Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Biology
 

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

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Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor. J. Vis. Exp. (50), e2579, doi:10.3791/2579 (2011).

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Abstract

Cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio intracellulare in risposta a vari stimoli regola molti processi cellulari quali la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi 1. Durante l'apoptosi, l'accumulo di calcio nei mitocondri promuove il rilascio di fattori pro-apoptotici dai mitocondri nel citosol 2. E 'quindi di interesse per misurare direttamente il calcio mitocondriale nelle cellule viventi in situ durante l'apoptosi. Imaging ad alta risoluzione a fluorescenza di cellule caricate con coloranti di calcio a doppia eccitazione raziometrici e non raziometrico sintetico indicatore è stato dimostrato di essere uno strumento affidabile e versatile per studiare vari aspetti della segnalazione calcio intracellulare. Misurazione dei flussi di calcio citosolico utilizzando queste tecniche è relativamente semplice. Tuttavia, misurare i livelli di calcio nelle cellule intatte intramitocondriale utilizzando indicatori sintetici come il calcio Rhod-2 e Rhod-FF è più impegnativo. Indicatori sintetici mirati per i mitocondri sono spuntate le risposte ad un aumento ripetitive di calcio mitocondriale, e disturbare morfologia mitocondriale 3. Inoltre, gli indicatori sintetici tendono a fuoriuscire dei mitocondri per diverse ore il che li rende inadatti per esperimenti a lungo termine. Così, gli indicatori di calcio geneticamente codificato basato sulla proteina fluorescente verde (GFP) 4 o 5 aequorina mirati per i mitocondri hanno notevolmente facilitato la misurazione delle dinamiche di calcio mitocondriale. Qui, descriviamo un metodo semplice per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale in risposta a stimoli diversi. Il metodo si basa sulla microscopia a fluorescenza di 'raziometrici-pericam', che è più mirato ai mitocondri. Raziometrico pericam è un indicatore di calcio basato su una fusione di permutati circolarmente proteina fluorescente gialla e calmodulina 4. Legame del calcio a pericam raziometrici provoca uno spostamento del suo picco di eccitazione da 415 nm a 494 nm, mentre lo spettro di emissione, con un picco intorno a 515 nm, rimane invariato. Raziometrico pericam lega un singolo ione di calcio con una costante di dissociazione in vitro di ~ 1.7 microM 4. Queste proprietà di pericam raziometrici permettono la quantificazione di cambiamenti rapidi e di lungo periodo della concentrazione di calcio mitocondriale. Inoltre, si descrive l'adattamento di questa metodologia ad un tenore di ampio campo ottico di immagini di calcio con set di filtri comunemente disponibili. Usando due agonisti distinti, il purinergici agonista ATP e che induce l'apoptosi staurosporina droga, ci dimostrano che questo metodo è appropriato per monitorare i cambiamenti nella concentrazione di calcio mitocondriale con una risoluzione temporale di secondi a ore. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che pericam raziometrico è anche utile per misurare fissione mitocondriale / frammentazione durante l'apoptosi. Così, pericam raziometrico è particolarmente adatto per continuo a lungo termine di misura delle dinamiche di calcio mitocondriale durante l'apoptosi.

Protocol

1. Pericam-mt Transfection e preparazione delle cellule.

  1. Piastra di cellule HeLa la notte prima di transfezione su vetrini sterili di vetro posta in una standard a 6 e piastra di coltura.
  2. Preparare DNA / Lipofectamine 2000 complessi come suggerito dal produttore (Invitrogen). Noi usiamo 4 microgrammi di raziometrici-pericam-mt vettore di espressione e 10 L del 2000 Lipofectamine diluito in 0,5 ml di Opti-MEM per ogni bene. Le cellule devono essere confluenti ~ 70% prima della trasfezione.
  3. Sostituire HeLa cultura dei media (Dulbecco modificato aquile medio, 10% FBS, penicillina / streptomicina) in ogni pozzetto con 1.5 mL degli stessi media senza antibiotici.
  4. Aggiungere il DNA / Lipofectamine complessi in ciascun pozzetto di essere transfettate. Mescolare delicatamente con dondolo e incubare per 4 ore in una cella cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2.
  5. Sostituire antibiotico-media liberi, con terreni di coltura con gli antibiotici. Consentono alle cellule di esprimere pericam raziometriche per 1-2 giorni prima di imaging.

2. Microscopio installazione e acquisizione immagini

  1. Posizionare un vetrino con cellule HeLa in una camera per immagini con una soluzione di imaging: 107mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11,5 mm di glucosio, 0,1% di albumina di siero bovino, e HEPES 20 mM 7.2. Il nostro laboratorio utilizza la camera di cellule Attofluor da Invitrogen. Montare la camera di imaging in una fase microscopio invertito.
  2. Trova una zona di interesse contenente una o più cellule che esprimono pericam raziometrico con un 40x (o superiore) obiettivo ad immersione olio. Abbiamo scoperto che pericam raziometrico è meno resistente di photobleaching a 380 nm, e quindi usiamo questa lunghezza d'onda per identificare le cellule adatte. Per le immagini acquisite in Figura 1, un obiettivo Nikon Superfluor 40X con apertura 1,3 numerica è stata utilizzata. Obiettivi ingrandimento superiore Sarebbe anche opportuno (60-100x). I filtri utilizzati sono stati di eccitazione Chroma Tecnologia filtri D380/30x (380 + / - 30 nm) e D495/10 (495 + / - 5 nm), è stata beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ed emissioni filtro è stato HQ535/50m (535 + / - 25 nm).
    Il nostro microscopio utilizzato per acquisire le immagini in figura 1 è costituito da un microscopio invertito Nikon TE2000 dotato di un Roper Scientific Coolsnap HQ raffreddato CCD, Ludl MAC6000 rapido ruota portafiltri e cambio, e un MetaFluor acquisizione dati e software di analisi. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi standard a grande campo microscopio con i filtri appropriati e software in grado di catturare ed elaborare le immagini raziometrico.
  3. Impostare il software per l'eccitazione doppia utilizzando il 495 e 380 nm filtri. Calcio legame pericam raziometrici aumenta assorbanza a 495 nm, quindi il rapporto dovrebbe essere impostato per essere nm/380 495 nm.
    Raziometrico pericam ha un calcio senza picco di eccitazione a 415 nm 4. In questo protocollo si consiglia utilizzando un filtro da 380 nm solo perché è onnipresente nei laboratori più calcio di imaging. Se un filtro a 410 nm è disponibile, è preferibile il filtro 380 nm.
  4. Acquisire immagini in sequenza alternativamente emozionante a 495 e 380 nm. Acquisire immagini al basale dei livelli di calcio per almeno 30 s prima di applicare agonista tramite un apparato di perfusione. Segnano il tempo più di ogni agonista. Tempi di esposizione e gli intervalli di acquisizione deve essere ottimizzata per evitare photobleaching pur consentendo sufficiente esempio temporale resolution.For, per semi-rapida dinamica di calcio monitorati in risposta alla stimolazione con agonisti, immagini sono state acquisite ogni due secondi in 1B Figure e C. Molto più veloce tasso di acquisizione Sono possibili anche 6. A lungo termine dopo la somministrazione di imaging staurosporina è stata acquisita con un intervallo più lungo (30 anni) tra le acquisizioni (Figure 1 D ed E).

3. Image Processing and Analysis

  1. Una volta che l'esperimento è completo, le immagini ottenute possono essere analizzati in linea. Definire le aree di interesse (ROI) in cui si desidera monitorare i cambiamenti dei livelli di calcio. Utilizzare un ROI selezionate all'interno di una zona vuota del campo per sottrarre sfondo, se necessario. Va notato che i mitocondri sono molto mobili e dinamiche, e gli eventi in un mitocondrio estrapolando solo per lunghi periodi non è sempre possibile. Così, considerando l'elevata motilità di questo organello in alcuni tipi di cellule, la selezione di ROI deve essere attentamente monitorato. Inoltre, come evidenziato in Figura 1, i mitocondri eterogeneo risposta a vari stimoli. E 'quindi importante analizzare e monitorare i dati offline RO1 posizionamento su un fotogramma per fotogramma. Una descrizione dettagliata di misurare calcio mitocondriale altamente mobili mitocondri è stata descritta in altri 7.
  2. Misure di rapporto ottenuto dal ROI possono essere importati in Excel o simili graphingsoftware. I dati possono essere presentati come una traccia che rappresenta i cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale in una singola cella o mitocondrio singola, o una media di flsegnali uorescence dal ROI diversi. Abbiamo anche usato questa tecnica per misurare i livelli medi di calcio mitocondriale in una popolazione di linfociti in fase di apoptosi indotta da Fas ligando 8.

4. Rappresentante dei risultati:

Figura 1
Figura 1. (A) la localizzazione subcellulare di raziometrici-pericam-mt. Questa prima immagine mostra dal vivo di cellule HeLa che esprimono raziometrico-pericam-mt. La seconda immagine mostra colorazione fluorescente con mitocondrio selettivi CMXRos MitoTracker colorante rosso. La fluorescenza giallo nell'immagine fusa dimostra co-localizzazione di raziometrici-pericam-mt e fluorescenza MitoTracker. (B) Una serie di pseudocolori rapporto (495:380 nm) immagini di 4 cellule HeLa che esprimono mt-raziometrico pericam trattati con 10 mM ATP . (C) Quantificazione dei cambiamenti nei livelli di calcio mitocondriale nella regione di interesse (ROI) di cui (B) trattati con 10 mM ATP. (D) Serie di rapporto pseudocolori (495:380 nm) le immagini di una cellula HeLa che esprimono mt -raziometrico pericam trattati con 0,5 staurosporina micron. L'eterogeneità nella risposta di calcio nei mitocondri individuale è evidente, così come notevole frammentazione dei mitocondri di 60 minuti. Alcuni hanno mitocondri aumenta oscillatorio di calcio (punta di freccia bianca), mentre altri non mostrano variazioni significative nel livello di calcio (testa freccia gialla). (E) Quantificazione di aumenti dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula HeLa dopo l'induzione di apoptosi con 0,5 mM staurosporina.

Discussion

Qui vi presentiamo un metodo molto semplice per misurare il calcio mitocondriale mitocondriali utilizzando mirate pericam raziometrico. Come mostrato nella Figura 1A, utilizzando le normali ottiche widefield senza deconvoluzione è possibile visualizzare facilmente i singoli mitocondri nelle cellule HeLa con accettabile rapporto segnale-rumore. Questo perché le cellule HeLa, come la maggior parte delle cellule in coltura, appiattirsi in modo significativo quando aderente ovviando alla necessità di microscopia confocale o altre apparecchiature specializzate. Abbiamo trovato risultati simili nelle cellule Jurkat aderito a vetrini rivestiti di poli-lisina 8. In contrasto con le metodologie con coloranti, è anche possibile monitorare in maniera non invasiva i livelli di calcio mitocondriale per ore sulla base di indicatori di calcio geneticamente codificato come raziometrico pericam (Figura 1E). Ciò è particolarmente importante quando si analizza il calcio mitocondriale durante la morte delle cellule. Inoltre, è anche possibile visualizzare fissione / frammentazione dei mitocondri durante il processo apoptotico. Come mostrato in Figure 1D ed E, il trattamento staurosporina provoca un lento aumento di calcio in sottopopolazioni selezionate di mitocondri con un picco di 20 minuti. I livelli di calcio scendere di nuovo in concomitanza con la frammentazione mitocondriale prima di andare di nuovo 2 ore dopo il trattamento. Ciò è coerente con le onde lente di calcio citosolico indotti dal trattamento staurosporina misurata utilizzando Fura-2 9. Quindi, importanti informazioni cinetiche possono essere ottenute, che non è possibile con i metodi impiegando misure statiche. Anche se abbiamo presentato i rapporti e le concentrazioni di calcio nella Figura 1, è possibile calibrare il sensore in situ per calcolare i livelli di calcio in assoluto 4, 10. Un avvertimento importante da considerare è che pericam raziometrico è sensibile al pH 4, 10. Poiché entrambi i livelli di pH citosolico e mitocondriale può cambiare radicalmente durante l'apoptosi 11, questa è una considerazione importante. Titolazione di pH in mitocondri isolati pericam esprimendo dimostrare che l'aumento [H +] aumenta le emissioni di pericam quando eccitato a 495 nm, con scarso effetto sulla emissione stimolata di eccitazione a 410 nm, una proprietà che è stata sfruttata per misurare simultaneamente sia di calcio mitocondriale e pH 12. Così, selettivamente monitoraggio delle emissioni con 410 nm di eccitazione fornisce un mezzo per non ratiometrically calcio monitorare mitocondriale con preoccupazione per la riduzione del pH. Infine, il protocollo presentato qui richiede solo l'accesso ad un microscopio standard epifluorescente con filtri ampiamente disponibili, rendendo questa tecnica accessibile alla maggior parte dei laboratori.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Atsushi Miyawaki per averci fornito il raziometrico-pericam-mt costruire espressione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione GM081685 dal National Institutes of Health (DB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope Nikon Instruments MEA53310 Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.
Imaging Software Molecular Devices Metafluor
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816 Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies
MitoTracker Red CMXRos Invitrogen M7512

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References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  2. Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
  3. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
  4. Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
  5. Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  6. Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. pl4-pl4 (2002).
  7. Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
  8. Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
  9. Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  10. Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
  11. Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).

Comments

6 Comments

  1. We believe that dynamic nature and signal to noise ratio of rhod² is much more sensitive than any other fluorescent protein indicators specifically aquerins and mito-pericam. Becuase dynamic basal mitochondrial Ca²+ following any mitochondrial protein silencing is completely masked using the above mentioned indicators. For example, upon ATP addition, there was a progressive accumulation of mitochondrial Ca²+ signal over the time but failed to show any efflux rate indicating that these indicators more complicated than rhod².

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2012 - 6:19 PM
  2. The spatio-temporal dynamics of mitochondrial calcium accumulation vary depending upon the stimulus and the cell type. For example, highly dynamic oscillatory calcium levels measured with ratiometric pericam are seen in Jurkat cells treated with Fas ligand (see reference 8 in the article and supplemental video which accompanies the paper). Thus, we do not feel the ratiometric pericam is limited in this respect.

    Reply
    Posted by: Darren B.
    February 27, 2012 - 2:11 PM
  3. I work with particulate matter air pollution at northwestern and would like to test whether exposure can change calcium release from the mitochondria. Is there a way to get the probe from you?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 1, 2012 - 6:45 PM
  4. Please request the plasmid directly from Dr. Miyawaki here: http://cfds.brain.riken.jp/mta.html

    Reply
    Posted by: Darren B.
    March 3, 2012 - 5:16 PM
  5. Could you give more information on the anitboy selection used in the expression vector (ratiometric-pericam-mt) and what was the concentration added to the media (DMEM/FBS) 4 hours post transfection? I am also interetsed to learn how efficient this vector was in HeLa cells (70%)?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Holly H.
    June 21, 2012 - 4:35 PM
  6. Ratiometric pericam is in the pcDNA3.0 backbone, so amp selection in bacteria and G418 in eukaryotic cells. G418 concentration is empirically determined for each cell type. We generally utilize transient expression without selection, and easily achieve 70% transfection in HeLa cells using Lipofectamine²000. The part referenced in the protocol to "antibiotic free" during transfection and replacement after 4 hours is referring to penicillin/streptomycin present in all of our media. Removing pen/strep during transfection decreases toxicity. Hope this helps.

    Reply
    Posted by: Darren B.
    June 25, 2012 - 12:02 PM

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