Övervakning dynamiska förändringar i mitokondriernas kalciumnivåer under apoptos Använda en genetiskt kodade Kalcium Sensor

Biology
 

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för realtids mätning av mitokondrie-kalcium flöden av fluorescerande avbildning. Metoden utnyttjar ett cirkulärt permuteras YFP-baserade dubbla excitation ratiometrisk kalcium sensor (ratiometrisk pericam-mt) selektivt uttrycks i mitokondrierna.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor. J. Vis. Exp. (50), e2579, doi:10.3791/2579 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dynamiska förändringar i intracellulär kalcium koncentration som svar på olika stimuli reglerar många cellulära processer såsom proliferation, differentiering och apoptos 1. Under apoptos, kalcium ackumuleras i mitokondrierna främjar frisättning av pro-apoptotiska faktorer från mitokondrier i cytosolen 2. Det är därför av intresse att direkt mäta mitokondrie kalcium i levande celler in situ under apoptos. Högupplöst fluorescerande avbildning av celler laddade med dubbla excitation ratiometrisk och icke-ratiometrisk syntetiska färgämnen kalcium Indikatorn har visat sig vara ett pålitligt och mångsidigt verktyg för att studera olika aspekter av intracellulär kalcium signalering. Mätning cytosoliskt kalcium flöden med hjälp av dessa tekniker är relativt enkelt. Att mäta intramitochondrial kalciumhalt i intakta celler med syntetiska kalcium indikatorer såsom Rhod-2 och Rhod-FF är mer utmanande. Syntetisk indikatorer riktade till mitokondrierna ha lindrat svar på repetitiva ökningar i mitokondriella kalcium, och störa mitokondriella morfologi 3. Dessutom syntetiska indikatorer tenderar att läcka ut från mitokondrier under flera timmar, vilket gör dem olämpliga för långtidsförsök. Därför har genetiskt kodade kalcium indikatorer baserade på grönt fluorescerande protein (GFP) 4 eller aequorin 5 riktade till mitokondrierna i hög grad underlättade mätningen av mitokondriell kalcium dynamik. Här beskriver vi en enkel metod för att i realtid mäta av mitokondriell kalcium flöden som svar på olika stimuli. Metoden är baserad på fluorescensmikroskopi av "ratiometrisk-pericam" som selektivt är riktad mot mitokondrier. Ratiometrisk pericam är en kalcium indikator bygger på en sammansmältning av cirkulärt permuterats gula fluorescerande protein och calmodulin 4. Bindningen av kalcium för att ratiometrisk pericam orsakar en förskjutning av excitation topp från 415 nm till 494 nm, medan spektrum, som toppar kring 515 nm, förblir oförändrad. Ratiometrisk pericam binder en enda kalcium jon med en dissociationskonstant in vitro på ~ 1,7 mikroM 4. Dessa egenskaper ratiometrisk pericam tillåter kvantifiering av snabba och långsiktiga förändringar i mitokondriernas kalcium koncentration. Dessutom beskriver vi anpassa denna metod till en standard brett fält kalcium imaging mikroskopet med vanliga filter set. Med hjälp av två olika agonister, den Purinergic agonist ATP och apoptos-inducerande läkemedel staurosporine, visar vi att denna metod är lämplig för att övervaka förändringar i mitokondriernas kalcium koncentration med en tidsupplösning av några sekunder till timmar. Dessutom visar vi också att ratiometrisk pericam är också användbart för att mäta mitokondriella fission / fragmentering under apoptos. Därför är ratiometrisk pericam särskilt väl lämpad för kontinuerlig och långsiktig mätning av mitokondrie kalcium dynamik under apoptos.

