश, आकारिकी, और synaptogenesis के विश्लेषण के लिए विशिष्टता प्रदान करता है.

एक ठेठ प्रयोग अक्सर दो या तीन अद्वितीय लेबल, transgene, और एक वांछित vivo में विकास प्रक्रिया के विश्लेषण के एकल कक्ष के लिए प्रमोटर तत्व युक्त वायरस कार्यरत हैं . निम्न प्रोटोकॉल कार्यात्मक नवजात न्यूरॉन एकीकरण एक एकल (GFP) हरे या लाल (dTomato) फ्लोरोसेंट प्रोटीन retrovirus और पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.

Protocol

1. वायरस इंजेक्शन

उच्च टिटर इंजीनियर retrovirus (1 × 10 9 / इकाई मिलीलीटर) रेट्रोवायरल वैक्टर सह - अभिकर्मक द्वारा निर्मित है और HEK293T कोशिकाओं, वायरल सतह पर तैरनेवाला के ultracentrifugation के बाद में VSVG. स्रोतों और उत्पादन के तरीके के लिए, उत्कृष्ट जौव प्रदर्शन (3) देखें .

नोट: युवा वयस्क (4-6 सप्ताह पुराना) महिला C57BL / 6 चूहों (चार्ल्स नदी) मानक शर्तों के तहत रखे जाते हैं. सभी प्रक्रियाओं देखभाल और Stony Brook विश्वविद्यालय IACUC द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के गाइड का पालन करें.

  1. जानवर प्रति बर्फ पर जमी retrovirus का पिघलना 2ul.
  2. चतनाशून्य करना (100 μg + ketamine 10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति μg xylazine) और एक stereotaxic फ्रेम (Steolting) पर जानवर माउंट. सिर पर बाल निकालें और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा पोछ लो.
  3. खोपड़ी बेनकाब और चार उथले निम्नलिखित निर्देशांक में एक दंत ड्रिल (0.6mm ड्रिल बिट) का उपयोग छेद ड्रिल:
    • anterioposterior = bregma से -2 मिमी, पार्श्व = ± 1.6 मिमी, उदर 2.5 = मिमी, anterioposterior = bregma से -3 मिमी, पार्श्व = ± 2.6 मिमी, उदर = 3.2 मिमी.
    • anterioposterior = bregma से -2 मिमी, पार्श्व = ± 1.6 मिमी, उदर 2.5 = मिमी, anterioposterior = bregma से -3 मिमी, पार्श्व = ± 2.6 मिमी, उदर = 3.2 मिमी.
  4. माउंट 1μl हैमिल्टन, फ्लैट - टिप सिरिंज और दांतेदार गाइरस में 0.25 μl / मिनट की दर पर 0.5 साइट प्रति μl retrovirus इंजेक्षन. (उदर गहराई के लिए ऊपर निर्देशांक देखें.) के धीरे सिरिंज द्रव backflow को रोकने के वापस लेने से पहले रोकें प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 2 मिनट. इंजेक्शन के बीच, संक्षेप में बाँझ पीबीएस के साथ सिरिंज टिप और खून के निशान हटाने applicator की बाहरी सतह कुल्ला.
  5. बाँझ सर्जिकल सिवनी सामग्री के साथ घाव (P-1 प्रकार, 6-0 आकार) को बंद करें और मानक आवास की स्थिति के लिए इंजेक्शन के बाद वांछित समय चरणों जब तक पशु वापस.

2. स्लाइस तैयार

वयस्क चूहों से उच्च गुणवत्ता वाले तीव्र स्लाइसें प्राप्त करने के लिए, हम टुकड़ा तैयार करने के लिए एक संशोधित काटने समाधान का उपयोग करें (नीचे देखें).

  1. पूर्व ठंड काटने 0-4 ° सी बर्फ और 95% के साथ बुलबुला पर 2% -5 हे कम से कम 30 मिनट के लिए सीओ 2 के लिए समाधान.
  2. चतनाशून्य करना और transcardially ठंडा ऑक्सीजन संतृप्त काटने के समाधान के साथ एक जानवर perfuse.
  3. जल्दी से एक पेट्री डिश में फिल्टर कागज ठंड, oxygenated काटने समाधान के साथ पूर्व गीला के साथ मस्तिष्क को हटा दें. बंद सेरिबैलम कट और इंजेक्शन (दृश्यमान) निर्देशांक के लिए कम से कम एक बढ़ते 1mm पूर्वकाल सतह टुकड़ा. गोंद मस्तिष्क पर एक vibrotome मंच और इसे काटने के चेंबर में ठंडा और oxygenated काटने के समाधान के साथ भरा माउंट.
  4. राज्याभिषेक या क्षैतिज स्लाइस (300 350μm) तैयार है और उन्हें एक बड़े बोर विंदुक के साथ एक incubating कमरे के तापमान ACSF युक्त चैम्बर हस्तांतरण 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ bubbled.
  5. 32 ° C पर 30-60 मिनट के लिए स्लाइस, लगातार बुदबुदाती, सेते हैं. रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए कमरे के तापमान पर चैम्बर लौटें.

3. Electrophysiological प्रयोगों

  1. 34 डिग्री सेल्सियस स्लाइसें जो लगातार 32 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन - संतृप्त ACSF साथ perfused रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित कर रहे हैं
  2. एक द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजना इलेक्ट्रोड दांतेदार गाइरस की कम बढ़ाई खुर्दबीन उद्देश्य (10X) का उपयोग कर आणविक परत में रखा गया है.
  3. उप दानेदार क्षेत्र / दानेदार सेल परत में नवजात DGCs GFP या dTomato की अभिव्यक्ति के द्वारा पहचाने जाते हैं. पूरे सेल patchclamp रिकॉर्डिंग उच्च आवर्धन (40x) के तहत नवजात न्यूरॉन्स पर किया जाता है.
  4. दर्ज कोशिकाओं की फायरिंग गुण धाराओं की एक श्रृंखला के वर्तमान दबाना मोड के तहत इंजेक्शन द्वारा प्राप्त कर रहे हैं.
  5. इलेक्ट्रिक उत्तेजनाओं उत्तेजना इलेक्ट्रोड से एक उत्तेजना रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित अलगाने के माध्यम से वितरित कर रहे हैं, और नवजात DGCs में postsynaptic धाराओं पैदा कर रहे हैं दर्ज.

4. डेटा विश्लेषण

पैदा postsynaptic प्रतिक्रियाओं के amplitudes वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स की विभिन्न विकासात्मक चरणों में विश्लेषण कर रहे हैं.

5. प्रतिनिधि परिणाम

ऊपर प्रोटोकॉल का प्रयोग, नवजात दांतेदार गाइरस चित्रा 1 के समान न्यूरॉन्स में GFP अभिव्यक्ति आम बात है. ध्यान दें कि नवजात न्यूरॉन्स आसानी से कल्पना कर रहे हैं और दोनों dendrites और axons robustly लेबल रहे हैं. पतली क्लब axons और छोटे कांटा अभिव्यक्ति गुणवत्ता और वायरस के टिटर इस्तेमाल प्रमोटर और vivo अभिव्यक्ति में की लंबाई पर निर्भर करता है. हमारे हाथ में, नवजात कोशिकाओं और उप सेलुलर organelles आमतौर पर इंजेक्शन के बाद कुछ दिनों के भीतर दिखाई दे रहे हैं, और रीढ़ अभिव्यक्ति विकास के प्रारंभिक चरणों से पता लगाया जा सकता है. डब्ल्यूअलग अलग समय के चरणों में नवजात न्यूरॉन्स से होल सेल रिकॉर्डिंग परिपक्वता (चित्रा 2b) के दौरान मौजूदा तंत्रिका सर्किट में अद्वितीय नवजात सेल संपत्तियों, जैसे कार्रवाई क्षमता (2a चित्रा), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से synaptic एकीकरण की प्रक्रिया के अध्ययन की अनुमति देते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 2-photon एक वयस्क चूहे के एक क्षैतिज दांतेदार गाइरस अनुभाग में नवजात न्यूरॉन्स की confocal छवि. ग्रीन कोशिकाओं 21dpi हैं (दिनों के बाद इंजेक्शन) GFP-व्यक्त नवजात pUX - GFP retrovirus के साथ लेबल DGCs.

चित्रा 2
चित्रा 2) लड़ाई संभावित 21 में एक नवजात क्लब के गुणों फायरिंग डीपीआई ख) के प्रतिनिधि उत्तेजक postsynaptic (EPSCs) धाराओं 21 डीपीआई पर एक नवजात क्लब पर दर्ज हुई .

Discussion

वयस्क स्तनधारी दिमाग का हिप्पोकैम्पस में सतत neurogenesis के एक अद्वितीय प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली neuronal और परिपक्व मस्तिष्क में विकास के एकीकरण का अध्ययन प्रदान करता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल लेबलिंग और electrophysiological वयस्क चूहे के दिमाग में नवजात दांतेदार ग्रेन्युल न्यूरॉन्स के एकीकरण का अध्ययन तरीकों को जोड़ती है.

सुनिश्चित करें कि आपके प्रयोगों सफल रहे हैं, हम प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम के दौरान निम्नलिखित अनुशंसा करते हैं:

अवांछित संक्रमण और सूजन से बचने के लिए, सर्जरी से पहले सभी उपकरणों (autoclaving, अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ के किसी भी प्रकार, या 70% इथेनॉल द्वारा) निष्फल करना चाहिए. बाँझ पीबीएस प्रयोग इंजेक्शन सिरिंज सुई की नोक से पहले धो.

वायरस के इंजेक्शन के लिए, जानवरों की तरह होना चाहिए stereotaxic डिवाइस पर बढ़ और अनावश्यक आंदोलन के सूत्रों इंजेक्शन के दौरान कम से कम होना चाहिए. यकीन है कि सिर में अच्छी तरह से तय है और फर्म है, और स्तर bregma और लैम्ब्डा इंजेक्शन निर्देशांक की गणना के लिए पहले माउस के नाक की स्थिति को समायोजित. जल्दी सिरिंज में वायरस निकालें कमरे के तापमान के लिए जोखिम को कम करने के लिए - रेट्रोवायरस विशेष रूप से तापमान संवेदनशील कर रहे हैं. वायरस धीरे धीरे सिफारिश की दर पर दबाव नुकसान को कम करने के लिए सुई. सिफारिश फ्लैट इत्तला दे दी सिरिंज (बनाम आम beveled टिप) का प्रयोग एक समान रूप से वितरित दांतेदार गाइरस संक्रमण क्षेत्र सुनिश्चित करेगा.

स्लाइस की तैयारी से पहले, समाधान काटने और ACSF incubating कम से कम 30 मिनट के लिए 95% -5 2% सीओ 2 के साथ bubbled होना चाहिए ऑक्सीजन समाधान तर करने के लिए अनुमति देते हैं. पशु perfused जल्दी होना चाहिए और ऊतक ठंड, सबसे अच्छा टुकड़ा गुणवत्ता के लिए ऑक्सीजन संतृप्त समाधान में बनाए रखा.

रिकॉर्डिंग के लिए, उत्तेजना तीव्रता धीरे - धीरे वृद्धि जब तक वहाँ एक postsynaptic प्रतिक्रिया है. उत्तेजना इलेक्ट्रोड के दांतेदार गाइरस के आणविक परत के भीतर आवश्यक के रूप में स्थान बदलें.

सारांश में, की सिफारिश की दृष्टिकोण एकीकरण प्रारंभिक अवस्था के दौरान सक्रिय, परिपक्व circuitry में विशिष्ट गुणों और संभव वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स की कार्यात्मक भूमिका का पता लगाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम NINDS और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन S.Ge. द्वारा वित्त पोषित किया गया था यह दृष्टिकोण मूलतः में स्थापित किया गया था जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में डॉ. Hongjun गीत प्रयोगशाला में लेखक द्वारा विकसित की है. हम उनके मार्गदर्शन और समर्थन के लिए डा. Hongjun गाने धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

  • Cutting solution (in mM): 110 choline chloride, 2.5 KCl, 1.3 KH2PO4, 25.0 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 dextrose, 1.3 sodium ascorbate, 0.6 sodium pyruvate, 5.0 kynurenic acid.
  • Artificial cerebro-spinal fluid (ACSF, in mM): 125.0 NaCl, 25.0 NaHCO3, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1.3 KH2PO4, 1.3 MgCl2, 1.3 sodium ascorbate, 0.6 sodium pyruvate, 10 dextrose.
  • Internal solution for whole-cell patchclamp (in mM): 120 potassium gluconate, 15 KCl, 4 MgCl2, 0.1 EGTA, 10.0 HEPES, 4 MgATP, 0.3 Na3GTP, 7 phosphocreatine (pH 7.4, 300 mOsm).

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References

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
  2. Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
  3. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (2007).

Comments

2 Comments

  1. I like this technique.

    Reply
    Posted by: Taruna I.
    March 31, 2011 - 10:44 PM
  2. Do you have a worshop for it?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 17, 2012 - 12:52 PM

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