Author Produced

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Демонстрация изготовления и использования внеклеточных электродов всасывания используется для измерения электрофизиологических записей новорожденных грызунов спинного мозга

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580, doi:10.3791/2580 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Развитие нейронных схемотехника и передвижения могут быть изучены с помощью новорожденных грызунов спинного мозга центральной картины генератора (CPG) поведение. Мы демонстрируем метод для изготовления электродов всасывания, которые используются для изучения CPG деятельности, или фиктивной локомоции, в расчлененное грызунов спинного мозга. Грызун спинного мозга находятся в искусственной спинномозговой жидкости и вентральных корешков втягиваются в всасывающего электрода. Электрода построен путем изменения имеющихся в продаже всасывания электрода. Тяжелее серебряной проволоки используется вместо стандартной проволоки дается коммерчески доступных электрода. Стеклянным наконечником на коммерческой электрод заменен пластмассовым наконечником для увеличения долговечности. Мы готовим рисованной электроды и электроды из конкретных размеров трубки, что позволяет согласованность и воспроизводимость. Данные собраны при помощи усилителя и программного обеспечения neurogram приобретения. Записи выполняются на стол воздуха внутри клетки Фарадея для предотвращения механических и электрических помех, соответственно.

Protocol

Электрофизиологические записи изолированных спинного мозга может выявить генетические и развития изменений в нервной системы 1. Ранее мы показали метод препарировать новорожденных мышей спинной мозг 2. Здесь мы представляем метод подготовки всасывания полезных электродов в записи фиктивного передвижения в изолированных спинного мозга 3.

Кончик электрода пластиковые трубы может быть обращено на очень тонкой наконечником вручную с помощью низкотемпературной спиртовки 3-5. Пластиковые трубы (PE90, Клей Адамс Intramedic TM) проходит над пламенем, чтобы смягчить трубку в податливый форме. Как трубка начинает таять и становится более прозрачным он удаляется от источника тепла и концы аккуратно вытащил друг от друга. Сроки удаления трубки из пламени важно, чтобы застраховать пластик не свернуть или раскол в то же время выводы. Тонкая часть трубки разрезают бритвой в зависимости от желаемого внутреннего диаметра, как это диктуется возраст образца или сегментарного уровня мозга. Для удобства размещения уплотнительного кольца на трубу, 45 ° надрез на толстый конец трубки с лезвием бритвы. Наконечником и уплотнительные кольца установлены на толстый конец приложите электрод к стволу электрода.

Для того чтобы учесть в частности размера электродов и избежать трудностей, ручной потянув электрода советы, электроды могут быть построены с использованием малых трубки вставляется в толще трубки (PE90). Длины трубы являются специфическими для требований настройки записи и переменной. Мы представляем измерений, используемых в наших экспериментах 1-3,5. 1 см длины PTFE тонкая трубка (Зевс, мелкие детали) и 10 см длиной PE90 трубки разрезают бритвой. Концы небольшие трубки должны быть рассмотрены с целью убедиться, что они не задавить или закрыты. Они могут быть открыты с помощью насекомых контактный (Fine Инструменты наук). Каплю клея (JB Weld) помещается на середину трубки PTFE. Трубки из тефлона и клей втягиваются в PE90 трубки использованием рот всасывание на PE90 труб. 45 ° надрез на толстом конце трубки и наконечника и уплотнительное кольцо соединены, как и предыдущие.

Наконечником и BNC разъема отвинтил от коммерческих электрода всасывания. Разъем BNC замачивают в ксилоле в течение одного часа, чтобы удалить сургучной печати. Разъем затем промыть в воде и сушат.

Нижний угловой левого борта должны быть сделаны на стороне ствола. Металлический стержень нагревается использования горелки Бунзена и прессуют в существующие отверстия на боковой стороне ствола под небольшим углом. 15 см длиной 0,010 дюйма серебряной проволоки (AM Systems) разрезают и вымачивают в отбеливателя в течение пятнадцати минут. Это сделано, чтобы создать серебряное покрытие хлорид, который помогает в проведении сигнала 6. Проволокой промывают водой, сушат, а затем припаяны BNC разъем. BNC-разъемами и серебра вставляются в ствол всасывания электрод с достаточно места для BNC разъем оставаться в стороне от ствола. Всасывающая трубка вставляется в сторону порта 2-3см. Силиконовый герметик вводят в ствол примерно на 2-3см. BNC разъем с резьбой в ствол электрод нажатием герметик вперед.

Кончик электрода теперь вкручивается в передней части электрода. Термоусадочная трубка также может быть добавлен к укреплению линии всасывания со стороны порта.

Электроды крепятся на микроманипуляторами, которые прикреплены к магнитной стоит, и поместил рядом с записью блюдо. BNC коаксиальных кабелей крепятся к headstage, который подключен к усилителю. Усилитель подключен к адаптеру (PolyView), который подключен к аналоговой к цифровой карте (National Instruments) в компьютер с ПО для сбора данных (PolyView).

При записи электрофизиологических данных, необходимо устранить все вмешательства извне. Запись блюдо, усилитель, и глава этапе размещаются на стол воздуха внутри клетки Фарадея для предотвращения электрических и механических помех, соответственно.

Представитель Результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Коммерчески доступных всасывания электрода может быть изменен путем добавления тяжелее проволока серебро и пластмассовым наконечником, который стороны обращено на спиртовке, или построенных с имеющимися в продаже пластиковые трубы конкретных размеров. Кроме того, парафин герметик заменена на более долговечный герметик силиконовый конопатить.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема всасывающего электрода по отношению к таблице воздуха (для механической изоляции), клетка Фарадея (электрически isolatiп.), усилитель и компьютер. Следует отметить, что есть основание ссылки на блюдо записи и второе основание, на которое ссылается на таблицу воздуха и клетки Фарадея.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нервная система развития могут быть изучены с помощью изолированного спинного мозга грызунов. В присутствии медиаторов, фиктивный передвижения могут быть сгенерированы из спинного мозга в виде узорной электрической активности 1,3. Эти ритмичные очередей производятся на 0,2 до 0,5 Гц и по образцу в лево-право и сгибателей-разгибателей чередований. На разных стадиях развития, устойчивости и модели этой деятельности варьируется 1. Генетические мутации могут также нарушать структурирование этой деятельности 3,5,7. Трансгенные исследования и развития этой деятельности дают представление организации центральных шаблон генерации схемы и сообщить изучение развития нервной системы, в целом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Сэмюэл Л. Пфафф является профессором в лаборатории экспрессии генов в Солка института биологических исследований и следователь в Медицинского института Говарда Хьюза. Эта работа была поддержана Кристофера и Даны Рив Foundation. Джо Belcovson, Кент Schnoeker и Майк Салливан в мультимедийных ресурсов в Институте Солка оказана помощь с фотографией и редактирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) Zeus 36AWG 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006”
Large tubing (0.86mm (0.34”)) BD Biosciences 427420 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”)
Electrode Barrel A-M Systems 573000
Adhesive JB Weld
Adhesive: Silicone caulk
Solder and soldering iron
Bleach
Xylene
Silver wire: 0.010” A-M Systems
Insect pins: Austerlitz 0.1mm Fine Science Tools 26002-10
Magnetic Stand Narishige International GJ-8
Micromanipulator Narishige International MN 151
Miniboard (Headstage) Grass Technologies F-15EB/B1
Polyview Adaptor Unit Grass Technologies PVA 8
Bipolar Portable Physiodata Amplifier System Grass Technologies 15LT
ANALOG TO DIGITAL CARD National Instruments 6035E
Air Table; Vibraplane Kinetic Systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
  2. Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. (2010).
  3. Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
  4. Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
  5. Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
  6. Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
  7. Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics