NanoDrop Microvolume Kvantifiering av nukleinsyror

Biology
 

Summary

Användningen av NanoDrop microvolume system som praktiska och effektiva alternativ till traditionell nukleinsyra kvantifiering metod beskrivs genom demonstration av två microvolume nukleinsyra protokoll syra kvantifiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565, doi:10.3791/2565 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biomolekylära analyser utvecklas ständigt som använder allt mindre mängder av material, ofta hindrar användningen av konventionella kyvett styrmedel för nukleinsyra kvantifiering för dem som kan utföra microvolume kvantifiering.

Den NanoDrop microvolume prov retention system (Thermo Scientific NanoDrop produkter) funktioner genom att kombinera fiberoptisk teknik och naturliga ytegenskaper spänning för att fånga och behålla små mängder av provet oberoende av traditionella inneslutning anordning såsom kyvetter eller kapillärer. Dessutom använder systemet kortare väglängd, vilket resulterar i ett brett spektrum av nukleinsyra mätningar syrakoncentration, huvudsakligen eliminerar behovet av att utföra spädningar. Att minska mängden av provet som krävs för spektroskopiska analyser underlättar också införandet av ytterligare åtgärder för kvalitetskontroll under många molekylära arbetsflöden, öka effektiviteten och slutligen leder till större förtroende i efterföljande resultat.

Behovet av högkänsliga fluorescerande analys av begränsad massa har också dykt upp med de senaste experimentella framstegen. Med samma microvolume prov retention-teknik, kan fluorescerande mätningar utföras med 2 mikroliter av material, vilket gör fluorescerande analyser volym krav som måste minskas betydligt. Sådana microreactions av 10 mikroliter eller mindre är nu möjligt att använda en dedikerad microvolume fluorospectrometer.

Två microvolume nukleinsyra kvantifiering protokoll kommer att visas som använder integrerade system prov retention praktiska alternativ till traditionella kyvett-baserade protokoll. För det första är en direkt A260 absorbansen metoden i ett microvolume spektrofotometer beskrivs. Detta följs av en demonstration av en fluorescens-baserad metod som möjliggör minskade volymer fluorescens reaktioner med en microvolume fluorospectrometer. Dessa nya tekniker möjliggöra bedömningen av nukleinsyra koncentrationer från 1 pg / mikroliter till 15.000 ng / mikroliter med minimal förbrukning av prov.

Protocol

1. Microvolume nukleinsyra Kvantifiering med hjälp av en NanoDrop 2000c Spektrofotometer

  1. Till att börja rengöra den övre och nedre optiska ytor microvolume spektrofotometer prov återhållningssystem genom att pipettera från 2 till 3 mikroliter av rent avjoniserat vatten på den nedre optiska ytan.
  2. Stäng hävarmen, se till att den övre sockeln kommer i kontakt med avjoniserat vatten. Lyft arm och torka av både optiska ytor med en ren, torr, luddfri lab torka.
  3. Öppna NanoDrop programvara och välj nukleinsyra ansökan. Använd en liten volym, kalibrerad pipett för att utföra en tom mätning genom att man avskaffar en mikroliter av buffert på den nedre optiska ytan. Sänk armen och välj "Blank" i nukleinsyra ansökan.
  4. När tom mätningen är klar, ren både optiska ytor med en ren, torr, luddfri lab torka.
  5. Välj lämplig konstant för det urval som ska mätas.
    Provtyp Välj Alternativ Konstant Används för att beräkna Koncentration
    dsDNA DNA-50 50
    ssDNA DNA-33 33
    RNA RNA-40 40
    Oligo Anpassad 15-150
    Tabell 1. Typiska nukleinsyra koncentrationsintervall för direkt A280 absorbansen mätningar med en NanoDrop microvolume spektrofotometer, en traditionell kyvett-baserad spektrometer används med en TrayCell microcell kyvett, och en microvolume NanoDrop fluorospectrometer i samband med PicoGreen analysen.
  6. Dispensera 1 mikroliter av nukleinsyra prov på den nedre optiska piedestal och stäng hävarm. Eftersom mätningen är volymen oberoende, behöver provet bara för att överbrygga klyftan mellan de två optiska ytor för en mätning göras.
  7. Välj "Mät" i programmet. Programvaran kommer automatiskt att beräkna den nukleinsyra koncentration och renhet nyckeltal. Följande exempel mätning, granska spektrala utgång.
  8. Programvaran kommer automatiskt att beräkna den nukleinsyra koncentration och renhet nyckeltal. Följande exempel mätning, granska spektrala bilden för att bedöma prov kvalitet.
  9. En typisk nukleinsyra prov kommer att ha en mycket karakteristisk profil.
    Figur 1
    Figur 1. En typisk nukleinsyra prov kommer att ha en mycket karakteristisk profil.
  10. Vanliga källor till föroreningar i samband med särskilda nukleinsyra tekniker syra isolering inkluderar Fenol / Trizol och kolumn extraktion. Vid fenol / Trizol utvinning, kan resterande reagens föroreningar anges genom onormal spektra mellan 220-240 nm samt av förändringar i de 260 till 280 nm regionen. Omvänt kan rester guanidin från kolumn utvinning bidrar till en topp nära 230 nm och en förskjutning i tråget från 230 nm till ca 240 nm.
    Figur 2
    Figur 2. Förändringar i toppar och dalar av prov B och C jämfört med prov A illustrera hur föroreningar kan påverka spektra av nukleinsyra prover.
  11. Att exakt bedöma prov kvalitet bör 260/280 eller 260/230 nyckeltal analyseras i kombination med övergripande spektrala kvaliteten. Ren nukleinsyror ger oftast en 260/280 förhållandet mellan ~ 1,8 och en 260/280 förhållandet ~ 2,0 för DNA och RNA, respektive. Detta förhållande är beroende av pH och jonstyrka i bufferten används för att göra den tomma och mätningar prov. Sura lösningar kommer att under-representera förhållandet med 0,2-0,3, medan en grundläggande lösning kommer att över-representera förhållandet med 0,2-0,3. Signifikant olika renhet nyckeltal kan tyda på närvaro av protein, fenol eller andra föroreningar som absorberar starkt vid eller nära 280 nm. Den 260/230 renhet förhållandet är en andra åtgärd av DNA renhet med värden för ett "rent" nukleinsyra vanligen i intervallet 1,8-2,2. Renhet nyckeltal som är betydligt lägre än de förväntade värden kan indikera isolering teknik som används kan kräva ytterligare optimering.
  12. NanoDrop spektrofotometrar kan även användas för att kvantifiera proteiner med direkta absorbans eller protein kolorimetrisk analyser. För att säkerställa korrekt kolumn bildning och reproducerbarhet, är 2-l prover rekommenderas för proteinet prover. Se följande JUPITER videon: Microvolume proteinkoncentration Fastställande Använda NanoDrop Spektrofotometer http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

  1. För att visa högkänsliga microvolume nukleinsyra kvantifiering med NanoDrop 3300, är ​​en PicoGreen fluorescens kit används. Till att börja balansera satsen standarderna och alla nukleinsyra prover syra till rumstemperatur. Fluorescerande prover är ljuskänsliga och bör förvaras i gult eller aluminiumrör inslagna.
  2. Förbered tillräckligt 1x TE buffert för alla standarder och prov som skall mätas samt för PicoGreen arbetar lösning som kommer att behövas. Förbered 1xTE buffert genom att späda den medföljande 20x TE buffert med nukleasfritt vatten per tillverkarens protokollet. Reaktion volymerna kan variera från 200 mikroliter till så lite som 10 ul. I detta exempel kommer 10 mikroliter reaktionsvolym vara beredd.
  3. Förbered seriellt utspädd dsDNA standarder på 2x den önskade slutgiltiga koncentrationen i nukleasfritt flaskor eller rör. Överföring 5 mikroliter av varje av den utspädda dsDNA standarderna i en enskild märkt nukleasfritt gul eller folie-täckt rör.
  4. Alikvotera 5 mikroliter av varje dsDNA urval av intresse i korrekt märkta nukleasfritt gul eller folie-täckt rör.
  5. Förbered PicoGreen fungerande lösning enligt tillverkarens protokollet. Överför en lika stor volym av PicoGreen fungerande lösning till varje rör som innehåller antingen en standard eller prov av intresse (5 mikroliter i detta exempel).
  6. Kombinera lika stora volymer av 1x TE buffert och PicoGreen fungerande lösning för att förbereda den negativa kontrollen, som fungerar som en referens lösning.
  7. Blanda innehållet i varje reaktionsrör noggrant genom försiktig pipettering och inkubera de reaktioner vid rumstemperatur i 5 minuter. Alla standarder och prover bör återfå samma temperatur innan mätning som fluorescenssignalen påverkas av temperaturen.
  8. För att förbereda instrumentet och göra mätningar, först rena den nedre och övre ytorna av provet behålla systemet. Pipettera 2 till 3 mikroliter av avjoniserat vatten på den nedre optiska ytan, stäng sedan öppnar hävarmen och blot övre och nedre piedestaler med en ren, luddfri, laboratorium torka. Se till att ytorna är fria från ludd innan så ludd kan uppvisa fluorescens i närvaro av en exciteringskälla och kan störa mätningen.
  9. Öppna instrumentets programvara, välj "Nucleic Acids" programmet och välj "PicoGreen-dsDNA" alternativet.
  10. Att blanka instrumentet, tillsätt 2 mikroliter 1X TE till de lägre piedestal, stäng armen och välj "Blank" i instrumentets programvara fältet. När tomt är klar blot bort blindlösning från båda ytorna av provet behålla systemet.
  11. Blanda referenslösningen genom försiktig pipettering. Med låg retention tips, pipett 2 mikroliter på den nedre sockeln och stäng armen.
  12. Välj "Referens" i mätningen typ och välj önskad enheter. Klicka på "åtgärd" att inleda mätcykeln.
  13. När mätningen cykeln är klar öppnar armen och grundligt blot av provet ytorna behålla systemet. Mät upp till fem replikat av referens, med hjälp av ett nytt delprov för varje replikera.
  14. Upprepa processen för ytterligare standarder för att bygga upp en standardkurva. Upp till sju standarder får användas. Programvaran är utformad för att lagra upp till fem replikat för varje standard. Replikat av standarder är i genomsnitt för att generera en standardkurva som stickprovet koncentrationerna bestäms automatiskt.
  15. När standardkurva är klar, välj "Samples" fliken, skriv in respektive information prov-ID och mäta varje okänt prov.

Discussion

Kvantitering protokollen som presenteras här är baserade på den mest accepterade microvolume system. Sådana system ger praktiska alternativ för traditionella nukleinsyra kvantifiering metodik, som förlitar sig på större prov volymer och användning av inneslutning apparater.

NanoDrop microvolume tekniken använder ett system prov bevarande som bygger på egenskaperna ytspänningen av provet som mäts för att bilda en vätska kolumn. Det är viktigt att provet kommer i kontakt med övre och nedre optisk mätning ytor för korrekt kolumn bildas. Om det vid något tillfälle mätresultaten verkar vara felaktiga eller inte reproducerbar, är det sannolikt ett resultat av prov heterogenitet eller flytande kolumnen brott.

Tvätt-och isopropylalkohol rekommenderas inte rengöringsmedel eftersom de kan uncondition ytorna piedestal mätningen. En obetingad piedestal uppstår när de hydrofoba ytegenskaper av sockeln har äventyrats, vilket resulterar i en utplaning av provet droppen. Obetingade piedestaler kan leda till brott av vätskan kolumnen under mätningen.

Figur 3
Figur 3. Obetingade yta kännetecknas av en flackare en vattendroppe.

Uncondtioned piedestal ytor kan renoveras med hjälp av NanoDrop sockel Renovering Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Ett tunt lager av rekonditionering förening appliceras på övre och nedre piedestal ytor, få torka ~ 30 sekunder och sedan gnuggas bort med en ren, torr, luddfri lab torka. Ett framgångsrikt rekonditionerade tillståndet kännetecknas av en vattendroppe beading upp när den tillämpas till botten piedestal ytan.

Figur 4
Figur 4. En renoverad yta kännetecknas av en beading av en vattendroppe.

Microvolume kvantifiering system minskar kraftigt prov konsumtion och dramatiskt öka koncentrationen intervallet jämfört med mer traditionella kvantifiering system. Även microvolume kvantifiering har blivit ofta en möjliggörande teknik för omständigheter som innebär begränsad cellmassan som nål biopsier och laser-capture microdissection, effektivitet och enkel användning av denna metod har gjort det ett allmänt accepterat alternativ till traditionella nukleinsyra metoder kvantifiering även När provet är riklig.

Disclosures

Philippe Desjardins och Debra Conklin är anställda av Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc som tillverkar de instrument som används i denna artikel.

Acknowledgments

Richard W. Beringer och David L. Ask, Program Forskare, Thermo Scientific NanoDrop produkter, tekniskt stöd och filmning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-2000C
NanoDrop 3300 Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-3300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
  2. Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. Munich, Germany. (2006).
  3. Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. Spectrochemical analysis. Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).
  4. Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).

Comments

4 Comments

  1. Por favor, estoy muy interesada en el nanodrop, necesitaria que me enviaran esta pagina traducida al espa&#²41;ol. MUCHAS GRACIAS

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2011 - 3:56 AM
  2. Hola Conchi,

    Lo sentimos pero no ofrecemos traducciones al texto de nuestros articulos en este momento. Podemos darte un link con una traduccion hecha por Google, http://translate.googleusercontent.com/translate_c?act=url&hl=en&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com&sl=en&tl=es&twu=1&u=http://www.jove.com/details.php%3Fid%3D²565&usg=ALkJrhg4rISg8npshQi-1l4URzWgN1xnAg y afortunadamente para este video ofrecemos varios idiomas incluyendo español http://www.jove.com/details.php?ID=²894
    -Chris

    Reply
    Posted by: Chris M.
    April 15, 2011 - 8:43 AM
  3. Which buffer is recommended to be used in this system?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2011 - 4:58 AM
  4. hello, i am using nanodrop for measure seweeds DNA, in all samples 260/230 ratio is lower than 1! this means my sample are very dirty? should i need an extra purification of my samples? thanks

    Reply
    Posted by: clementina p.
    September 4, 2013 - 12:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics