वंक्षण लिम्फ नोड के intravital माइक्रोस्कोपी

Immunology and Infection
 

Summary

वंक्षण लिम्फ नोड (एल.एन.) के intravital माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए एक तकनीक उल्लिखित है. वास्तविक समय के लिए इस तरह की तकनीक की अनुमति देता है है,

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Sellers, S. L., Payne, G. W. Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node. J. Vis. Exp. (50), e2551, doi:10.3791/2551 (2011).

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Abstract

Protocol

1. अभिकर्मक तैयार

  1. अभिकर्मकों प्रयोग भर में इस्तेमाल किया जा शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले तैयार रहना चाहिए. ध्यान दें कि सभी समाधान बाँझ तकनीक का उपयोग कर किए गए थे.
  2. शारीरिक नमकीन घोल (PSS) से सबसे अच्छा दो घटकों में तैयार है: बुनियादी नमक समाधान और सोडियम बिकारबोनिट समाधान. 20X एकाग्रता और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस पर दोनों के समाधान की तैयारी 20X में सोडियम बिकारबोनिट 360.0mM 3 NaHCO (84.01g/mol) और 20X एकाग्रता में बुनियादी नमक समाधान 2638.0mM (58.44g/mol) NaCl, 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 2 • 2H (147.02g/mol) हे, और 23.4mM MgSO 4 • 7 2 हे (246.48g/mol). समाधान DH 2 हे और रसायनों में तैयार किया जाना चाहिए एक समय में जोड़ा जाना चाहिए और हड़कंप मच गया जब तक अगले रासायनिक जोड़ने के लिए पहले स्पष्ट समाधान है
  3. सोडियम बिकारबोनिट और बुनियादी नमक समाधान के बराबर मात्रा गिराए और एकाग्रता 1X (PSS के दो 2L DH 2 हे में पतला प्रत्येक सोडियम बिकारबोनिट और बुनियादी नमक समाधान के 100ml के लिए के लिए गिराए PSS के 2L तैयार
  4. प्लेस 2L बड़ा 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में PSS और PSS युक्त कुप्पी. 5% सीओ 2 / शेष नाइट्रोजन गैस के साथ पहले 1hr के लिए समाधान के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के शुरू करने के लिए संतुलित.
  5. Vasoactive रसायनों (उदा. Phenylephrine, acetylcholine, सोडियम nitroprusside) सर्वश्रेष्ठ dH2O में 1M एकाग्रता में तैयार कर रहे हैं और -20 डिग्री सेल्सियस पर 100μl aliquots में संग्रहित

2. पशु तैयारी

  1. माउस के वजन का निर्धारण और intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 90mg/kg pentobarbital सोडियम की प्रारंभिक खुराक प्रशासन. प्रक्रिया के दौरान माउस लगातार पैर के अंगूठे चुटकी और श्वसन की दर से सावधान परीक्षा के माध्यम से संज्ञाहरण विमान के लिए नजर रखी है. Pentobarbital सोडियम के अतिरिक्त इंजेक्शन संज्ञाहरण विमान को बनाए रखने के लिए 20mg/kg की जरूरत के रूप में प्रशासित किया जाना चाहिए. संज्ञाहरण की शल्य चिकित्सा विमान संघीय और संस्थागत नियमों के अनुसार बनाए रखा है के रूप में जानवरों की देखभाल पशु की देखभाल और उत्तरी ई.पू. के विश्वविद्यालय का प्रयोग समिति (ACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल में उल्लिखित है.
  2. बाल शेवर पेट और पार्श्व कूल्हे / क्षेत्र से निकालें. शराब झाड़ू द्वारा ढीला बाल शेष है और टेप के साथ क्षेत्र ठोक निकालें. यह पर्याप्त है के रूप में इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया टर्मिनल है.
  3. एक स्पष्ट शल्य चिकित्सा बोर्ड पर एक लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस और बोर्ड के लिए बोर्ड को प्रत्येक लुटेरा टेप माउस देते हैं. शरीर का तापमान एक बाहरी गर्मी दीपक के माध्यम से बनाए रखा है और गुदा थर्मामीटर के माध्यम से निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें कि हाइपोथर्मिया संवेदनाहारी का एक परिणाम के के रूप में घटित नहीं करता है.

3. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया

  1. पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान यह सुनिश्चित उजागर ऊतक हमेशा रखा है equilibrated गरम PSS समाधान के साथ superfused है. यह भी महत्वपूर्ण है शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ ब्याज की vasculature के साथ बनाने के लिए कभी नहीं से संपर्क करें या उन्हें चारों ओर वसा ऊतकों और संयोजी ऊतक जोड़ तोड़ द्वारा उन पर अधिक बल रखकर वाहिकाओं घायल.
  2. विदारक गुंजाइश के तहत माउस रखें. उदर गुहा के ventral सतह के साथ एक midline चीरा और माउस स्पाइनल कॉलम की ओर त्वचा वापस लेना.
  3. एक बार त्वचा इतनी मुकर गया है कि एल.एन. आसानी से दिखाई देता है, पारदर्शी Sylgard 184 की एक कुरसी पर त्वचा पिन.
  4. संयोजी ऊतक की पतली परत एल.एन. आसपास क्षेत्र overlaying निकालें
  5. वसा ऊतकों overlaying साफ़ और लिम्फ नोड के चारों ओर microvascular बिस्तर तक अवगत कराया है. मुख्य धमनी खंड एल.एन. के लिए निकट देता है और सामान्यतः venule द्वारा overlayed है. पूरे सर्जरी लगभग 30 मिनट लगते हैं.

4. इमेजिंग और पोत विश्लेषण

  1. एक बार जब ब्याज की वाहिका खंड विदारक गुंजाइश के तहत उजागर है, intravital खुर्दबीन पर तैयारी सुरक्षित. ध्यान दें कि जानवर प्रयोग की अवधि भर intravital खुर्दबीन पर जबकि स्पष्ट शल्य चिकित्सा बोर्ड पर रहता है. शरीर का तापमान गर्मी दीपक के माध्यम से बनाए रखा है और गुदा थर्मामीटर के माध्यम से मापा के रूप में शल्य चिकित्सा अनुभाग के दौरान वर्णित है. संज्ञाहरण विमान भी प्रयोग भर में निगरानी रखी जाती है जैसा कि खंड 2.1 में वर्णित है.
  2. Superfusion और चूषण लाइनों सेट. PSS के Superfusion एक जलाशय से गुरुत्वाकर्षण फ़ीड के द्वारा, पानी जैकेट गर्म जलाशय (पानी जैकेट और परिचालित है परिसंचारी waterbath से गर्म) 5% सीओ 2 संतुलित नाइट्रोजन द्वारा perfused किया जा रहा है, में और 10ml के एक दर पर एक ड्रिप लाइन के नीचे होता है, / मिनट. एक चूषण लाइन superfused PSS तैयारी से दूर खींच जारी किया जाना चाहिए. ध्यान दें कि चूषण लाइनों और पानी जैकेट प्रयोग करने के लिए पहले अच्छी तरह से और साफ कर रहे हैं एक प्रयोग के बाद संग्रहीत. इस बाँझपन से पहले यह सुनिश्चित करता है अगले प्रयोग करने के लिए.
  3. Superfusing PSS के तापमान की जाँच करें. के तापमान को समायोजित करेंपानी स्नान और / या PSS superfusion की दर परिसंचारी ° तैयारी भर सी ~ 37 के एक तापमान को प्राप्त करने.
  4. Vasculature PSS के साथ कम से कम 60 मिनट के लिए संतुलित और वीडियो कैलीपर का उपयोग पोत व्यास यों की अनुमति दें. आमतौर पर, पोत व्यास कई बिंदुओं पर निर्धारित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 40, 50, और 60 मिनट) करने के लिए सुनिश्चित करें पोत स्थिर है.
  5. एक चिकनी पेशी विशिष्ट (उदा. Phenylephrine, पीई) agonist और एक endothelium विशिष्ट agonist (उदा. Acetylcholine, ACH) का उपयोग कर पोत के स्वास्थ्य का आकलन करें. Agonist की एकाग्रता agonist पर निर्भर करता है समायोजित किया जाना चाहिए, लेकिन पीई और ACH के लिए पोत superfusate के लिए संचयी अलावा (10 9M 10-5M) द्वारा प्रत्येक एकाग्रता में मूल्यांकन किया जाना चाहिए. प्रत्येक agonist आवेदन एक धोने चरण PSS (आमतौर पर 30 मिनट) का उपयोग कर जब तक पोत आराम व्यास रिटर्न के द्वारा अलग किया जाना चाहिए.
  6. पोत स्वास्थ्य, बाद में vasoactive दवाओं, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और सेल प्रयोगों अनुरेखण के बाद मूल्यांकन का आयोजन किया जा सकता है.
  7. प्रयोग के अंत के बाद जानवर pentobarbital सोडियम की एक ज्यादा दिया जाता है. जानवर तो सुनिश्चित करें कि वहाँ पैर के अंगूठे चुटकी और श्वसन आंदोलन या दिल की धड़कन की कमी के लिए कोई जवाब नहीं है के लिए नजर रखी है. ऐसे समय में इस ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा पीछा किया जाता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

संतुलन की अवधि के बाद की तैयारी है कि दोनों arteriole और venule कि वंक्षण लिम्फ नोड आपूर्ति की पहचान के लिए अनुमति देता है एक स्पष्ट छवि उपज चाहिए. वहाँ कम से कम वसा कोशिकाओं वाहिकाओं आसपास के arteriole और स्पष्ट रूप से वीडियो पोत व्यास की गणना करने के लिए आरोपित किया कैलिपरस के लिए मनाया जा venule की दीवारों के लिए अनुमति होना चाहिए. एक सफल तैयारी के अभिन्न बिंदु है arteriole खून की एक अमीर आपूर्ति लुमेन के माध्यम से और वहाँ संवहनी टोन की एक महत्वपूर्ण डिग्री (यानी arteriole vasoconstrict और मांसपेशियों और endothelial विशिष्ट agonists क्रमशः चिकनी vasodilate की क्षमता है) है कि आगे बढ़ .

चित्रा 1
चित्रा 1 वंक्षण लिम्फ नोड फ़ीड (लाल तीर) arteriole लिम्फ नोड शारीरिक नमकीन घोल और पक्ष के साथ मुख्य venule (हरा तीर) चलाने के साथ equilibrated खिला intravital माइक्रोस्कोपी छवि .

चित्रा 2
चित्रा 2 शारीरिक खारा संचयी अलावा सामान्य vasoactive सांद्रता से superfused phenylephrine (पीई) के जवाब 10 -9 एम 10 एम -5 एक मजबूत वाहिकासंकीर्णन की उपस्थिति सामान्य चिकनी पेशी arteriole में मौजूद समारोह का सूचक है.

चित्रा 3
चित्रा 3 सांद्रता से शारीरिक खारा संचयी अलावा द्वारा सामान्य vasoactive superfused acetylcholine (ACH) जवाब 10 -9 एम 10 एम -5 एक मजबूत vasodilation की उपस्थिति सामान्य endothelial समारोह में उपस्थित arteriole के विचारोत्तेजक है.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत वंक्षण लिम्फ नोड के intravital माइक्रोस्कोपी लिम्फ नोड में vivo की छवि microvasculature के लिए क्षमता प्रदान करता है. इस प्रकार, यह प्रत्यक्ष, वास्तविक समय अवलोकन के साधन सुविधा. एल.एन. microvasculature की इमेजिंग एक अद्वितीय साइट है कि एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और vasculature के बीच इंटरफेस का अध्ययन करने की अनुमति देता है. इस तैयारी का उपयोग करना, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, vasculature में परिवर्तन, या दोनों के बीच बातचीत पर ध्यान केंद्रित विशेष रूप निर्देशित कर सकते हैं.

सभी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ के रूप में, मानक intravital माइक्रोस्कोपी दोनों फायदे और सीमाएं हैं. मानक IVM, जैसे तैयारी यहाँ वर्णित है, आसानी से संशोधित कर सकते हैं हो सकता है और पहले लेखकों द्वारा प्रदर्शन किया गया epifluorescent माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट ट्रेसर रंगों के परिचय या लेबल सेल आबादी के माध्यम से की अनुमति. हालांकि मानक IVM तीन आयामी इमेजिंग की संभावना नहीं दे करता है और अनुरेखण जैसे दो photon माइक्रोस्कोपी या एंजियोग्राफी द्वारा दिया जाएगा, सेल ट्रैकिंग अभी भी दो आयामों में हासिल की है सेल करने वाली सेल और सेल vasculature बातचीत करने जा करने की अनुमति मनाया और मात्रा निर्धारित और में vivo प्रशासन और एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट बाद धुंधला के साथ संयोजन के रूप में करने के लिए वास्तविक समय में अभिव्यक्ति / प्रोटीन मार्कर पर डेटा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

विशेष रूप से, वैकल्पिक इमेजिंग तकनीक छवियों के लिए एक स्थिर वातावरण की आवश्यकता होती है, शल्य चिकित्सा क्षेत्र या एक फ्लैट तैयार करने पर एक coverslip के अलावा clamping अक्सर की जरूरत है. यह सीमा है, नहीं तो समाप्त, सक्रिय रूप से तैयारी से अधिक नाड़ी या अन्य मध्यस्थों perfuse संवहनी अखंडता और फिजियोलॉजी आदि या IVM तैयारी के भीतर आयोजित vasodilation प्रयोगों जैसे अन्य तकनीकों के प्रयोग का मूल्यांकन करने की क्षमता. इसके अलावा, मानक IVM एक पूरी तरह से फ्लैट तैयार करने की आवश्यकता नहीं करता है और जानवर की सांस लेने से उत्पन्न के रूप में गति, से प्रभावित नहीं है. यह मानक IVM अधिक reproducibility के साथ और अधिक शल्य चिकित्सा क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है. यह वंक्षण लिम्फ नोड यहाँ वर्णित तैयारी द्वारा उदाहरण है. और लिम्फ नोड के आकार और आकार को देखते हुए, तैयारी ऊतक घायल बिना फ्लैट नहीं बनाया जा सकता है और नोड का स्थान महत्वपूर्ण जानवर श्वसन की वजह से गति को जन्म देता है है. इस तरह के मुद्दों के लिए अन्य तरीकों से उबरने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन आसानी से मानक IVM वर्णित तैयारी का उपयोग कर के साथ निपटा.

सारांश में, ऊपर विस्तृत तैयारी के किसी भी संख्या के साथ संयुक्त किया जा सकता है है अन्य जैव रासायनिक, नाड़ी, और / या सक्रिय के सबसेट के हस्तांतरण या लेबल कोशिकाओं, hypoxia की प्रेरण, और संवहनी मध्यस्थों के कमी की अभिव्यक्ति पर जैसे प्रतिरक्षाविज्ञानी तकनीक. हालांकि, अतिरिक्त अनुप्रयोगों प्रारंभिक तैयारी के स्वास्थ्य पर निर्भर हैं. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है हमेशा imaged किया जा रहा है और मूल्यांकन vasculature की स्वास्थ्य परीक्षण. एक स्वास्थ्य तैयारी को प्राप्त करने के लिए कुंजी अंक सुनिश्चित कर रहे हैं तैयारी लगातार शरीर के तापमान पर है equilibrated PSS के साथ perfused और न्यूनतम से संपर्क करें और तनाव सर्जरी के दौरान शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर रखा है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा, अभिनव, रक्त अनुसंधान और विश्वविद्यालय के उत्तरी ई.पू. के लिए विश्वविद्यालय के ब्रिटिश कोलंबिया सेंटर के लिए कनाडा फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma-Aldrich
Potassium Chloride Sigma-Aldrich
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich
Sodium Nitroprusside Sigma-Aldrich
Phenylephrine Sigma-Aldrich
Acetylcholine Sigma-Aldrich
Magnesium chloride heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Pentobarbitol

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References

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