Protocol

1. Pericam-mt Transfektion och cellberedningen.

  1. Tavla HeLa celler kvällen innan transfektion på sterila glas täckglas placeras i en standard 6-bra kultur plattan.
  2. Förbered DNA / Lipofectamine 2000 komplex som föreslås av tillverkaren (Invitrogen). Vi använder 4 mikrogram ratiometrisk-pericam-mt uttryck vektor och 10 mikroliter av Lipofectamine 2000 utspädd i 0,5 ml Opti-MEM för varje brunn. Cellerna skall vara ~ 70% confluent innan transfektion.
  3. Byt HeLa odlingsmedia (Dulbecco ändrade Eagles medium, 10% FBS, penicillin / streptomycin) i varje brunn med 1,5 ml av samma media utan antibiotika.
  4. Lägg till DNA / Lipofectamine komplex i varje brunn som ska transfekterade. Blanda försiktigt med gungande och inkubera under 4 timmar i en cellkultur inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
  5. Byt ut antibiotika-fria medier med kultur media med antibiotika. Låt cellerna att uttrycka ratiometrisk pericam i 1-2 dagar innan avbildning.

2. Mikroskop Installation och Image Acquisition

  1. Sätt på ett täckglas med HeLa celler till en lämplig bildteknik kammare med bildbehandling lösning: 107mm NaCl, 7.2mM KCl, 1,2 mm MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11,5 mm glukos, 0,1% bovint serumalbumin, och 20 mm HEPES 7,2. Vårt laboratorium använder Attofluor cellen kammaren från Invitrogen. Montera avbildning kammare i ett inverterat mikroskop skede.
  2. Hitta ett område av intresse innehåller en eller flera celler som uttrycker ratiometrisk pericam med en 40x (eller högre) objektiv oljeimmersion. Vi har funnit att ratiometrisk pericam är mindre resistent mot fotoblekning vid 380 nm, och därför använder vi denna våglängd att identifiera lämpliga celler. För de bilder som förvärvats i figur 1, var en Nikon Superfluor 40X mål med en 1,3 numerisk bländare som används. Högre förstoring mål skulle också vara lämpligt (60-100x). Excitation använda filter var Chroma Teknik filter D380/30x (380 + / - 30 nm) och D495/10 (495 + / - 5 nm) var beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), och utsläpp filtret var HQ535/50m (535 + / - 25nm).
    Vår mikroskop som används för att förvärva bilderna i figur 1 består av en Nikon TE2000 inverterat mikroskop utrustat med en Roper vetenskaplig Coolsnap HQ kyls CCD-kamera, Ludl MAC6000 snabba filter hjul och växlare, och en MetaFluor datainsamling och analysprogram. Detta protokoll kan anpassas till alla standard breda fält mikroskop med lämpliga filter och programvara som kan fånga och bearbeta ratiometrisk bilder.
  3. Ställ in programvaran för dubbla excitation med 495 och 380 nm filter. Kalcium bindning till ratiometrisk pericam ökar absorbansen vid 495 nm, vilket förhållandet bör inrättas för att vara 495 nm/380 nm.
    Ratiometrisk pericam har ett kalcium-fri excitation topp vid 415 nm 4. I detta protokoll vi föreslår att du använder en 380 nm filter bara eftersom det är allmänt förekommande i de flesta laboratorier kalcium avbildning. Om en 410 nm filter är tillgänglig är det att föredra framför 380 nm filter.
  4. Hämta bilder sekventiellt av alternativt spännande på 495 och 380 nm. Förvärva bilder av kalciumnivåer vid baseline i minst 30 sek före applicering av agonist via en perfusion apparat. Markera Dessutom tid för varje agonist. Exponeringstider och intervall förvärv bör optimeras för att förhindra fotoblekning samtidigt tillåta tillräckligt tidsmässiga resolution.For exempel för semi-snabb kalcium dynamik övervakas svar på agonist stimulering, var bilder förvärvades varannan sekund i figurerna 1B och C. Mycket snabbare priser förvärv Det är också möjligt 6. Långsiktiga avbildning efter staurosporine administration förvärvades med längre intervall (30s) mellan förvärv (figur 1 D och E).

3. Bildbehandling och analys

  1. När experimentet är klar kan erhållas bilderna analyseras offline. Definiera områden av intresse (ROI) som du vill att övervaka förändringar i kalcium nivåer. Använd en ROI väljas inom ett tomt område på fältet för att subtrahera bakgrunden om det behövs. Det bör noteras att mitokondrierna är ganska rörliga och dynamiska, och extrapolera händelser i en enda mitokondrier under längre perioder är inte alltid möjligt. Således, med tanke på den höga motilitet av denna organell i vissa celltyper, bör valet av ROI övervakas noggrant. Dessutom, vilket framgår i figur 1, mitokondrier svar ojämnt på olika stimuli. Det är därför viktigt att analysera data offline och övervaka RO1 placering på en bildruta för bildruta basis. En detaljerad beskrivning av mätning av mitokondriell kalcium i mycket rörliga mitokondrierna har beskrivits på annat håll 7.
  2. Framställda förhållandet mätningar från ROI kan importeras till Excel eller liknande graphingsoftware. Data kan presenteras som ett spår som representerar förändringar i mitokondriernas kalcium i en enda cell eller enstaka mitokondrier, eller i genomsnitt fluorescence signaler från flera ROI. Vi har också använt denna teknik för att mäta genomsnittlig mitokondrie kalcium i en population av lymfocyter som genomgår apoptos som induceras av Fas ligand 8.

4. Representativa resultat:

Figur 1
Figur 1. (A) subcellulära lokalisering av ratiometrisk-pericam-mt. Denna första bild visar leva HeLa cell som manifesterar ratiometrisk-pericam-mt. Den andra bilden visar fluorescerande färgning med mitokondrien-selektiva röd färg MitoTracker CMXRos. Den gula fluorescens i den sammanslagna bilden visar co-lokalisering av ratiometrisk-pericam-mt och MitoTracker fluorescens. (B) En serie pseudofärger ratio (495:380 nm) bilder av 4 HeLa celler som uttrycker mt-ratiometrisk pericam behandlades med 10 mM ATP . (C) Kvantifiering av förändringar i mitokondriernas kalciumhalt i regionen av intresse (ROI) som anges i (B) som behandlades med 10 mM ATP. (D) Serie av pseudofärger ratio (495:380 nm) bilder av en HeLa cell som manifesterar mt -ratiometrisk pericam som behandlats med 0,5 mikroM staurosporine. Heterogenitet i kalcium svar i enskilda mitokondrier är uppenbart, liksom betydande fragmentering av mitokondrier med 60 minuter. Vissa mitokondrierna har oscillerande ökningar kalcium (vit pil huvudet), medan andra inte visar signifikanta förändringar i kalcium nivå (gul pil huvudet). (E) Kvantifiering av ökningen av den globala mitokondriell kalcium i en enda HeLa cell efter induktion av apoptos med 0,5 mikroM staurosporine.

Discussion

Här presenterar vi en mycket enkel metod för att mäta mitokondriella kalcium med hjälp av mitokondrie-riktade ratiometrisk pericam. Som framgår av Figur 1A, med vanliga widefield optik utan deconvolution är det möjligt att enkelt visa enskilda mitokondrier i HeLa celler med godtagbar signal-brus-förhållande. Detta beror på HeLa celler, liksom de flesta celler i kultur, platta ut avsevärt när anhängare undanröja behovet av konfokalmikroskopi eller annan specialutrustning. Vi har funnit liknande resultat i Jurkat celler följs poly-lysin belagda täckglas 8. I motsats till metoder med hjälp av färger, är det också möjligt att icke-invasivt övervaka mitokondrie kalciumnivåer i timmar med hjälp av genetiskt kodade kalcium indikatorer såsom ratiometrisk pericam (figur 1E). Detta är särskilt viktigt vid analys av mitokondrie-kalcium under celldöd. Dessutom är det också möjligt att visualisera fission / fragmentering av mitokondrier under apoptotiska processen. Som visas i figur 1D och E orsakar staurosporine behandling en långsam ökning av kalcium i välja delpopulationer av mitokondrier, som toppar på 20 minuter. Kalciumnivåer gå ner igen samtidigt med mitokondrie fragmenteringen innan man går upp igen två timmar efter behandlingen. Detta är förenligt med den långsamma vågor i cytosoliskt kalcium inducerad av staurosporine mäts behandling med Fura-2 9. Därmed kan viktiga kinetiska information erhållas som inte är möjligt med metoder som använder statiska mätningar. Även om vi har presenterat nyckeltal och inte halter kalcium i figur 1 är det möjligt att kalibrera sensorn på plats för att beräkna absoluta kalciumnivåer 4, 10. Ett viktigt förbehåll att tänka på är att ratiometrisk pericam är känslig för pH 4, 10. Eftersom både cytosoliskt och mitokondrie pH-nivån kan förändras dramatiskt under apoptos 11, är detta en viktig faktor. Titrering av pH i isolerade mitokondrier uttrycka pericam visa att öka [H +] ökar utsläppen av pericam när den exciteras vid 495 nm, med liten effekt på utsläppen stimuleras av excitation vid 410 nm, en egendom som har utnyttjats för att samtidigt mäta både mitokondrie kalcium och pH 12. Således selektivt övervakning av utsläpp med 410 nm magnetisering ger en möjlighet till icke-ratiometrically monitor mitokondrie kalcium med minskad oro för pH. Slutligen krävs det protokoll som presenteras här bara tillgång till en standard epifluorescent mikroskop med allmänt tillgängliga filter, vilket gör denna teknik tillgänglig för de flesta laboratorier.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi vill tacka Atsushi Miyawaki för att ge oss den ratiometrisk-pericam-mt uttryck konstruktion. Detta arbete stöddes av bidrag GM081685 från National Institutes of Health (DB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope Nikon Instruments MEA53310 Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.
Imaging Software Molecular Devices Metafluor
Attofluor cell chamber Invitrogen A-7816 Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies
MitoTracker Red CMXRos Invitrogen M7512

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  2. Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
  3. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
  4. Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
  5. Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  6. Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. pl4-pl4 (2002).
  7. Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
  8. Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
  9. Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  10. Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
  11. Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).

Comments

6 Comments

  1. We believe that dynamic nature and signal to noise ratio of rhod² is much more sensitive than any other fluorescent protein indicators specifically aquerins and mito-pericam. Becuase dynamic basal mitochondrial Ca²+ following any mitochondrial protein silencing is completely masked using the above mentioned indicators. For example, upon ATP addition, there was a progressive accumulation of mitochondrial Ca²+ signal over the time but failed to show any efflux rate indicating that these indicators more complicated than rhod².

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2012 - 6:19 PM
  2. The spatio-temporal dynamics of mitochondrial calcium accumulation vary depending upon the stimulus and the cell type. For example, highly dynamic oscillatory calcium levels measured with ratiometric pericam are seen in Jurkat cells treated with Fas ligand (see reference 8 in the article and supplemental video which accompanies the paper). Thus, we do not feel the ratiometric pericam is limited in this respect.

    Reply
    Posted by: Darren B.
    February 27, 2012 - 2:11 PM
  3. I work with particulate matter air pollution at northwestern and would like to test whether exposure can change calcium release from the mitochondria. Is there a way to get the probe from you?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 1, 2012 - 6:45 PM
  4. Please request the plasmid directly from Dr. Miyawaki here: http://cfds.brain.riken.jp/mta.html

    Reply
    Posted by: Darren B.
    March 3, 2012 - 5:16 PM
  5. Could you give more information on the anitboy selection used in the expression vector (ratiometric-pericam-mt) and what was the concentration added to the media (DMEM/FBS) 4 hours post transfection? I am also interetsed to learn how efficient this vector was in HeLa cells (70%)?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Holly H.
    June 21, 2012 - 4:35 PM
  6. Ratiometric pericam is in the pcDNA3.0 backbone, so amp selection in bacteria and G418 in eukaryotic cells. G418 concentration is empirically determined for each cell type. We generally utilize transient expression without selection, and easily achieve 70% transfection in HeLa cells using Lipofectamine²000. The part referenced in the protocol to "antibiotic free" during transfection and replacement after 4 hours is referring to penicillin/streptomycin present in all of our media. Removing pen/strep during transfection decreases toxicity. Hope this helps.

    Reply
    Posted by: Darren B.
    June 25, 2012 - 12:02 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics