Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz bir bütün montaj immünohistokimya tanıtmak ve lazer fare embriyonik ekstremite cilt karmaşık damar ağı oluşumunu analiz etmek için birden fazla etiketleme ile konfokal mikroskopi tarama.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo. J. Vis. Exp. (51), e2620, doi:10.3791/2620 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tüm montaj immünohistokimyasal analiz görüntüleme için tüm damarsal morfolojilerinden dallanma hücresel mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Biz önceden varolan ilkel kapiller pleksus hiyerarşik dallı bir damar ağına yeniden organize olduğu damar gelişimini incelemek için ekstremite deri vaskülatürü modeli geliştirdik. Birden fazla etiketleme ile tüm montaj konfokal mikroskopi belirli floresan belirteçleri kullanarak, endotel hücreleri perisitlerden ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere, sağlam kan damarlarının yanı sıra hücresel bileşenleri, güçlü görüntüleme için izin verir. Genetik çalışmalar ile bu uzuv deri vaskülatürü modeli gelişmeler, vasküler gelişimi ve desenlendirme moleküler mekanizmaları anlamak düzeldi. Ekstremite deri vaskülatürü modeli, periferik sinirleri arterlerin farklılaşma ve desenlendirme için mekansal bir şablon nasıl çalışmak için kullanılır olmuştur. Bu video makalede, vasküler gelişim sürecini takip edebilecek vaskülarize embriyonik organları için geçerli olan vasküler spesifik antikorlar ve floresan ikincil antikorlar, sağlam kan damarları leke için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır.

Protocol

1. Toplama Fare Embriyonik Ekstremite Skin (E13.5 ~ E17.5)

  1. Euthanize Onaylanan prosedür kadın takılı. Onaylı hayvan protokole göre, kadınlarda CO 2 maruz tarafından ötenazi ve sonra servikal dislokasyon ile güvence altına. Emici kağıt havlu üzerine yatırın ve hayvan sıkmak şişeden% 70 EtOH / H 2 O iyice ıslatın.
  2. Rahim sağlam inceleyin ve kan yıkamak için buz Hanks 'Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 100 x 15 mm Petri kabı yerleştirin.
  3. Embriyo ayrı ve teşrih. Embriyo çok ince amniyon çıkarın.
  4. Her embriyo genotip gerekiyorsa (Seçenek) 35 x 10 mm Petri kabında tek bir embriyo parçalara ayır. Disseke kuyruk genotipleme için 0,2 ml PCR tüpü aktarılır.
  5. Embriyonun ön ayakları kesiliyor ve transferi 24 plaka 2 ml Phosphate Buffer Saline (PBS) buz gibi taze% 4 Paraformaldehit (PFA) içeren bir halka forseps ön ayakları.
  6. 4 ° C gecede Nutator Mikser nazik karıştırma ön ayakları sabitleyin.
  7. Ertesi gün, PFA çıkartın ve oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma ile 2 ml PBS 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  8. % 100 metanol (MeOH) ön ayakları transferi ve -20 ° C'de enzim dondurucu (kritik sıcaklık kontrolü ve otomatik buz çözme fonksiyonu olmadan dondurucu) saklayabilirsiniz. İlköğretim antikorlar% 100 MeOH tedaviden sonra Tablo 1 iş listelenmiştir.
  9. Ince cımbız kullanarak ön ayakları kapalı cilt Peel. Ekstremite cilt, kurutulmuş, uzuv kolayca ayrılmalıdır. İlk uzuv yukarı bakacak ventral tarafı (avuç içi tarafında) yerleştirin. Sonra videoda gösterildiği gibi ince cımbız kullanarak, deri kesme. Sonraki herhangi bir zarar vermeden cildi nazikçe sıyrılarak, tüm bacak çevresinde teşrih.

2. Tüm montaj Ekstremite Skins İmmünohistokimyasal Boyama

  1. MeOH / PBT (PBS +% 0.2 Triton X-100) (% 75,% 50,% 25) için her biri 5 dakika aşamalı bir dizi kuluçka 5ml polipropilen yuvarlak alt tüp bacak derileri rehidrate. Çözümler alışverişi ekstremite derileri zarar vermemek için dikkatli olunması gerektiğini unutmayın.
  2. , Oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma PBT 5 dakika için iki kez yıkayın.
  3. Nutator Mikser nazik karıştırma ile 2 saat eşek sekonder antikor için% 10 keçi sekonder antikorlar serum / PBS +0.2% TX100 engelleme tampon Keçi veya% 10 Eşek serum / PBS +0.2% TX100 engelleme tampon ya bacak derileri Blok oda sıcaklığında bekletin.
  4. Engelleme tampon birincil antikor 800μl (Tablolarda listelenen uygun dilüsyon) (2ml mikrosantrifüj tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer bacak deriler% 10 ya da koyun keçi serum / PBS 0,2 % TX100 veya% 10 Eşek serum / PBS +0.2% TX100). 4 ° C gecede Nutator Mikser nazik karıştırma ile bacak derileri inkübe edin. Farklı türleri (örneğin, sıçan monoklonal antikor + tavşan poliklonal antikor) türetilen multipl primer antikorlar aynı anda kullanılabilir olabileceğini unutmayın.
  5. Ertesi gün, yıkama tampon 4ml (ya% 2 Keçi serum / PBS +0.2% TX100 veya 2, yuvarlak alt 5ml polipropilen tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer ekstremite derileri yerde % Eşek serum / PBS +0.2% TX100).
  6. Nazik oda sıcaklığında Nutator Mikser karıştırma ile 15 dakika süreyle beş kez yıkayın.
  7. 800μl engelleme tampon sekonder antikor (ya% 10 Keçi serum / PBS +0.2% TX100 veya% 10 Eşek serum / 2ml-mikrosantrifüj tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer bacak derileri koyun PBS +0.2% TX100). Genelde biz Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilüsyonları) veya Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilüsyon) ikincil antikorlar kullanır. 0.22μm PVDF membran şırınga filtreleri kullanarak sekonder antikor toplu parçacıkları çıkarmak için ikincil antikor çözüm Filtre. Oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma ile 1 saat karanlık veya alüminyum folyo ile sarılmış bacak derileri inkübe edin. Farklı türlerden elde edilen farklı floresan konjuge sekonder antikorlar aynı anda kullanılabilir olabileceğini unutmayın.
  8. Bacak derileri koyun yıkama tampon 4ml (% 2 Keçi serum / PBS 0,2% ya TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS ile 5ml polipropilen yuvarlak alt tüpe bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer 0,2% TX100). Koyu veya yumuşak oda sıcaklığında Nutator Mikser karıştırma alüminyum folyo ile sarılmış 15 dakika süreyle beş kez yıkayın.
  9. (Çekirdeği karşı counterstaining için Seçenek) yıkama tampon 4ml (ya% 2 Keçi serum / PBS 0,2% TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS +0.2% TX100) için-Pro-3 (Invitrogen T3605 ile bacak derileri inkübe , koyu veya oda sıcaklıklarda Nutator Mikser nazik karıştırma ile 10 dakika süreyle alüminyum folyo ile sarılır 1:3000 dilüsyon)yeniden. Daha sonra, nazik karıştırma ile alüminyum folyo ile karanlık veya sarılmış yıkama tampon 4ml (% 2 Keçi serum / PBS TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS +0.2% +0.2% TX100 ya) ile 5 dakika boyunca üç defa yıkamak oda sıcaklığında Nutator Mikser. Çekirdekleri için güçlü ve spesifik boyanması için pro-3 için belirli bir emisyon (HeNe 633 nm eksitasyon) görülmektedir unutmayın.

3. Slayt Ekstremite Skins Montaj

  1. 35 x 10 mm Petri kabında bacak derileri yerleştirin. Beyazlatma kapsamlı fotoğraf çekmemek için düşük aydınlatma stereomicroscope altında ince bir cımbız kullanarak derileri iç tabakası toz, kristaller, elyaf çıkarın.
  2. Bir halka forseps yapışkan mikroskobik slayt bacak derileri aktarın. Slayt (yani lamel doğru) yukarı doğru uzanan iç tabakası ile derileri yerleştirin. Derileri titizlikle cımbız kullanarak Düzleştir'i kaldırmak ve Kimwipe tarafından tampon yıkama-over taşımak.
  3. Hava kabarcıkları olmadan, anti-solmaya montaj medya monte edin. Biz 25 "x25" lamel kullanın. Karanlıkta düz bir yüzey üzerinde Cure (örneğin, örnekleri görüntülemeden önce oda sıcaklığında karanlık bir gece olarak yerleştirilir Altın reaktif uzatmak kullanılarak monte). Uzun süreli depolama için, 4 slayt lamel ve mağaza mühür ° C

4. Konfokal Mikroskop

  1. Fluorophores için uygun lazerler kadar ayarlayın. Biz, Argon 488nm (Alexa Fluor 488 ve GFP), DPSS 561nm (Alexa Fluor 568 ve Cy3) ve HeNe 633nm (Alexa Fluor 633, Cy5 ve To-Pro-3 için) olmak üzere üç lazer kaynakları ile Leica TCS SP5 konfokal mikroskop .
  2. Tüm boyalar, çift ya da üçlü lekeli örneklerinde aynı zamanda heyecanlı olacağı crosstalk önlemek veya azaltmak için sıralı tarama aracını kullanın. Sıralı tarama modu, sıralı olarak kaydedilir.
  3. Uyarma için floresan boyalar ve lazer hakkında daha fazla genel bilgi Hibbs (2004) tarafından "Biyologlar için Konfokal Mikroskop" kurulmuş olabilir

5. Temsilcisi Sonuçlar

Pan-endotelyal hücre işaretleyici karşı antikorlar E15.5 fare ön ayakları deride Tüm montaj üç-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi PECAM-1 (Şekil 1A-C, D, mavi), nörofilaman işaretleyici 2H3 (Şekil 1A yeşil) ve ekstremite cilt 2H3 + periferik sinirleri ile uyumlu αSMA + arterlerin bir karakteristik dallanma deseni, düz kas hücre belirteci αSMA (Şekil 1A, B kırmızı) ortaya çıkardı. Dallanma kan damarı yanı sıra, bu uzuv deri vaskülatürü modeli lenfatik endotel hücre işaretleyici LYVE-1 (Şekil 1D, E kırmızı) ve Neuropilin2 (NRP2) (Şekil 1D, F yeşil antikorlar kullanılarak lenfatik damar dallanma desenlendirme incelemek için kullanılır. .)

Şekil 1
Şekil 1 (AC) Arterler embriyonik ekstremite cilt periferik sinir ile aynı hizaya getirin. Pan-endotelyal hücre belirteci PECAM-1 (AC, mavi), nörofilaman işaretleyici 2H3 (A, yeşil) ve düz kas hücre işaretleyici αSMA (A ve B, kırmızı karşı antikorlar ile tüm montaj üçlü-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi ) gösterilir. E15.5, 2H3 + periferik sinirlerin (açık ok) αSMA tarafından karşılanmaktadır arterler (ok başları) + düz kas hücreleri ile ilişkilendirir. (DF) embriyonik ekstremite cilt Lenfatik damarsal. Pan-endotelyal hücre belirteci antikorlar PECAM-1 (D, mavi), lenfatik endotel hücre işaretleyici LYVE-1 (D ve E, kırmızı) ve Neuropilin2 (NRP2) (D ve F, yeşil Triple-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi ) gösterilir. LYVE-1 de makrofajlar (açık ok başları) bir alt kümesi ile ifade edilir ise, lenf damarları, LYVE-1 ve NRP2 her iki tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu: 100μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Organlara yeterli oksijen ve besin kaynakları nedeniyle vasküler sistem, embriyogenez sırasında yanı sıra yetişkinler organ bakım ve üreme fonksiyonları için organ gelişimi için çok önemlidir. Uygun damar ağı, önceden mevcut olan kapiller ağ çok dallı ve hiyerarşik yapıları ile yeniden düzenlenmiş olan anjiyogenez karmaşık ve çok adımlı işlemler ile kurulmuştur. Birçok eseri çeşitli moleküller bu süreçlere dahil olduğu gösterilmiş olsa da, organ veya bileşenleri vasküler dallanma endotel farklılaşma ve desenlendirme de dahil olmak üzere vasküler gelişimi adım adım süreci teşvik için sinyaller ne kadar açık değil. Bu soruya cevap için, biz vasküler gelişim sürecini takip edebilecek uygun vaskülarize organları gereklidir. Kazanç fonksiyonu ve fonksiyon kaybı-genetik manipülasyonlar ile ekstremite damar gelişimi deri vaskülatürü modeli yüksek çözünürlüklü analiz sağlar.

Biz burada embriyonik fare ön ayakları diseksiyonu, tüm montaj immünohistokimyasal ve ekstremite cilt anjiyogenez ve lenfanjiyogenezin rutin analiz laboratuvarımızda kullanılan konfokal mikroskopi da dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol açıklar. Protokol erken yanı sıra geç embriyonik ekstremite cilt konfokal mikroskobu ile kolayca görüntülü tekrarlanabilir sonuçlar ve bozulmamış damarsal sağlar. Ayrıca yetişkin kulak cildin damarsal (YM ve K. Perkins, yayınlanmamış) için geçerli. Daha fazla ancak, floresan etiketli kan damarları ile Zebra balığı gibi diğer hayvan modeli, yüksek çözünürlüklü in vivo vaskülatürü zaman atlamalı görüntüleme için yararlıdır, kan damarı büyüme ve yeniden yapılanma dinamiklerinin görüntüleme keşfetmek .

Tüm vasküler belirteçleri ile birden fazla etiketleme ile konfokal mikroskopi görüntü kan ve lenfatik endotel hücreleri için bize izin ve derileri düz kas hücreleri ve perisitlerden dahil olmak üzere komşularıyla. Vasküler marker antikorlar (Tablo 2) ek olarak, ilgi endojen genlerin ifade desen özetlemek muhabiri gen ürünleri (β-galaktosidaz, β-gal ve yeşil floresan protein, GFP, Tablo 2) için antikorlar kullanılabilir. Örneğin, biz ephrinB2 veya EphB4 bir histokimyasal göstergesi sağlar ephrinB2 (Wang ve ark, 1998) ya da EphB4 lokus (Gerety ve ark, 1999), hedeflenen lacZ muhabiri taşıyan embriyolar ön ayakları cilt kullandı . EphrinB2, bir transmembran ligand, kendi reseptörü ise arterlerde değil, damarlar, ifade, tirozin kinaz EphB4 tercihen damarlar (Wang ve ark, 1998) ile ifade edilir. E15.5 ephrinB2 lacZ / + veya - EphB4 lacZ / + heterozigot embriyolar ön ayakları derileri Tüm montaj immünohistokimyasal analiz ortaya arter damarları ile tercihen ilgili, periferik duyu sinirleri (Mukouyama ve ark 2002 ). Bu fareler Jackson Laboratory (hisse senedi # 006.039 Ephb4 tm1And / J: stok # 006.044 Efnb2 tm1And / J) mevcuttur.

Bu vasküler sistemlerin farklı aşamalarında çalışma anjiyogenez, vasküler dallanma, arteriyel / venöz farklılaşma, lenfatik damar gelişimi ve gelişmekte olan bacak cilt düz kas / pericyte kapsama dahil olmak üzere hücresel dinamiklerini ortaya koymaktadır. E13.5, ilkel kapiller pleksus ekstremite cilt kuruldu ama duyusal sinirler ve kan damarları arasında herhangi bir ilişki gözlenmedi. E14.5, vasküler yeniden şekillenme oluştu ve arter endotel hücre belirteçleri ifade ve αSMA + düz kas hücreleri (Mukouyama ve ark 2002) yenilenmiş dallı gemileri, ile ilişkili sinir. Genetik çalışmalar, periferik duyusal sinirlerin, kan damarı dallanma desen ve arteriyel farklılaşma belirlemek için bir şablon (Mukouyama ve ark 2002) sağlamak öneririz . Sinir-VEGF-A koşullu mutantlar analizi, sinir kaynaklı VEGF-A ekstremite cilt vasküler arteriyel farklılaşması için gerekli olduğunu göstermiştir (Mukouyama ve ark 2005) . Bizim sonuçlarımız da, sinir-VEGF-A koşullu mutantlar ek anjiogenik faktör (ler) tutulum gösteren, sinir-damar uyum değer düşüklüğü sergilediklerini gösterdi . Bu, bacak deri vaskülatürü modeli farklı vasküler dallanma arteriyel farklılaşma ve desenlendirme kontrol mekanizmaları incelemek için izin verdiğini göstermektedir. Ayrıca, venöz ve lenfatik damar dallanma venöz farklılaşma ve desenlendirme kontroller hala cevaplanması gereken kalır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

K. Gill, fare yetiştirme ve bakımı ile ilgili yardım ve laboratuvar yönetimi için teşekkür ederiz. Teknik yardım için Mukoyama laboratuar üyeleri de teşekkür ederiz. Finansman, Sağlık Naitonal Enstitüleri İntramural Araştırma Programı tarafından sağlanmıştır.

Materials

Antibodies

Pan-endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1
PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution
VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution
CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution
Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2

Arterial endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution
Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution

Venous endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution

Lymphatic endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution
LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution
Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution
Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution
Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution
Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution

Smooth muscle cell/pericyte marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6
NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution
SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution

Antibodies forGFP reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution
GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution
GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution

Antibodies for LacZ reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution
β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution
β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution

Antibodies for peripheral axon

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution
Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution
Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution

Antibodies for migrating Schwann cells

BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution

(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody

#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.

#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.

#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.

#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.

#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.

#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.

#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.

#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.

#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  3. Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
  4. Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).

Comments

5 Comments

  1. excellent! I learned a lot

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2011 - 5:38 PM
  2. Very detailed and helpful !!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 9:54 AM
  3. it is the first time I saw the image of nerves and vessels so lively. it is a GREAT model to study the dynamic development during mouse embryonic stage even in adult mouse! it is amazing that you found this technic!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 8, 2012 - 11:26 AM
  4. Thanks for the very useful method!
    Have you tried adult mouse skin? What would you recommend to modify if I do whole mount staining of adult mouse skin?
    Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Dong W.
    February 6, 2013 - 10:36 PM
  5. Yes, this method works on adult mouse skin as well. The detailed protocols are descibed in our revision paper submitting to Developmental Dynamics. Thanks!

    Reply
    Posted by: wenling l.
    February 7, 2013 - 2:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics