Undersöka Conformational Dynamics av ​​membranproteiner På plats Med Site riktad Fluorescens märkning

Biology
 

Summary

Vi kommer att beskriva en metod som mäter kinetik av jon transport av membranproteiner tillsammans platsspecifik analys av konformationsändringar använda fluorescens på enskilda celler. Denna teknik kan anpassas till jonkanaler, transportörer och pumpar jon och kan användas för att bestämma avståndet begränsningar mellan protein subenheter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Richards, R., Dempski, R. E. Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling. J. Vis. Exp. (51), e2627, doi:10.3791/2627 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Två elektrod spänning klämma elektrofysiologi (TEVC) är ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismen för jon transport1 för en mängd olika membranproteiner, inklusive jonkanaler 2, jonpumpar 3 och transportörer 4. Den senaste tidens utveckling har kombinerat platsspecifika fluoroforen märkning tillsammans TEVC att samtidigt granska konformationsanalys dynamiken på specifika rester och funktion av dessa proteiner på ytan av enskilda celler.

Vi kommer att beskriva en metod för att studera konformationsändringar dynamik membranproteiner genom att samtidigt övervaka fluorescens och aktuella ändringar med hjälp av spänning-clamp fluorometri. Denna metod kan användas för att undersöka den molekylära rörelsen av membranproteiner plats-specifikt efter cystein byte och site-directed fluoroforen märkning 5,6. Dessutom ger denna metod en metod för att bestämma avståndet begränsningar mellan specifika rester 7,8. Detta uppnås genom att selektivt fästa givare och acceptor fluoroforer till två muterade cystein rester av intresse.

I korthet är dessa experiment utförs följande funktionella uttryck av det önskade proteinet på ytan av Xenopus leavis oocyter. Den stora ytan av dessa äggceller gör lättvindigt funktionella mätningar och en robust fluorescenssignalen 5. Det är också möjligt att snabbt ändra den extracellulära förhållanden såsom pH, ligand eller katjoner / anjoner, som kan ge ytterligare information om mekanismen för membranproteiner 4. Slutligen har den senaste utvecklingen gjort det möjligt även manipulation av välja intern joner efter samtidig uttryck med en andra protein 9.

Vår Protokollet beskrivs i flera delar. Först gick cystein skanning mutagenes genom fluoroforen märkning är avslutade rester ligger i gränssnittet för transmembrana och extracellulära domäner. Efterföljande experiment syftar till att identifiera rester som visar stora förändringar i fluorescensintensitet (<5%) 3 på en conformationaländring av proteinet. För det andra är dessa förändringar i fluoroscensintensitet jämfört med den kinetiska parametrarna för membranprotein för att korrelera konformationsanalys dynamik till funktionen av proteinet 10. Detta möjliggör en noggrann biofysisk analys av molekylär rörelse målprotein. Slutligen kan två rester av holoenzyme märkas med en donator och acceptor fluoroforen för att bestämma avståndet begränsningar med hjälp av metoder donator photodestruction. Det är också möjligt att följa den relativa rörelsen av protein subenheter följande märkning med en donator och acceptor fluoroforen.

Protocol

1. Protein Expression

Klona membranprotein av intresse i en vektor som lämpar sig för Xenopus laevis äggcellen uttryck som pTLN 11 eller pSG01MX 12. Optimerad vektorer innehåller både 5 "och 3" Xenopus laevis β-globin oöversatta regioner 11,12, en unik begränsning webbplats och en RNA-främjare webbplats som finns innan 5 'UTR 11. Dessa komponenter är nödvändiga för optimal uttryck i oocyter, linjärisering av plasmiden innan mRNA-syntes och mRNA-syntes, respektive.

2. Cystein Mutation

  1. En Kyte-Doolittle plot är anställd för att identifiera transmembrana domäner riktade protein med hjälp av proteinets aminosyrasekvens (ProtScale, ExPASy) 13. Uppgifterna visas som hydrofobicitet vs sekvensnummer. Rester som visar positiva värden är mest sannolikt finns i transmembranösa domänen. Använd denna komplott för att bestämma den mest troliga rester ligger i gränssnittet mellan det transmembrana och extracellulära domäner som kommer att vara muterat till cystein. Som att bestämma gränssnittet för transmembrana domänen och extracellulära regionen inte kan förutsägas med fullständig säkerhet med Kyte-Doolittle plot, är det viktigt att undersöka en rad restprodukter som förutsägs vara i gränssnittet. Denna region av proteinet är vald för den förutspådda rörelse fluorophore.During en conformationaländring kommer fluoroforen flytta mellan en hydrofil och en hydrofob miljö eller mellan ett mer vatten härdning och mindre vatten härdning miljö. Alla dessa förutspådde förändringar i miljön kommer att leda till en förändring i fluorescens intensitet.
  2. QuickChange Site-Directed Mutagenes Kit (Stratagene) används för att generera enstaka extracellularly tillgänglig cystein konstruktioner. I korthet, blanda 5 mikroliter 10X reaktion buffert, 2 mikroliter av 5 ng / mikroliter plasmid-DNA, 1,25 mikroliter vardera 100 ng / mikroliter framåt och bakåt grundfärg, 1 ìl dNTP (100 mm) och 39,5 mikroliter för dubbeldestillerat vatten. Slutligen tillsätts 1 ìl PfuTurbo DNA-polymeras (Stratagene). Primers användas i detta steg bör utformas med cystein mutation av ett extracellulärt rester av intresse.
  3. Programmera en värmecykeln med följande specifikationer: 1 cykel vid 95 ° C i 30 sekunder, 12-18 cykler vid 95 ° C i 30 sekunder, 55 ° C under 1 minut och 68 ° C under 1 minut per kb plasmid längd. Den glödgning temperatur (55 ° C) beräknas direkt från smälttemperatur av varje grundfärg. Ett sista steg kan programmeras för att hålla temperaturen vid 4 ° C om reaktionen sker över natten. Antalet cykler beror på mutationen. Använd 12 cykler för punktmutationer, 16 cykler för en enda aminosyra ändrar eller 18 cykler för flera aminosyra infogningar.
  4. Tillsätt 1 ìl DpnI (New England Biolabs) till reaktionsblandningen, blanda genom att pipettera, och centrifugera (6000 rpm) i 1 minut. Inkubera 1 timme vid 37 ° C i vattenbad.
  5. Tina topp 10 elektro-behöriga celler (Invitrogen) på is och inkubera sterila SOC media (20 mg / ml trypton, 5 mg / ml jästextrakt, 1 mg / ml NaCl, 0,4 mg / ml KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 M glukos, ddH2O) vid 37 ° C tills det behövs. Alikvotera 20 mikroliter av celler till 1,5 rör mL centrifugrör och tillsätt 1 mikroliter av smält DNA till cellerna.
  6. Fyll Cell-Porator (Life-teknik) med isvatten, ställ kapacitans till 330 uF, laddning till snabb och motstånd på spänning-Booster till 4 kohm.
  7. Pipettera 20 mikroliter av cellen / DNA-lösning i cell-porator kyvetter. Placera kyvetter i Cell-Porator, stäng locket, anslut nätsladden och vrid till rätt kyvetten. Ställ in strömmen för att ladda och hålla "upp" tills spänningen läser 430. Vrid ratten för att armen och trycker avtryckaren. Om det finns ett poppande ljud, försöka igen elektroporation.
  8. Pipettera celler från kyvetten och överföra dem till 1,5 mL SOC medier. Inkubera 1,5 timmar vid 37 ° C med skakning.
  9. Överför 30 ìl av SOC / cell lösning på LB / ampicillin agarplattor (10 mg / ml trypton, 5 mg / ml jästextrakt, 10 mg / ml NaCl, 15 mg / ml agar, DDH 2 O och 100 ng / mikroliter ampicillin ). Sprid celler på plattan och inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
  10. Harvest enstaka kolonier från plattorna och inokulera 5 ml kulturer innehåller LB / ampicillin (10 mg / ml trypton, 5 mg / ml jästextrakt, 10 mg / ml NaCl, 100 ng / mikroliter ampicillin DDH 2 O) media. Skaka vid 37 ° C i 16-20 timmar.
  11. Utför en DNA miniprep med Nucleospin Plasmid kit (Macherey-Nagel). Kvalitativt undersöka produkten med agarosgelelektrofores. Quantitiate avkastningen av DNA med en Nanodrop 2000c Spektrofotometer (Thermo Scientific).
  12. Verifiera insättning av mutation av DNA-sekvensering.

  1. För att linjärisera DNA, smälta 3 mikrog av plasmid-DNA i 50 L reaktion volym med 5 mikroliter lämplig buffert och 1 mikroliter restriktionsenzym i 1 timme vid 37,0 ° C.
  2. Använda High-Pure PCR KIT Rening (Roche Applied Science), lägg till 350 mikroliter bindningsbuffert till smälta flaskan och skaka en kort stund. Detta kit används som den innehåller guanidiniumisothiocyanate vilket gör produkten RNA-klass.
  3. Sätt snurr kolumner i samlingen rör och ladda kolonnen med smälta DNA-lösning. Centrifugera vid 18 tusen g under 20 sekunder och kasta genomströmning.
  4. Tillsätt 500 mikroliter tvättbuffert i kolumnen. Centrifugera 20 sekunder vid 18 tusen gram och kasta passera.
  5. Tillsätt 200 mikroliter tvättbuffert i kolumnen. Centrifugera 30 sekunder eller tills kolumnen är torr på 18.000 g.
  6. Placera snurra kolumn i en autoklaveras 1,5 ml centrifugrör och tillsätt 50 mikroliter av DEPC-behandlat vatten till kolumnen. Eluera genom att centrifugera i 30 sekunder vid 18 tusen g.
  7. Koncentrera elueras DNA till cirka 15 mikroliter vilket resulterar i 0,5 mikrogram i 3 mikroliter av lösning.
  8. Välj rätt mMessage mMachine Kit (Ambion) enligt promotorn platsen sekvensen i plasmid-DNA (SP6, T7). Tillsätt 5 mikroliter 1 NTP-cap mix, 3 mikroliter linjäriseras DNA från föregående steg 1 mikroliter transkription buffert, och 1 mikroliter av lämpliga RNA-polymeras. Inkubera 1,5-2 timmar vid 37 ° C.
  9. Tillsätt 12,5 mikroliter av LiCl från satsen, 15 mikroliter DEPC vatten, blanda kort (inte vortex), centrifugera vid 11 tusen gi 10 sekunder, och förvara vid -20 ° C i minst 30 minuter för nederbörd.
  10. Pre-cool centrifug till 4 ° C och centrifugera i minst 15 minuter i full fart efter nederbörd.
  11. Efter centrifugering en brun pellets skall vara synliga på botten av röret. Noggrant och helt ta bort supernatanten och tillsätt 150 mikroliter av 70% RNA klass etanol kyls ned till -20 ° C. Centrifugera vid 4 ° C i 5 minuter vid full hastighet.
  12. Avlägsna supernatanten helt kort torra (1-2 min) i ett Eppendorf Vacufuge Plus och lös upp den nu vita pelleten i 12 mikroliter av DEPC vatten. Quantitiate avkastningen av mRNA med hjälp av en Nanodrop 2000c Spektrofotometer (Thermo Scientific).

4. Äggcellen Borttagning

  1. Detta protokoll har godkänts av WPI är Institutional Animal Care och användning kommittén.
  2. Före operation bör grodan vara fastat i 12 timmar för att förhindra kräkningar under operation.
  3. Gör en lösning av 0,5-3,0 g MS-222 upplöst i vatten. Lägg natriumbikarbonat förrän lösningen har ett pH-värde 7,0-8,0. MS-222 används som bedövningsmedel för grodan under operationen. Det är viktigt att bära nitrilhandskar hela tiden medan du hanterar MS-222 och förbereda lösningen under en kemisk huva
  4. Sänk ned grodan i MS-222 lösning tills grodan har förlorat rätande och tå reflexer nypa. För att kontrollera inga reaktioner, nypa tån på grodan.
  5. Placera grodan på ryggsidan på absorberande sidan av en våt blöja pad. Detta undviker skador på huden på grodan. Håll en blöt nära pappershandduk till grodan hela tiden, eftersom grodan måste hållas fuktig under hela operationen. Om ögonen på grodan är öppna, är det viktigt att fukta dem med koksaltlösning. Om grodan visar tecken på uppvaknande, häll bedövning lösningen på grodan och vänta tills grodan inte svarar. Utför en andra tån nypa innan du fortsätter förfarandet.
  6. Gör en liten coelomic snitt till antingen vänster eller höger om grodans mittlinjen. Snitt bör göras på alternerande sidor med efterföljande operationer.
  7. Ta äggstockarna på utsidan av grodan och ta bort äggstockarna. Undvik att röra vid äggstockarna till grodans hud. Om blödning uppstår genom att trycka med en steril tops tills blödningen stannar.
  8. Sutur snittet med hjälp av en avbruten sutur mönster med 3,0-4,0 Ethicon Vicryl suturmaterial (Johnson & Johnson). När suturering, använda kirurgiska instrument att knyta en knut i taget och undvik att röra huden på grodan. Det är också viktigt att sutur av coelomic och hudlagren separat. Detta stämmer överens med NIH riktlinjer för ägg-och äggcellen avverkning i Xenopus laevis (se: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ).
  9. Efter operationen måste grodan genomgår inte drift under minst 2 månader. Det bör också bestämmas om grodan är frisk nog att genomgå ytterligare operationer. Högst 6 operationer kan utföras på varje groda med 6: e operationen som terminal.

5. Äggcell Defoculation och mRNA Injection

  1. De isolerade äggstockarna loben är uppdelad med en sax i mindre delar. Den klumpar överförs till Ringer-lösning + Ca 2 + med kollagenas (8,6g / L NaCl, 0,3 g / L KCl, och 0,33 g / L CaCl 2).
  2. Skaka försiktigt smälta lösningen för 2 timmar vid 18 ° C. Om de flesta ägg är separerade, tvätta oocyter med Ringer-lösning - Ca 2 + (8,6 g / L NaCl och 0,3 g / L KCl). Inkubera ägg i tio minuter i Ringer lösning - Ca 2 +.
  3. Överföring oocyter till Ringer-lösning + Ca 2 +.
  4. Injicera oocyter med 25 ng av mRNA, i en slutlig volym på 50 nL med Nanoject II Auto-metod i nanoliter Injector (Drummond), med 3,5 "Drummond kapillärrör. OBS: Mängden mRNA varierar beroende på målprotein.
  5. Efter injektion, inkubera ägg 3-7 dagar i Ringer lösning (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mm MOPS, 2 mM CaCl 2, pH 7,4) och 1 mg / ml gentamycin vid 18 ° C i mörker 8.

6. Platsspecifika Fluorescens märkning

  1. Före mätningen, inkubera oocyter för 45 min i buffert (110 mM NaCl, 2,5 mm natriumcitrat och 10 mm MOPS / Tris vid pH 7,4) och 45 min i post-buffert (100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 mM BaCl 2, 5 mm NiCl 2 och 10 mm MOPS / Tris vid pH 7,4) för att öka den intracellulära Na + koncentration 14.
  2. För fluorescens mätningar, inkubera ägg i en post-buffert som innehåller 5 mikroM av önskad fluoroforen [fd. tetramethylrhodamine-6-maleimide (TMRM) eller fluorescein-5-maleimide (FM)] i 5-10 minuter. Efter fluoroforen märkning, tvätta oocyter uttömmande med dye-fri efter buffert 3.

7. Elektrofysiologi

  1. Gör microelectrodes genom att dra borosilikat kapillärer (1B150F-4, World precisionsinstrument) med hjälp av en mikropipett avdragare (modell PC-10, Narishige). Fyll elektroder med 3 M KCl och testa motståndet. Motståndet ska vara mellan 0,5-1,5 Mohm 15.
  2. Utrusta fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Axio Examiner fluorescensmikroskop) med en 535DF50 excitation filter, en 565 EFLP utsläpp filter och en 570DRLP dikroiska spegel (Omega optisk) för cystein skanning experiment.
  3. Placera ägget i en RC-10 kammare (Warner Instrument) på fluorescensmikroskop scenen och försiktigt in påhittade elektroder in i äggcellen. Med hjälp av en Turbo Tec-05X förstärkare (NPI Electronics), håll membranpotential på ett konstant värde och mäta ion flux över membranet följande lösning börs eller genom att ändra membranpotential. För samtidiga fluorescensmätningar använder en 100 W källa volframljus att excitera givaren fluoroforen och en PIN-022A fotodiod (Förenade Detector Technologies) att påvisa förändringar i fluorescensintensitet. Både förstärkaren och fotodiod är gränssnitt, via en Digidata 1440A datainsamlingssystem (Axon Instruments), med en dator som använder pCLAMP10 programvara (Axon Instruments) för datainsamling och inspelning.
  4. För cystein skanning, mäta förändringen i fluorescensintensiteten vid stationär ström med spänning steg som styrs av pCLAMP 10 programvara (Molecular Devices). Beroende på membranprotein av intresse är den extracellulära lösningen syftar till att säkerställa stilla ström.
  5. Korrelerar förändringar i fluorescensintensiteten till funktionella mätningar av riktade protein.

8. Anisotropi Mått och Bestämning av avståndet begränsningar.

  1. Anisotropi mätningar bör tas tillsammans med avståndsmätningar 8 för att beräkna omfattningen av κ 2 värden. Anisotropi mäter den relativa rörligheten av fluoroforen på grund av rotation 16. Använda polariserade filter (Linos Photonics Inc.), mäta parallellt med och vinkelrätt ljus som avges av FM eller TMRM efter excitation med polariserat ljus på aminosyra rester av intresse. Mätningarna görs under förhållanden lösning utbyte 8 och konstant membranpotential att bestämma rörligheten i fluoroforer.
  2. Anisotropi ges av r = (I | |-Jag ⊥) / (jag | | + 2I ⊥) där jag | | är den parallella ljus som avges och jag är vinkelrät ljus som avges 16. För att beräkna felet i uppmätta avstånd κ 2 max = 2 / 3 (1 + F e + F ra + 3F: e * F RA) och κ 2 min = 2 / 3 (1 - (F RD + F RA) / 2 ) där F rd = (r D / R o) 0,5 och F ra = (r a / r o) 0,5, r en är anisotropi TMRM, r d anisotropi av FM, och r o är grundläggande anisotropi av varje fluoroforen 8 .
  3. För att mäta avståndet begränsningar, använd en holoenzyme som har två tillgängliga extracellulära cystein residUES. Som oocyter kommer att hållas på en konstant membranpotential och därmed konstant avstånd under mätningarna verkar det inte behöver vara en fluorescens förändring som en funktion av konformationsändringar tillstånd av proteinet. Inkubera ägg i Post buffert innehållande 1 mikroM FM (acceptanten fluoroforen) och 4 mikroM TMRM (donator fluoroforen) i 30 minuter på is i mörker, eller bara en mikroM FM. Detta gör att mätningarna göras för holoenzymes märkta med och utan en acceptor fluoroforen 8. Utrusta mikroskop med en 475DF40 excitation filter, 530DF30 utsläpp filtrera och 505DRLP dikroiskt spegel.
  4. Mät tiden beroende av givare blekning i närvaro och frånvaro av acceptanten fluoroforen. Under den tid under dessa mätningar, bör lösningen flödet vara kontinuerlig. I annat fall kan en värme-inducerad fluorescens öka över tiden observeras. Skillnaden i photodestruction med och utan acceptanten fluoroforen används för att beräkna avståndet mellan två rester. Holoenzymes endast innehåller givaren fluoroforen kommer att uppleva en snabbare photodestruction takt än holoenzymes med en acceptor fluoroforen. Holoyenzymes innehåller både en donator och acceptor fluoroforen kommer att gå långsamt photodestruction priser när i närheten av varandra 8.
  5. Använda Clampex funktionen i pClamp10, resultaten av photodestruction av givare fluoroforen i minst fyra äggcellen inspelningar genomsnitt.
  6. När resultaten har i genomsnitt använder en exponentiell funktion (monoexponentiellt, biexponentiell) för att erhålla en kurva på bästa passform. Den kurva som passar bäst kan användas för att bestämma tidskonstanten för photodestruction av givare fluoroforen med och utan acceptor.
  7. Bestäm effektivare energiöverföring som ges av ekvation E = 1-Γ DA / Γ D 17, där GDA avser tidskonstanten för givaren / acceptanten fluoroforen par och Γ D avser tidskonstanten för endast givaren fluoroforen.
  8. Med hjälp av Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), kan avståndet mellan märkt cystein rester skall fastställas, och E är FRET effektivitet, R avståndet mellan givare och acceptor fluoroforen och R O är 50% verkningsgrad avstånd för givare och acceptor para 17. R o styrs av ekvationen R o = (9.7x10 3D n -4 κ 2) där J är den normaliserade spektral överlappning av givare utsläpp och acceptor absorption Φ D är kvantutbytet av givare utsläpp utan acceptant fluoroforen, n är brytningsindex och κ 2 är inriktningen faktorn för dipol-dipol interaktioner 8.

9. Relativ rörelse av Protein subenheter

  1. Använd dubbla cystein konstruktioner som är märkta med acceptanten och fluoroforer donator. För dessa experiment kommer ändringen i avstånd mellan de två cystein rester mätas. Eftersom detta är fallet bör fluorescensintensiteten följande märkning på varje rester vara oberoende av konformationsändringar tillstånd av proteinet 8. Således kommer någon förändring i fluorescens resonans energi överföring vara resultatet av en ändring av avståndet mellan givaren och fluoroforer acceptor.
  2. Utrusta mikroskop med en 475AF40 excitation filter, 595AF60 utsläpp filter och 505DRLP dikroiskt spegel. För dessa experiment är givaren glada och fluorescens acceptanten fluoroforen mäts. Använd lämplig metod (spänning, ligand, lösning utbyte) för att aktivera membranprotein och samtidigt mäta förändringen i fluorescensintensiteten. En ökning av fluorescensintensiteten indikerar att de två fluoroforer och därmed två rester flyttar närmare varandra. En minskning av fluorescensintensiteten indikerar att de två fluoroforer och därmed två rester flyttar längre ifrån varandra. Slutligen kommer ingen förändring i fluoroscensintensitet visar att två fluoroforer och därmed två restprodukter på samma avstånd på förändringen i konformation av proteinet.

10. Representativa resultat

Märkning extracellulära cystein rester med specifika fluoroforer möjliggör undersökning av flödet av membranproteiner på konformationsändringar. En typisk spänning klämma fluorometri spår visas i figur 1. Förändringen i fluorescensintensitet (lägre spår), som är den rörelse av fluoroforen från en mer hydrofila till flera hydrofoba omgivning eller från ett mer vatten släcka mindre vatten kylning miljö, resultat från en conformationaländring i proteinet vid lösningen utbyte (övre spår).

Denna teknik kan vara omfattandeDED att bestämma avståndet begränsningar mellan två rester. Sådana experimentella resultat visas i figur 2. I närvaro av en acceptor flurophore (röd), sker fotoblekning i en långsammare takt än utan en acceptor fluoroforen (svart). Andelen fotoblekning är direkt relaterad till avståndet mellan två fluoroforer enligt Förster ekvationen 17. Sådana resultat kan korreleras till olika konformationsändringar stater av det protein som kontrolleras av två klämma elektrod spänning experiment utförts i tandem.

Figur 1
Figur 1. Representant inspelning av jontransport och förändringar i fluorescensintensiteten. Top, strömtång mätningar i närvaro av Na + provlösning och K + provlösningen i närvaro av 10 mikrometer och 10 mM ouabain. Botten, förändringar i BLOMNINGSTID intensitet mätt parallellt med strömtång mätningar 3,8,19.

Figur 2
Figur 2. Tidsberoende av fotoblekning. Donator photodestruction mäts i frånvaro (svart) och närvaro av acceptor fluoroforen (röd). Varje spår är genomsnittet av 4 äggcell inspelningar.

Discussion

Den experimentella tillvägagångssätt som vi beskriver kombinerar platsspecifika fluoroforen märkning och två elektroder spänning klämma för att undersöka sambandet mellan struktur och funktion hos membranproteiner. Denna teknik kan användas för att få tidsupplöst information om konformationsändringar dynamik membranproteiner under jontransport. Dessutom kan denna metod anpassas för att arbeta med olika proteiner som jonpumpar, jonkanaler och transportörer.

Förutom att undersöka konformationsanalys dynamiken vid en specifik rester, är det också möjligt att använda fluorescens överföra resonans energi för att bestämma avståndet begränsningar inom en holoenzyme. Fastställandet av avstånden mellan rester samt att mäta den relativa rörelsen mellan subenheter kan hjälpa till att lösa viktiga frågor som rör gating mekanismer.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100W Tungsten Light Source Carl Zeiss, Inc.
1B150F-4 World Precision Instruments, Inc.
3.0-4.0 Ethicon Vicryl Johnson & Johnson
475AF40 excitation filter Omega Optical
505DRLP dichroic mirror Omega Optical
Macherey-Nagel Omega Optical
535DF50 excitation filter Omega Optical
560DRLP dichroic mirror Omega Optical
565ALP emission filter Omega Optical
565EFLP emission filter Omega Optical
570DRLP dichroic mirror Omega Optical
Linos Phtonics Inc. Omega Optical
Axio Examiner Fluorescence Microscope Carl Zeiss, Inc.
Warner Instruments Life Technologies
Digidata 1440A data acquisition system Axon Instruments
Dpn I New England Biolabs
fluorescein-5-maleimide Invitrogen
High-Pure PCR Extraction Kit Roche Group
mMessage mMachine Kit Ambion
MS-222 Sigma-Aldrich
Nucleospin Plasmid Kit Macherey-Nagel
Nanodrop 2000c Sprectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
PC-10 Micropipette Puller Narishige International
pCLAMP 10 Software Axon Instruments
PfuTurbo DNA Polymerase Stratagene, Agilent Technologies
PIN-022A Photodiode United Detector Technologies
Polarized Filters Linos Phtonics Inc.
QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit Stratagene, Agilent Technologies
RC-10 Fluorescence Chamber Warner Instruments
tetramethylrhodamine-6-maleimide Invitrogen
TOP10 Electrocompetent Cells Invitrogen
Turbo Tec-05X amplifier npi electronic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cole, K. S., Moore, J. W. Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic. Biophys. J. 1, 1-14 (1960).
  2. Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
  3. Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme. J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).
  4. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).
  5. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
  6. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating. Science. 271, 213-216 (1996).
  7. Koch, H. P., Larsson, P. H. Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters. J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).
  8. Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the α- and β-Subunits of the Na+/K+-ATPase. J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).
  9. Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry. Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).
  10. Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).
  11. Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).
  12. Mruk, K., Kobertz, W. R. Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes. Biophys. J. 177a, (2009).
  13. Kyte, J., Doolittle, R. F. A method for diplaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).
  14. Rakowski, R. F. Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).
  15. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).
  16. Cha, A., Bezanilla, F. Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel. J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).
  17. Förster, T. Ann Physik. 2, 55-75 (1948).
  18. Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps. Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics