NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biology
 

Summary

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565, doi:10.3791/2565 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מבחני Biomolecular הרף מפותח כי השימוש בהדרגה כמויות קטנות של החומר, לעיתים קרובות מניעת השימוש קובט מבוססות מכשירים קונבנציונלי עבור quantitation חומצות גרעין עבור אלה שיכולים לבצע quantitation microvolume.

החזקת NanoDrop microvolume מערכת מדגם (Thermo Scientific מוצרים NanoDrop) פונקציות על ידי שילוב הטכנולוגיה סיב אופטי טבעי מתח מאפייני פני השטח כדי ללכוד ולשמר כמויות זעירות של מדגם עצמאי של מנגנון הבלימה מסורתיים כגון cuvettes או נימים. יתר על כן, המערכת מעסיקה אורכי נתיב קצר יותר, אשר התוצאה מגוון רחב של מדידות ריכוז חומצת גרעין, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. הקטנת נפח של המדגם הנדרש עבור ניתוח ספקטרוסקופיות גם מקלה על הכללת צעדים שליטה נוספת באיכות ברחבי workflows מולקולרית רבים, הגברת היעילות, ובסופו של דבר מוביל בביטחון רב יותר בתוצאות במורד הזרם.

הצורך בניתוח רגישות גבוהה הניאון של מסה מוגבל התפתחה גם עם התקדמות הניסוי האחרונות. שימוש באותה טכנולוגיה שימור microvolume מדגם, מדידות פלורסנט ניתן לבצע עם μL 2 של החומר, דבר המאפשר פלורסנט מבחני דרישות נפח להצטמצם באופן משמעותי. Microreactions כזה של μL 10 פחות או יותר כעת אפשרי באמצעות fluorospectrometer ייעודי microvolume.

שני microvolume גרעין quantitation פרוטוקולים חומצה יהיה הפגינו המשתמשים משולב מדגם שימור מערכות כמו חלופות מעשיות קובט פרוטוקולים מבוססי המסורתית. ראשית, שיטה ישירה A260 ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume מתואר. זה ואחריו הפגנה של השיטה הקרינה מבוססי המאפשרת לצמצם נפח תגובות פלואורסצנציה עם fluorospectrometer microvolume. אלו טכניקות הרומן לאפשר הערכה של ריכוזי חומצות גרעין החל 1 pg / μL עד 15,000 ng / μL עם צריכה מינימלית של המדגם.

Protocol

1. Microvolume כימות חומצות גרעין שימוש 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

  1. כדי להתחיל, לנקות את המשטחים אופטי העליון והתחתון של מערכת מדגם ספקטרופוטומטר microvolume השמירה על ידי pipetting 2-3 μL deionized מים נקיים על פני השטח אופטי נמוך.
  2. סגור את זרוע המנוף, על מנת להבטיח כי הדום העליון בא במגע עם המים deionized. הרם את זרוע המנוף לנגב הן משטחים אופטיים עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב.
  3. פתח את תוכנת NanoDrop ובחר ביישום חומצות גרעין. השתמש נפח קטן, pipettor מכויל לבצע מדידה ריק על ידי מחלק 1 μL של המאגר על גבי משטח אופטי נמוך. מנמיכים את זרוע המנוף בחר "ריק" ביישום חומצות גרעין.
  4. לאחר המדידה ריק תושלם, גם משטחים נקיים אופטי עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב.
  5. בחר את קבוע מתאים המדגם זה כדי להימדד.
    לדוגמה סוג בחר אפשרות קבועים המשמשים לחישוב ריכוז
    dsDNA DNA-50 50
    ssDNA DNA-33 33
    RNA RNA-40 40
    אוליגו מנהג 15-150
    טבלה 1. אופיינית ריכוז חומצת גרעין טווחי עבור A280 מדידות ישירות באמצעות ספיגת NanoDrop microvolume ספקטרופוטומטר, ספקטרופוטומטר קובט מסורתיים מבוססי המשמשים עם microcell TrayCell קובט, וכן fluorospectrometer NanoDrop microvolume בשיתוף עם assay PicoGreen.
  6. לוותר על 1 μL המדגם חומצות גרעין על הכן אופטי נמוך ולסגור את זרוע המנוף. כי המדידה היא בנפח עצמאית, המדגם צריך רק כדי לגשר על הפער בין שני משטחים אופטיים עבור המדידה להתבצע.
  7. בחר "מדוד" תוכנת היישום. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את הפלט רפאים.
  8. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את התמונה ספקטרלי כדי להעריך את איכות המדגם.
  9. דוגמה טיפוסית חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד.
    איור 1
    באיור 1. מדגם טיפוסי חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד.
  10. מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים ספציפית טכניקות בידוד גרעין חומצה כוללים להפקת פנול / Trizol ועמודה. במקרה של מיצוי פנול / Trizol, זיהום מגיב השיורי עשוי להיות מסומן על ידי ספקטרום נורמלי בין 220-240 ננומטר, כמו גם על ידי משמרות באזור 260-280 ננומטר. לעומת זאת, guanidine שיורית מתוך מיצוי טור עשויים לתרום שיא ליד 230 ננומטר שינוי השוקת מ 230 ננומטר של כ 240 ננומטר.
    איור 2
    איור 2. המשמרות את העליות והמורדות של דגימות B ו-C לעומת מדגם להמחיש כיצד מזהמים יכולים להשפיע על ספקטרום של דגימות חומצות גרעין.
  11. כדי להעריך נכונה איכות המדגם, 260/280 או 260/230 יחס צריך להיות מנותח בשילוב עם איכות רפאים הכולל. חומצות גרעין טהור בדרך כלל תשואה יחס של 260/280 ~ 1.8 ו 260/280 יחס של 2.0 ~ עבור DNA ו-RNA, בהתאמה. יחס זה תלוי pH וחוזק היוני של המאגר המשמש לייצור הריק ומדידות במדגם. פתרונות חומציים יהיה מתחת מייצגים את היחס של 0.2-0.3, ואילו הפתרון הבסיסי יהיה מעל מייצגים את היחס של 0.2-0.3. יחסי טוהר שונה באופן משמעותי עלול להעיד על נוכחות של מזהמים חלבון פנול או אחרים לספוג חזק ליד או 280 ננומטר. יחס 260/230 טוהר הוא מדד השנייה של טוהר DNA עם ערכי חומצת "טהור" גרעין בדרך כלל בטווח של 1.8-2.2. יחסי טוהר כי נמוכים משמעותית את ערכי צפוי עשוי להצביע על הטכניקה בידוד בשימוש עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת.
  12. הספקטרופוטומטרים NanoDrop יכול לשמש גם לכמת חלבונים באמצעות ספיגת ישיר או באמצעות מבחני חלבון colorimetric. כדי להבטיח בטור reproducibility נכונה, 2-μl דגימות מומלץ עבור דגימות חלבון. עיין וידאו יופיטר הבאים: קביעת ריכוז חלבון Microvolume באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

s = "jove_title"> 2. רגישות גבוהה Microvolume quantitation חומצות גרעין שימוש Fluorospectrometer NanoDrop 3300

  1. כדי להפגין רגישות גבוהה quantitation microvolume חומצות גרעין באמצעות NanoDrop 3300, ערכה הקרינה PicoGreen משמש. כדי להתחיל, לאזן את הסטנדרטים ערכת וכל דגימות חומצות גרעין לטמפרטורת החדר. דגימות פלורסנט אור רגיש יש לשמור ענבר או צינורות אלומיניום עטופים.
  2. הכן 1x מספיק חיץ TE לכל הסטנדרטים דגימות כדי להימדד כמו גם לפתרון PicoGreen לעבוד כי יהיה צורך. הכן חיץ 1xTE על ידי דילול בתנאי 20x TE חיץ עם מים nuclease חופשי לכל פרוטוקול של היצרן. כרכים תגובת יכול לנוע בין 200 ל μL ul קטנה כמו 10. בדוגמה זו, 10 כרכים התגובה μL יהיה מוכן.
  3. הכן סדרתי סטנדרטים בדילול dsDNA בריכוז 2x הרצוי הסופי nuclease ללא צלוחיות או צינורות. העברת 5 μL של כל אחד מן הסטנדרטים dsDNA בדילול אל הפרט שכותרתו nuclease ללא ענבר או קרקרים צינור.
  4. 5 Aliquot μL של המדגם כל dsDNA עניין לתוך ענבר nuclease ללא שכותרתו כראוי או קרקרים צינורות.
  5. הכן פתרון PicoGreen עובד על פי פרוטוקול של היצרן. העברת נפח שווה של הפתרון PicoGreen עובדים כדי שכל אחת מהן מכילה גם צינור רגיל או מדגם של עניין (5 μL בדוגמה זו).
  6. שלב כרכים שווה של 1x TE חיץ פתרון PicoGreen לעבוד כדי להכין את השליטה שלילית, המהווה פתרון התייחסות.
  7. מערבבים את תכולת שפופרת כל תגובה ביסודיות על ידי pipetting עדין דגירה התגובות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. כל הסטנדרטים דגימות צריך להיות equilibrated לטמפרטורה זהה לפני המדידה כאות הקרינה מושפעת טמפרטורה.
  8. כדי להכין את המכשיר לבצע מדידות, תחילה לנקות את המשטח העליון והתחתון של מערכת השמירה המדגם. 2-3 Pipet μL של מים על פני השטח deionized אופטי נמוך, סגור ולאחר מכן פתח את זרוע המנוף, ומוחה את כנים העליון והתחתון עם נקייה ונטולת מוך, נגב מעבדה. ודא משטחים חופשיים של מוך לפני שתמשיך כמו מוך יכול להציג פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור והוא יכול להפריע המדידה.
  9. פתח את התוכנה במכשיר, בחר את "חומצות גרעין" יישומים, ובחר את "PicoGreen-dsDNA" אפשרות.
  10. כדי ריק המכשיר, להוסיף 2 μL של 1x TE אל הכן התחתון, לסגור את הזרוע, ולחצו על "ריק" בתחום התוכנה במכשיר. לאחר השלמת ריק, כתם את הפתרון ריק משני משטחים של מערכת השמירה המדגם.
  11. מערבבים את הפתרון על ידי התייחסות pipetting עדין. בעזרת טיפים שימור נמוך, μL 2 פיפטה על הדום התחתונה ולסגור את הזרוע.
  12. בחר "הפניה" בסוג המדידה, בחר את היחידות הרצויות. לחץ על "מדוד" ליזום את מחזור המדידה.
  13. כאשר מחזור המדידה היא מוחלטת, לפתוח את היד וביסודיות למחוק את השמירה מדגם משטחים המערכת. מדוד עד חמש משכפל התייחסות, באמצעות aliquot טרי לשכפל כל אחד.
  14. חזור על התהליך עבור הסטנדרטים נוסף לבנות עקומת סטנדרטי. עד שבעה תקנים ניתן להשתמש. התוכנה נועדה לאחסן עד חמישה משכפל עבור כל תקן. משכפל סטנדרטים הם בממוצע כדי ליצור עקומת סטנדרט שממנו ריכוזי מדגם נקבעים באופן אוטומטי.
  15. לאחר עקומת הסטנדרטי הוא שלם, בחר את "דוגמאות" הכרטיסייה, הזן את המידע המתאים מזהה מדגם ולמדוד כל מדגם לא ידוע.

Discussion

פרוטוקולים quantitation המוצגים כאן מבוססים על רוב מקובל microvolume מערכות. מערכות אלו מספקות אלטרנטיבות מעשיות מסורתיות מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation, אשר מסתמכים על כרכים מדגם גדול יותר ושימוש מנגנון הבלימה.

NanoDrop microvolume טכנולוגיה מעסיקה השמירה מדגם מערכת שמסתמכת על המתח מאפייני פני השטח של המדגם הנמדדים כדי ליצור עמודה נוזלי. זה חיוני כי המדגם יוצר מגע עם משטחים העליון והתחתון מדידה אופטיות עבור בטור המתאים. אם בכל נקודה על תוצאות המדידה נראה לשחזור מדויק או לא, היא ככל הנראה תוצאה של הטרוגניות מדגם או שבירה טור נוזלי.

דטרגנטים ואלכוהול איזופרופיל אינם מומלצים חומרי ניקוי, כיוון שהם עלולים uncondition המדידה משטחים הדום. הדום מותנית מתרחשת כאשר מאפייני פני השטח של הידרופובי הכן נפרץ, וכתוצאה מכך השטחת אגל המדגם. כנים מותנית יכולה להוביל שבירה של הטור נוזל בזמן המדידה.

איור 3
איור 3. משטח מותנה מאופיין השטחת אגל מים.

משטחים הדום Uncondtioned יכול להיות משופץ באמצעות מתחם Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1, Thermo Scientific מוצרים NanoDrop). שכבה דקה של המתחם שפוץ מוחל על משטחי רגל העליון והתחתון, להתייבש במשך ~ 30 שניות, ולאחר מכן שפשף את השימוש נקייה ונטולת מוך יבש, מעבדה לנגב. המדינה מחודשים בהצלחה מאופיין אגל מים ואגלי כאשר מוחל על פני השטח הדום התחתונה.

איור 4
איור 4. משטח משופץ מאופיין ואגלי את אגל מים.

מערכות Microvolume quantitation לצמצם במידה ניכרת את צריכת מדגם להגדיל באופן משמעותי את טווח הריכוז בהשוואה למערכות כימות מסורתיים יותר. למרות quantitation microvolume יש לעתים קרובות להפוך טכנולוגיה המאפשרת בנסיבות מעורבים מסת תאים מוגבל כגון ביופסיות מחט לייזר ללכוד microdissection, את היעילות ואת קלות השימוש של מתודולוגיה זו הפכה אותה מקובל אלטרנטיבה המסורתי גרעין quantitation שיטות חומצה אפילו כאשר המדגם הוא בשפע.

Disclosures

פיליפ Desjardins ו דברה קונקלין מועסקים על ידי Thermo Scientific NanoDrop מוצרים, Inc המייצרת את המכשירים המשמשים במאמר זה.

Acknowledgments

ריצ'רד וו Beringer דוד L. אש, יישומים מדענים, תרמו מוצרים מדעי NanoDrop, סיוע טכני הצילומים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-2000C
NanoDrop 3300 Thermo Fisher Scientific, Inc. ND-3300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
  2. Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. Munich, Germany. (2006).
  3. Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. Spectrochemical analysis. Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).
  4. Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).

Comments

4 Comments

  1. Por favor, estoy muy interesada en el nanodrop, necesitaria que me enviaran esta pagina traducida al espa&#²41;ol. MUCHAS GRACIAS

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2011 - 3:56 AM
  2. Hola Conchi,

    Lo sentimos pero no ofrecemos traducciones al texto de nuestros articulos en este momento. Podemos darte un link con una traduccion hecha por Google, http://translate.googleusercontent.com/translate_c?act=url&hl=en&ie=UTF8&prev=_t&rurl=translate.google.com&sl=en&tl=es&twu=1&u=http://www.jove.com/details.php%3Fid%3D²565&usg=ALkJrhg4rISg8npshQi-1l4URzWgN1xnAg y afortunadamente para este video ofrecemos varios idiomas incluyendo español http://www.jove.com/details.php?ID=²894
    -Chris

    Reply
    Posted by: Chris M.
    April 15, 2011 - 8:43 AM
  3. Which buffer is recommended to be used in this system?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2011 - 4:58 AM
  4. hello, i am using nanodrop for measure seweeds DNA, in all samples 260/230 ratio is lower than 1! this means my sample are very dirty? should i need an extra purification of my samples? thanks

    Reply
    Posted by: clementina p.
    September 4, 2013 - 12:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics