תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Neuroscience
 

Summary

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hurtado de Mendoza, T., Balana, B., Slesinger, P. A., Verma, I. M. Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection. J. Vis. Exp. (51), e2564, doi:10.3791/2564 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תרבויות Organotypic של רקמה עצבית הוצגו לראשונה בשנת 1947 על ידי הוג 1,2 ו היוו פריצת דרך בתחום מדעי המוח. מאז, הטכניקה פותחה עוד יותר, וכיום ישנם דרכים רבות להכין תרבויות organotypic. השיטה המוצגת כאן הותאמה מזו המתוארת על ידי Stoppini et al. להכנת פרוסות ומן Gogolla et al. עבור ההליך מכתים 3,4.

תכונה ייחודית של הטכניקה הזו הוא שהיא מאפשרת לך ללמוד בחלקים שונים של המוח כגון ההיפוקמפוס במוח הקטן או במבנה המקורי שלהם, מתן יתרון גדול על פני תרבויות ניתק שבו כל ארגון הסלולר רשתות נוירונים הם שיבשו. במקרה של המוח הקטן זה עוד יותר יתרון משום שהוא מאפשר את המחקר בתאי פורקינג', קשה מאוד להשיג כתרבות העיקרית ניתק. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תכונות התפתחותי מסוים של המוח הקטן במבחנה, כמו גם עבור ניסויים אלקטרו תרופתי מסוג שני בר עכברים שעברו מוטציה.

השיטה המתוארת כאן נועד לחקור את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים כגון ליגנד פאס במוח הקטן המתפתח, באמצעות מכתים TUNEL למדוד מוות של תאים אפופטוטיים. אם מכתים TUNEL משולב עם סמנים סוג תא מסוים, כגון Calbindin עבור תאים פורקינג', אפשר להעריך מוות של תאים באופן תא אוכלוסייה ספציפיים. מכתים Calbindin גם משרתת את המטרה של הערכת האיכות של תרבויות cerebellar.

Protocol

1. תרבויות cerebellar Organotypic:

  1. כדי ליצור בהצלחה תרבויות cerebellar organotypic להשתמש בעכברים בין P0-P3 או P8-P12. לצורך ניסוי שלנו השתמשנו עכברים בטווח P8-P12 כי זה שלב התפתחותי היה מתאים יותר במחקר שלנו.
  2. הכן את לנתיחה ואת בינוני תרבות:
    1. דיסקציה המוח והכנת פרוסה מתבצעות מלאכותית נמוך נוזל המוח והשדרה נתרן (ACSF) המכיל סידן כלוריד 1mm, 10mm D-גלוקוז, 4mm אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד 5mm, סודיום ביקרבונט 26mM, סוכרוז 246mM פתרון פנול אדום (1:1000) , pH 7.3. כדי לעקר את הפתרון, לסנן אותה דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
    2. פרוסות cerebellar הם בתרבית 75% מינימום בינוני הנשר חיוניים (ממ), 25% חום מומת סרום סוס, HEPES 25mm, 1mm גלוטמין, 5 מג / מ"ל ​​גלוקוז, פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 U / mL). סינון בינוני דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר שבועיים.
  3. לנתח מוח קר כקרח בינוני ACSF מבעבע בעבר עם Carbogen (95% חמצן ופחמן דו חמצני 5%) שים לב, כי הרוויה עם Carbogen תשנה את ה-pH של התמיסה כך יעבור מאדום לכתום. דיסקציה צריכה להתבצע במינימום זמן אפשרי נזהרים שלא לפגוע במבנה המוח.
  4. פורסים את המוח בסעיפים sagittal של 400 מיקרומטר באמצעות vibratome.
    1. ביצוע חתך sagittal בסכין גילוח בהמיספירה אחת, מנסה לחתוך כמה שפחות של המוח הקטן, זה יספק משטח שטוח עבור חיתוך. קליפת המוח משמשת רק תמיכה על מנת להפוך את חיתוך קל אך מאז היא נושא חשוב זה נוח יותר לחתוך את החצי מקורי של קליפת המוח עם סכין גילוח.
    2. השתמש cyanoacrylate (הפלא) כדי לתקן את המיקום של המוח על הצלחת vibratome מתכת. חשוב לצנן את הצלחת על הקרח לפני הוספת דבק להפיץ אותו היטב בעזרת קצה של הצינור כדי ליצור שכבת דבק דקה. אם יש עודף של הפלא, זה יהיה לנתק מהצלחת כשמדובר במגע עם ACSF ואת מדגם יאבדו.
    3. ברגע שהמוח מחובר הצלחת vibratome, מספיק להוסיף מדיה ACSF כדי לכסות את המוח לשים קרח מתחת הצלחת לשמור את זה קר.
    4. חותכים פרוסות 400 מיקרומטר ולהעביר אותם עם פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את קצה להרחיב אותו ולמנוע נזק פרוסות) אל צלחת 6-גם תא המכיל תרבות ACSF על הקרח.
    5. הפרד את המוח הקטן משאר חלקי המוח בעזרת שני מזרקים אינסולין (מזרקים עם קוטר קטן 28-מד מחטים) תחת המיקרוסקופ לנתח. כמה פרוסות יהיה הפלא המצורפת את הקצוות: זה הרגע כדי לנסות להסיר את זה כמו שזה יכול להשפיע על הכדאיות של הפרוסה. חשוב לעשות זאת בזהירות מבלי לפגוע במבנה המוח הקטן.
  5. מעבירים את פרוסות cerebellar עד 6-30mm היטב צלחות המכילות צלחת מוסיף תרבות עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר. הוסף 1 מ"ל של התקשורת בתרבות לכל טוב, זה היה טרום מותנה הדגירה של לפחות 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 (בתרבות תא חממה). מניחים את מוסיף על גבי מדיה לוודא שאין בועות אוויר שנלכדו מתחת ולאחר מכן למקם את פרוסות המוח הקטן (1-3 לכל הכנס) על גבי מוסיף לוודא שהם המורחבת מלא וכי אין נוזל מכסה אותם. לשאוב עודף של התקשורת במידת הצורך. לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 לשנות את התקשורת בכל תרבות 2 או 3 ימים. מומלץ להחליף רק חלק בינוני (למשל נפח ½) בבת אחת, שכן המדיום המשמש מכיל פרוסה הנגזרות trophic גורמים חשובים להישרדות התא.

2. פאס טיפול מכתים של Slices cerebellar:

  1. לצורך ניסוי האתגר אפופטוטיים, אנחנו בתרבות הראשון פרוסות במשך 5 ימים שינוי התקשורת ביום במבחנה 3 (DIV3). ביום DIV5 תרבויות מטופלים עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Jo2 אגוניסט פאס נוגדן ידי הוספתו ישירות לתקשורת על מנת לקבל רקע נקי של מוות של תאים מאז השינויים של התקשורת יכול לגרום כמה התמותה התרבויות. מחצית הבארות הם מטפלים כפקדי.
  2. לאחר 24 שעות להסיר את המדיה מתחת מוסיף את ידי יניקה. כדי לתקן את הפרוסות, להוסיף 1 מ"ל של קרים כקרח PFA 4% מתחת ו 1 מ"ל לעיל להכניס את. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר 10 דקות להסיר את PFA לשטוף קצר עם PBS קר.
  4. הבא להסיר את PBS ולהוסיף 1 מתחת מ"ל ו 1 מ"ל לעיל להכניס של מתנול קר כקרח 20% PBS ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. שטפו שוב עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל ו 1 מ"ל מתחת מעל להכניס את של 0.5% Triton-X-100 ב PBS עבור permeabilization. דגירה למינימום של 12 שעות ב 4 ° C.
  6. לאחר permeabilization, בלוק עם BSA 20% PBS עבור מינימום של4 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. בשלב זה הפרוסות יכולים להישמר פתרון חסימת לפחות 3 ימים 4 ° C.
  7. על מנת כתם הפרוסות בזהירות לחתוך את פיסת קרום להכניס המצורפת הפרוסה cerebellar ולהעביר אותו 24 גם צלחות המכילות PBS.
  8. Immunostaining נעשית ברצף, תחילה לשעה אחת ואז עם נוגדן Calbidin לילה עם מגיב TUNEL.
    1. לשאוב PBS ולהוסיף 250 μL את מגיב TUNEL לתוך זה גם לוודא שהוא מכסה את כל פני השטח של הפרוסה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בחושך.
    2. אחרי שעה להסיר את תערובת TUNEL ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות.
    3. לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBS ולהוסיף 250 μL של דילול 1 / 1000 של הנוגדן Calbindin ב PBS ו דגירה לילה בשעה 4 ° C בחושך.
    4. הסר את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות.
    5. הוספת 250 μL של נוגדנים משני בדילול 1 / 500 ב PBS ו דגירה של לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר בחושך. הערכה TUNEL השתמשנו התווית TMR אדום, ולכן נוגדנים משני שלנו Calbindin הוא מצומדות כדי Alexa-488.
    6. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS ואת ההר פרוסות גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות התקשורת הרכבה המכיל DAPI.
    7. תמונה הפרוסות עם מיקרוסקופ confocal באמצעות 488 nm ו 561 nm עירור wavelenght עבור Calbindin ו TUNEL בהתאמה.

3. נציג תוצאות:

האתגר העיקרי של פרוטוקול זה להיות מסוגל ליצור בריא תרבויות פרוסה cerebellar, במיוחד מאז readout הסופי שלנו יהיה מוות של תאים. תרבות בריאה מופיע אחד שבו שכבת גוף התא הוא שקוף ומאפשר לך לראות את המבנה foliated של המוח הקטן מתחת למיקרוסקופ (איור 1). אחרי כמה ימים בתרבות פרוסות מתחילים התאים דק ולא נוירונים ניתן לצפות נודדות הרחק בשוליים של הפרוסה. התאים עגול כהה (מקרופאגים סביר ביותר) שמכסים את פרוסות אחרי כמה ימים בתרבות, בסופו של דבר לירידה במספר לאחר 10-14 ימים במבחנה (איור 2) 5. ההוכחה האולטימטיבית עבור לקיומה של פרוסות היא כתם על סמנים סלולריות שונות, כגון Calbindin עבור התאים פורקינג'. איור 3 מראה תמונה נציג מיקרוסקופ confocal של שכבת תאים פורקינג' עם גרעינים TUNEL מספר חיובי.

חשוב לקחת בחשבון כי גם אם כמה פרוסות קיבל גירוי אפופטוטיים, הם נחשפו רק למשך 24 שעות. זה איפשר מספיק זמן כדי לבחון פיצול ה-DNA בתאים מתים עם מכתים את TUNEL, אבל תא מוגדר שכבת פורקינג' עדיין נוכח.

איור 1
באיור 1. פרוסה cerebellar בריא DIV2. תמונה זו מציגה את תא שקוף הגוף שכבת ומבנה cerebellar foliated ב פרוסה בריא.

איור 2
איור 2. פרוסה cerebellar בריא ב DIV 7. בתמונה זו אנחנו עדיין יכולים לראות את המבנה foliated של המוח הקטן ואת המראה של גופי התא כהה.

איור 3
איור 3. תמונה נציג פרוסה פאס שטופלו cerebellar. Confocal תמונה זו מראה את התאים פורקינג' מוכתם Calbindin (ירוק) לבין תאים אפופטוטיים חיובית מכתים TUNEL (אדום). תאים פורקינג' אינם מופיעים בשורה אחת, אלא מקובצים היוצרים מבנה דמוי folium.

Discussion

שיטה זו מתארת ​​את אחד יישומים אפשריים רבים של תרבויות organotypic עצבי והיא אפשרה לנו ללמוד את ההשפעה של גירויים אפופטוטיים בסוג בר פרוסות cerebellar מוטציה.

החלק הקריטי ביותר של ניסוי זה הוא להיות מסוגל לייצר בעקביות בריא תרבויות פרוסה cerebellar. הגורמים העיקריים הם לנתיחה וטכניקה לחתוך את היכולת לבצע את הפרוטוקול בזמן שפחות, אבל באותו הזמן נזהר לא לפגוע פרוסות. גורם נוסף חשוב הוא הכנה הרכב של התקשורת תרבות, תרבויות אלה רגישים מאוד, ולכן היינו צריכים לבדוק כמה מתכונים המותגים ואת התקשורת. גם קבוצות שונות של סרום או כל רכיב אחר של התקשורת להשפיע על הכדאיות של הפרוסות. קיבלנו את התוצאות הטובות ביותר עם סרום הסוס ממגרש Invitrogen # 480116.

לאחר פרוסות cerebellar נוצרות אחד יכול ללמוד פיתוח cerebellar, electrophysiology, הישרדות התא לבד או בתגובה לגירויים אפופטוטיים, excitotoxicity או מחסור בחמצן. מחקרים השוואתיים באמצעות סוג בר פרוסות cerebellar מוטציה כבר תובנה מאוד בהיבטים רבים של פיתוח פונקציה cerebellar ו.

Disclosures

לעבוד כל בעלי החיים שנערך נעשה בהתאם למדיניות שקבע IACUC. ממכון סאלק הוא מתקן מוכר AAALAC.

Acknowledgements

מחקר זה מומן בחלקו על ידי קרן IPSEN. IMV היא האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן פרופ 'לביולוגיה מולקולרית, ואת הקתדרה ארווין וג'ואן ג'ייקובס במדעי החיים למופת. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH, Leducq Foundation, קרן Meriaux, אליסון רפואי הקרן, Ipsen / Biomeasure, סאנופי אוונטיס, סרטן הערמונית קרן, ואת ח"נ ופרנסס ג קרן ברגר. PAS ממומנת על ידי הקרן קרן מק 'נייט למדעי המוח לבין המכון הלאומי לשימוש בסמים (R01 DA019022). המחברים מבקשים להודות מרק שמיט. אמנות גרפי תוכנן על ידי ג'יימי טי סיימון. חסות סופק על ידי חביב Invitrogen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM Invitrogen 11090
Horse Serum Invitrogen 16050
Hepes Invitrogen 15630
Glutamine Invitrogen 25030
Penicillin/ Streptomycin Invitrogen 15140
Superglue Krazy Glue
6 well / 24 well cell culture plates Corning 3506/ 3527
30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) EMD Millipore PICM03050
Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) BD Biosciences 554254
In situ cell death detection kit, TMR red Roche Group 12 156 792 910
Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody Swant CB-38a
Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody Invitrogen A-11008
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Dissecting Microscope Carl Zeiss, Inc.
Vibratome Leica Microsystems
Confocal Microscope Leica Microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
  2. Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
  3. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).

Comments

5 Comments

  1. Good afternoon, thank you for your information, I will again to do cultures, but I dont have carbogen to bubble, but I have a incubator with 5% CO², may I to sustitute this step? thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 27, 2011 - 4:44 PM
  2. The function of Carbogen is to 1) oxygenate and to ²) set the pH of the ACSF. While putting the ACSF in the incubator would help achieve aim ², the level of oxygen dissolved would be probably quite low as the incubator temperature is 37'C and it contains only ~²0% oxygen (like in the normal air). Therefore, it would be really desirable to use Carbogen to bubble the cold ACSF

    Reply
    Posted by: Bartosz B.
    July 27, 2011 - 6:32 PM
  3. I have a question with respect to organotypic slice culture. We have performed the migration study of cancer stem cell on brain xenograft model using organotypic slice culture. Also, to observe the migration of cancer stem cell, we have used to Live imaging machine. After set-up of slice culture onto the machine (37 and 5% CO²), our whole brain or our fluorescence-labelled cancer stem cell were saturated as green at 4hours after set-up. Because of this phenomenon, we can not observe cell movement. Why? Is this autofluorescence by damage of brain on preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 17, 2012 - 10:03 PM
  4. I dont have experience with live imaging of slices but it is possible that after several hours in the microscope chamber the slices are dameged and become autofluorescent.

    Reply
    Posted by: Tatiana H.
    December 20, 2012 - 3:21 PM
  5. Hi,
    Could you mention the CARBOGEN catalog number. I would like to order one?

    Thank-you,
    Regards, Naveen


    Naveen.

    Reply
    Posted by: naveen k.
    June 4, 2013 - 2:23 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics