Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

Biology
 

Summary

Neste vídeo podemos demonstrar a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para farbricate um dispositivo micro para os neurônios cultura.

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Jeon, N. L., Cotman, C. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J. Vis. Exp. (7), e261, doi:10.3791/261 (2007).

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Abstract

Neste vídeo, demonstramos a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para fabricar um dispositivo micro para os neurônios cultura. Anteriormente, uma bolacha de silício foi modelado com o projeto para o dispositivo neurônio microfluídicos usando SU-8 e fotolitografia para criar um molde mestre, ou o que nós simplesmente nos referimos como "mestre". Em seguida, despeje o polímero de silicone PDMS em cima do mestre que é então curado pelo aquecimento do PDMS a 80 ° C por 1 hora. O PDMS forma um molde negativo do dispositivo. O PDMS é, então, cuidadosamente cortadas e levantou longe do mestre. Buracos são perfurados em que os reservatórios serão PDMS eo excesso aparadas longe do dispositivo. O nitrogênio é usado para afastar qualquer excesso de detritos a partir do dispositivo. Neste ponto os dispositivos estão prontos para usar e pode tanto ligado a Corning Glass cobrir No. 1 com um plasma esterilizador / limpador ou podem ser reversivelmente ligado à tampa de vidro, basta colocar o dispositivo na parte superior da tampa de vidro. A ligação reversível de que o dispositivo de vidro é coberto por um vídeo em separado e exige, primeiro, que o dispositivo seja esterilizado ou com álcool 70% ou em autoclave. Plasma tratar esteriliza os dispositivos de forma que nenhum tratamento adicional é necessário. É, no entanto, importante, quando plasma-tratamento dos dispositivos, para adicionar líquido para os dispositivos dentro de 10 minutos do tratamento de plasma, enquanto as superfícies são ainda hidrofílico. Esperando mais de 10 minutos para adicionar líquido para o dispositivo torna difícil para o líquido para entrar no dispositivo. Os dispositivos são tipicamente neurônio plasma obrigado a tampa de vidro e 0,5 mg / ml poli-L-lisina (PLL) em tampão borato pH 8,5 é imediatamente adicionado ao dispositivo. Após um mínimo de três horas de incubação com o PLL, os dispositivos são lavados com água dH2O um mínimo de 3 vezes, com pelo menos 15 minutos entre cada lavagem. Em seguida, a água é removida e novas mídias é adicionado ao dispositivo. Neste ponto, o dispositivo está pronto para uso. É importante lembrar, neste ponto, nunca remover toda a mídia do dispositivo. Sempre deixe a mídia no canal principal.

Protocol

Parte 1: Preparando o dispositivo neurônio microfluídicos

  1. A 3 "wafer de silício com um padrão feito de SU-8 por fotolitografia é usado para lançar o Polidimetilsiloxano molde (PDMS) microfluídicos. Referimo-nos à SU-8 padrão wafer de silício como moldes mestre, ou" mestres ".
  2. PDMS é misturado com agente de cura em aw / w proporção de 10:1, ou seja, para 10 gramas de PDMS, 1 grama de agente de cura é adicionado a ele.
  3. O PDMS é então misturado bem e derramou sobre o wafer de silício. O wafer de silício é contido dentro de um prato de poliestireno de 10 centímetros de Petri. Demora cerca de 12 g a 15 g de PDMS para cobrir o mestre com uma espessura de cerca de 4 mm.
  4. O mestre com o PDMS é então colocada em um dessecador a vácuo com a tampa da placa de Petri, e de vácuo é aplicado. Isto é feito para ajudar a remover bolhas de ar do PDMS que foram introduzidas durante a mexer no do agente de cura. Demora cerca de 15 minutos para as bolhas de ar a ser removido.
  5. O mestre com PDMS é removido do dessecador. Uma pistola de ar com um filtro de 0,45 hm é usado para remover as bolhas restantes.
  6. O mestre é então colocado em uma placa de 80 ° C quente por uma hora para a cura.

Nota: Se um dessecador a vácuo não estiver disponível, o mestre pode ser deixado em temperatura ambiente por várias horas. As bolhas de ar eventualmente se dissipar por conta própria. Se um prato quente não está disponível, o PDMS cura à temperatura ambiente após 24 horas.

Nota: Também é importante certificar-se que o mestre é o nível durante o processo de cura.

Parte 2: Cortar o neurônio dispositivo micro

  1. Uma vez que o PDMS é curado no mestre, ele é levado para uma capa limpa.
  2. Usando uma lâmina cirúrgica, um círculo é cortado em todo o perímetro dos dispositivos. Quando alguém insere a lâmina para o PDMS, é importante fazer contato com o wafer de silício, mas para não colocar demasiada pressão sobre a bolacha, senão o mestre crack.
  3. Com um círculo cortado a toda a volta os dispositivos (existem 4 dispositivos por cada 3 Mestre do Silício "), o PDMS é cuidadosamente levantado do mestre. Isto pode ser iniciado por gentilmente torcendo a lâmina cirúrgica, uma vez que é inserido no corte antes .
  4. Em seguida, os reservatórios são perfurados para o dispositivo usando um 8 milímetros de tecido da biópsia do perfurador.
  5. Os dispositivos são, então, esquartejado e PDMS excesso aparado para que o dispositivo vai caber perfeitamente na tampa do Vidro de Corning (No. 1) 24 mm x 40 mm. Nitrogênio do ar é usado para afastar qualquer excesso de detritos. Os restos teimosos também pode ser removido usando 3M Scotch Marca fita de vinil 471.

Parte 3: Plasma ligação a dispositivos para lamínulas de vidro.

  1. Cleaner plasma é usado para colar A Harrick os dispositivos neurônio para o lamínulas. Resumidamente, os dispositivos são colocados no limpador de plasma e uma bomba de vácuo é usada para evacuar o ar da câmara.
  2. Após a pressão de vácuo atingiu 300 milliTorr, o poder está ligado à bobina elétrica e ajustada para alta.
  3. A bobina elétrica cria um plasma ", um gás parcialmente ionizado constituído de elétrons, íons e átomos ou moléculas neutras" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , fora das moléculas de ar remanescente na câmara. O plasma gera espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que quando colocados juntos formam uma ligação permanente. O plasma também torna as superfícies hidrofílicas, o que ajuda a facilitar a adição de líquidos. Além disso, o aspirador de plasma esteriliza os dispositivos.

    A superfície do PDMS dispositivo que contém o dispositivo micro é colocado virado para cima no limpador de plasma, juntamente com as lâminas de vidro.

    Superfícies a plasma tratado do vidro e dispositivo micro são montados em contato uns com os outros em uma bancada limpa e, em seguida colocado em pratos estéril 60 mm. As superfícies tratadas formar uma ligação apertada irreversível.
  4. Dentro de 10 minutos de plasma de ligação a dispositivos de vidro, Poly-L-lisina (PLL) é adicionado para o dispositivo. Após 10 minutos, a hidrofilicidade do dispositivo irá diminuir o que torna difícil para o PLL para entrar no dispositivo.

    Nota: É importante verificar se há bolhas de ar no dispositivo após a adição de PLL. Bolhas de ar no canal principal são indesejáveis, como eles oxidam as células. Um método fácil de remover quaisquer bolhas de ar existentes é a utilização de uma pipeta P200 cheio com 150 ul de líquido (neste caso PLL), coloque a ponta diretamente na abertura do canal principal, e pressione o P200 com força. Este pode ter de ser repetido várias vezes, mas acabou a força da pipeta irá conduzir as bolhas para fora.

  5. Dispositivos que contêm PLL estão autorizados a incubar durante a noite em um padrão de cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
  6. No dia seguinte, o devícios são lavadas duas vezes rapidamente com dH2O autoclavado. Durante este processo, o líquido nunca é totalmente removido os canais principais, apenas a partir dos reservatórios. Remover líquido de os principais canais irá introduzir bolhas. Após 2 lavagens rápidas, os dispositivos são preenchidos com dH2O autoclavados e colocados de volta na incubadora por um período mínimo de 3 horas, ou durante a noite.
  7. No dia seguinte, os dispositivos são novamente lavados duas vezes rapidamente com dH2O autoclavado. Então, media neural basal, contendo os suplementos necessários B27 e Glutamax para os neurônios de cultura primária de ratos, é adicionado aos dispositivos. Os dispositivos são colocados de volta na incubadora para uso futuro. Os dispositivos estão prontos para a semeadura de neurônios.

Discussion

Neste vídeo demonstramos como fazer e preparar um PDMS dispositivo micro que usamos para os neurônios cultura pol O dispositivo permite a obtenção de uma fração pura axonal separados por microgrooves do compartimento contendo uma mistura de corpos celulares, dendritos e axônios . Estes dispositivos permitem ao pesquisador estudar os efeitos de vários tratamentos, bem como fornecer uma plataforma para realizar dano físico no axônios e observar os efeitos que estes tratamentos têm sobre os neurônios. O dispositivo também fornece um nível de cultura a fim de neurônios que ajuda a facilitar os estudos de transportes. Além disso, o microgrooves, que separam o compartimento de cultura de células do compartimento do axônio, permite o isolamento do fluídica entre os dois compartimentos tornando possível tratar uma parte lateral do dispositivo sem afetar o outro lado do dispositivo diretamente com o tratamento. Esta propriedade permite ao pesquisador estudar os efeitos, como transdução de sinal e transporte que resultam do tratamento.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner Tool Harrick Scientific Products, Inc. http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media Reagent Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass cover glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).

Comments

7 Comments

  1. The microfluidic culture platform is very impressive.  Are these devices or the mold commercially available?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 3, 2008 - 11:12 PM
  2. Hello David, The devices will soon be commercially available. Please email xonamicrofluidics@gmail.com for more information

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 4, 2008 - 4:50 PM
  3. If the PDMS can be sterilized using UV light and how to prepare the device before using? thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 9, 2008 - 10:35 PM
  4. Hello Dazhi I am not entirely sure what you are asking.  The PDMS is sterilize prior to bonding with plasma which then plasma bonds the device to glass.  Alternatively, the PDMS device can be rinsed with 70% ethanol, allowed to air dry in a tissue culture hood, then placed on glass and gently pushed down to form a reverisble bond.  We call this non-plasma bonding. If you have any other questions feel free to email me Joseph Harris Manager, Xona Microfluidics LLC xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 10, 2008 - 10:58 AM
  5. Hi Nice demonstration. Can we use the device for in vitro fertilization to perform sperm seperation and embryo culture. Kindly provide your suggestion.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 5, 2009 - 8:57 AM
  6. Dear Muthukumar Karthikeyan The Neruon Device was not intended for use with in vitro fertilization.  Whether it can be used in that manner I am not certain.  Email me at xonamicrofluidics@gmail.com if you would like to discuss this further. JŒ

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 12:58 PM
  7. hello
    I have some question about bonding PDMS on glass with plasma cleaner.
    I use Nitrogen gas in plasma cleaner. Can I bond PDMS on glass with nitrogen gas? or should I use oxygen gas for this process?

    Does PDMS bond on glass immediately after plasma cleaner?
    How long does it takes for having good bonding? for example 10 min or .... and the last question

    What is the time required for baking PDMS in 70 centigrade?

    Best regards

    Reply
    Posted by: mohammad N.
    June 5, 2014 - 7:07 PM

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