iCLIP - व्यक्तिगत nucleotide संकल्प के साथ transcriptome प्रोटीन शाही सेना सहभागिता के व्यापक मानचित्रण

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

एक प्रतिलेख पर शाही सेना - बंधनकारी प्रोटीन के स्थानिक व्यवस्था के बाद transcriptional विनियमन के एक प्रमुख निर्धारक है. इसलिए, हम व्यक्ति nucleotide संकल्प यूवी crosslinking और immunoprecipitation (iCLIP) है कि एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के सटीक जीनोम चौड़ा मैपिंग की अनुमति देता है विकसित की है.

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Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

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Abstract

Protocol

1. यूवी पार जोड़ने टिशू कल्चर की कोशिकाओं

  1. मीडिया निकालें और 6 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस (तीन प्रयोगों के लिए पर्याप्त) एक 10 सेमी की थाली में विकसित कोशिकाओं को जोड़ने.
  2. बर्फ पर ढक्कन और स्थान निकालें. MJ 150 254 एनएम / 2 सेमी के साथ एक बार चमकाना.
  3. एक सेल चोर के साथ scraping द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट.
  4. 2 मिलीलीटर सेल निलंबन तीन microtubes के प्रत्येक के लिए स्थानांतरण. 4 में 10 सेकंड के लिए शीर्ष गति से स्पिन डिग्री सेल्सियस गोली कोशिकाओं को फिर सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  5. स्नैप - फ्रीज -80 पर सूखी बर्फ और दुकान पर सेल छर्रों डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.

2. मनका तैयारी

  1. प्रोटीन की 100 μl एक Dynabeads (Dynal, 100.02) के एक ताजा microtube करने के लिए प्रति प्रयोग (एक माउस या बकरी एंटीबॉडी के लिए प्रोटीन जी Dynabeads का उपयोग करें). जोड़ें
  2. Lysis बफर (, 100 मिमी NaCl, 1 एनपी 40%, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate, 1 / 100 protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल III, Calbiochem 50 Tris - एचसीएल, पीएच 7.4 मिमी) के साथ 2x मोती धो
  3. 20-10 μg एंटीबॉडी के साथ 100 μl lysis बफर में मोती Resuspend.
  4. कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए ट्यूबों का घुमाएँ.
  5. 900 μl lysis बफर के साथ 3x धो और पिछले धोने में जब तक 4.1 कदम आगे बढ़ने के लिए तैयार छोड़.

3. सेल lysis और आंशिक आरएनए पाचन

  1. 1 मिलीलीटर lysis बफर और 1.5 मिलीलीटर microtubes करने के लिए स्थानांतरण में सेल गोली Resuspend.
  2. RNase मैं (Ambion, AM2295) के एक कमजोर पड़ने 1 / 500 तैयार करें. 10 μl RNase मैं के रूप में अच्छी तरह के रूप में कमजोर पड़ने 2 μl सेल lysate टर्बो DNase जोड़ें (1 / 500 RNase मैं dilutions [कम RNase] पुस्तकालय तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाता है, 1 / 50 dilutions [उच्च RNase] एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं) .
  3. वास्तव में 37 में 3 मिनट ° सी, +११०० rpm पर मिलाते के लिए नमूनों को सेते हैं. तुरंत बर्फ हस्तांतरण.
  4. 4 में स्पिन डिग्री सेल्सियस और 20 मिनट के लिए 22,000 ग्राम lysate स्पष्ट. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा (के बारे में 50 गोली के साथ μl lysate छोड़).

4. Immunoprecipitation

  1. मोती (2.5 कदम से) से धो बफर निकालें, और तब कक्ष lysate (3.4 कदम से) जोड़ें.
  2. 4 में 2 घंटे के लिए नमूने घुमाएँ डिग्री सेल्सियस
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 900 μl उच्च नमक बफर (50 मिमी Tris - एचसीएल, 7.4 पीएच, 1 एम NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% एनपी 40, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate) के साथ 2x मोती धोने.
  4. 900 μl धोने बफर (10 मिमी 2 MgCl; 0.2% बीच - 20 20 Tris - एचसीएल मिमी, पीएच 7.4) के साथ 2x धो

5. शाही सेना 3'ends के Dephosphorylation

  1. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 20 μl PNK मिश्रण में मोती resuspend (15 μl पानी, 4 μl 5x PNK पीएच 6.5 बफर [350mMTris - एचसीएल, 6.5 पीएच, 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2], 0.5 μl PNK एंजाइम, 0.5 μl RNasin [Promega]).
  2. 37 पर 20 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  3. 500 μl धोने बफर जोड़ें और उच्च नमक बफर के साथ 1x धोने.
  4. धोने बफर के साथ 2x धो.

6. Linker 3 'समाप्त होता है आरएनए ligation

  1. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 20 μl ligation के मिश्रण में मोती resuspend (9 μl पानी, 4 μl 4x ligation बफर [40m एम.एम. GCL 2, 40 मिमी dithiothreitol mMTris एचसीएल 200], 1 μl आरएनए ligase [ठोंग]; 0.5 μl RNasin [] Promega, 1.5 μl पूर्व adenylated linker L3 [20 सुक्ष्ममापी], 4 PEG400 μl [81170, सिग्मा]).
  2. 16 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
  3. 500 μl धोने बफर जोड़ें और तब 1 मिलीलीटर उच्च नमक बफर के साथ 2x धोने.
  4. 1 मिलीलीटर धोने बफर के साथ 2x और दूसरा धोने के 1 मिलीलीटर में छोड़ धो लें.

7. शाही सेना के 5 'के अंत लेबलिंग

  1. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गर्म PNK मिश्रण की 8 μl में मोती resuspend (0.4 μl PNK [ठोंग]; 0.8 μl 32 पी γ-एटीपी, 0.8 μl 10x PNK बफर [ठोंग], 6 μl पानी).
  2. 37 पर 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  3. गर्म PNK मिश्रण निकालें और 20 μl 1x Nupage लोड हो रहा है बफर (Invitrogen) में मोती resuspend.
  4. 70 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए पर एक thermomixer पर सेते हैं.
  5. तुरंत एक चुंबक पर जगह खाली मोती वेग और जेल पर सतह पर तैरनेवाला लोड (कदम 8 देखें).

8. एसडीएस पृष्ठ और झिल्ली हस्तांतरण

  1. एक 4-12% NuPAGE बीआईएस Tris निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल (Invitrogen) पर नमूने लोड. 1x MOPS बफर (Invitrogen) चलाने के 0.5 एल का प्रयोग करें. इसके अलावा पूर्व से सना हुआ एक प्रोटीन आकार मार्कर (उदाहरण के लिए पन्ना शासक प्लस, Fermentas, SM1811) के 5 μl लोड.
  2. जेल में 50 मिनट के लिए 180 भागो वी.
  3. जेल सामने निकालें और ठोस अपशिष्ट के रूप में त्यागने (मुक्त रेडियोधर्मी एटीपी शामिल).
  4. जेल से एक nitrocellulose निर्माता के निर्देशों (Invitrogen, हस्तांतरण एक 30 वी में ज) के अनुसार Novex गीला हस्तांतरण तंत्र का उपयोग झिल्ली प्रोटीन शाही सेना परिसरों स्थानांतरण.
  5. हस्तांतरण के बाद, PBS बफर में झिल्ली कुल्ला, तो यह सरन लपेट में लपेट और यह एक फ़ूजी फिल्म के लिए -80 डिग्री सेल्सियस (झिल्ली को एक फ्लोरोसेंट बगल में स्टीकर बाद टी संरेखित जगह पर बेनकाबफिल्म और वह झिल्ली, 30 मिनट, 1 और रात से अधिक के लिए जोखिम प्रदर्शन).

9. शाही सेना अलगाव

  1. एक मुखौटा के रूप में 8.5 कदम से कम RNase autoradiograph का उपयोग कर प्रयोग से प्रोटीन शाही सेना परिसरों पृथक. कई छोटे स्लाइस में झिल्ली के इस टुकड़े काटें और एक 1.5 मिलीलीटर microtube में उन्हें जगह.
  2. झिल्ली टुकड़े करने के लिए और 10 μl proteinase कश्मीर (Roche, 03115828001) 200 μl पीके (10 मिमी EDTA, 50 मिमी NaCl 100 मिमी Tris - एचसीएल 7.4 पीएच) बफर जोड़ें. 37 पर 20 मिनट के लिए 1100 rpm पर मिलाते सेते डिग्री सेल्सियस
  3. PKurea बफर (NaCl, 50 मिमी, 10 मिमी EDTA, 100 मिमी Tris - एचसीएल 7.4 पीएच 7 एम यूरिया) के 200 μl जोड़ें और 37 पर 20 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  4. समाधान लीजिए और यह / एक 2 मिलीलीटर चरण बंद जेल भारी ट्यूब (713-2536, VWR) करने के लिए phenol क्लोरोफॉर्म (Ambion, 9722) शाही सेना के 400 μl के साथ एक साथ जोड़ने के.
  5. 30 से कम 5 मिनट ° C के लिए सेते हैं, 1100 rpm पर मिलाते. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 13,000 rpm पर कताई द्वारा अलग चरणों.
  6. एक नया ट्यूब में जलीय परत स्थानांतरण (विंदुक के साथ जेल छू नहीं सावधान रहना). Μl 0.5 (Ambion, 9510) glycoblue और 40 μl एम 3 सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और मिश्रण जोड़ें. फिर एक मिलीलीटर 100% इथेनॉल जोड़ने, फिर मिश्रण और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म

10. रिवर्स प्रतिलेखन

  1. 15,000 rpm और 4 में 20 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस निकालें सतह पर तैरनेवाला और 0.5 मिलीलीटर 80% इथेनॉल के साथ गोली धोने.
  2. 7.25 μl आरएनए / प्राइमर मिश्रण (; 0.5 μl Rclip प्राइमर [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP मिश्रण [10mm] 6.25 μl पानी) में गोली Resuspend प्रत्येक प्रयोग या नकल के लिए, एक अलग Rclip व्यक्तिगत बारकोड अनुक्रम (14 देखें) से युक्त प्राइमर का उपयोग करें.
  3. 70 में 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने से पहले
  4. 2.75 μl आरटी (0.5 μl 0.1M डीटीटी; 0.25 μl सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस [Invitrogen] 2 μl 5x आरटी बफर) मिश्रण जोड़ें.
  5. 25 में 5 मिनट सेते डिग्री सेल्सियस, 42 में 20 मिनट डिग्री सेल्सियस, 50 में 40 मिनट डिग्री सेल्सियस और 80 पर 5 मिनट पहले 4 से ठंडा डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस
  6. 90 μl बफर ते, 0.5 μl glycoblue और 10 μl सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और मिश्रण जोड़ें. फिर 250 μl 100% इथेनॉल जोड़ने, फिर मिश्रण और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म

11. सीडीएनए की जेल शुद्धि

  1. नीचे स्पिन और नमूने धोने (10.1 देखें) है, तो पानी के 6 μl में छर्रों resuspend.
  2. 6 μl 2x लोड हो रहा है TBE यूरिया बफर (Invitrogen) जोड़ें. हीट नमूने 80 डिग्री सेल्सियस सीधे लोड करने से पहले 3 मिनट के लिए.
  3. एक मिल में बना हुआ 6% जेल TBE यूरिया (Invitrogen) पर नमूने लोड और 180 के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित वी पर 40 मिनट के लिए चला. इसके अलावा बाद काटने (नीचे देखें) के लिए एक कम आणविक भार मार्कर लोड.
  4. 120-200 (उच्च) NT, 85-120 (मध्यम) NT और 70-85 NT के (कम) में तीन बैंड कट. Theupper डाई और प्लास्टिक जेल समर्थन पर निशान का उपयोग करने के लिए (चित्रा 3 देखें) छांटना गाइड. ध्यान दें कि Rclip और क्लिप के अनुक्रम के 52 NT के लिए L3 साथ अनुक्रम खाते प्राइमर.
  5. 400 μl ते जोड़ें और छोटे टुकड़ों में 1 मिलीलीटर सिरिंज सवार का उपयोग जेल टुकड़ा कुचलने. 37 पर 2 घंटे के लिए 1,100 rpm पर मिलाते सेते डिग्री सेल्सियस
  6. जगह दो 1 सेमी गिलास costar SPINX स्तंभ (Corning शामिल, 8161) में पूर्व फिल्टर (वाटमान, 1,823,010). स्तंभ नमूने के तरल भाग स्थानांतरण. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 13,000 rpm पर 1 मिनट के लिए स्पिन.
  7. 0.5 μl glycoblue और 40 μl सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच जोड़ें, तो नमूना मिश्रण. 1 मिलीलीटर 100% इथेनॉल जोड़ें, फिर मिश्रण और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म

12. प्राइमर के सीडीएनए के 5'end के लिए Ligation

  1. और सेते नीचे स्पिन और नमूने धोने (10.1 देखें), तो 8 μl ligation (, 0.8 μl 10x CircLigase बफर द्वितीय, 0.4 μl 50 मिमी 2 MnCl; μl 0.3 Circligase द्वितीय [Epicentre] 6.5 μl पानी) मिश्रण में छर्रों resuspend 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए
  2. 30 μl oligo annealing के मिश्रण जोड़ें (26 μl पानी, 3 μl FastDigest बफर [Fermentas], 1 μl cut_oligo [10 सुक्ष्ममापी]). 95 पर 1 मिनट के लिए सेते ° सी. फिर तापमान हर 20 सेकंड में कमी 1 से डिग्री सेल्सियस 25 जब तक डिग्री सेल्सियस तक पहुँच कर रहे हैं.
  3. 2 μl (फास्ट Fermentas) BamHI और 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जोड़ें
  4. 50 μl ते और 0.5 μl glycoblue और मिश्रण जोड़ें. 10 μl सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच और मिश्रण जोड़ें, तो 250 μl 100% इथेनॉल जोड़ें. रात फिर से और वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर मिक्स

13. पीसीआर प्रवर्धन

  1. नीचे स्पिन और नमूने धोने (10.1 देखें) है, तो 19 μl पानी में गोली resuspend.
  2. पीसीआर मिश्रण तैयार करें (19 μl सीडीएनए, 1 μl प्राइमर मिश्रण P5/P3 solexa, 10 सुक्ष्ममापी, 20 μl Accuprime Supermix एक एंजाइम [Invitrogen]).
  3. निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम चलाएँ: 25-35 चक्र, 68 ° सी 3 मिनट के लिए, 4 [30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड, 65 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 सेकंड के लिए, 68 डिग्री सेल्सियस] 94 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए, डिग्री सेल्सियस हमेशा के लिए.
  4. एक मिल में बना हुआ 6% TBE जेल पर 2 5x TBE लोड हो रहा है बफर और लोड के μl (invit के साथ 8 μl पीसीआर उत्पाद मिक्सrogen). Sybrgreen मैं (Invitrogen) के साथ जेल दाग और एक जेल imager के साथ विश्लेषण.
  5. Rclip प्राइमरों में बारकोड मल्टीप्लेक्स उच्च throughput अनुक्रमण के लिए भेजने से पहले विभिन्न नमूनों के लिए अनुमति देते हैं. अनुक्रमण के लिए लायब्रेरी का 15 μl सबमिट करें और आराम की दुकान.

14. Linker और प्राइमर दृश्यों

पूर्व adenylated 3 'linker डीएनए:

[हम IDT से डीएनए एडाप्टर के आदेश और फिर 20μM की aliquots.]

डीएनए

15. प्रतिनिधि परिणाम:

ICLIP पुस्तकालय का अनुक्रमण करने के लिए, पहले प्रयोग की सफलता दो कदम पर नजर रखी जा सकता है: झिल्ली स्थानांतरण के बाद जटिल प्रोटीन शाही सेना (8.5 कदम) और पीसीआर उत्पादों की जेल छवि (13.4 कदम) के autoradiograph. कम RNase नमूने के autoradiograph में फैलाना रेडियोधर्मिता प्रोटीन (चित्रा 2, 4 नमूना) के आणविक वजन से ऊपर देखा जाना चाहिए. उच्च RNase नमूने लिए, इस रेडियोधर्मिता प्रोटीन की आणविक भार (चित्र 2, 3 नमूना) के लिए करीब ध्यान केंद्रित है. जब कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation में प्रयोग किया जाता है, कोई संकेत (चित्रा 2, 1 नमूनों और 2) पता होना चाहिए. Immunoprecipitation की विशिष्टता के लिए इसके अलावा महत्वपूर्ण नियंत्रण या तो यूवी विकिरण का उपयोग करें या कोशिकाओं है कि 14 ब्याज की प्रोटीन व्यक्त नहीं चूकना.

पीसीआर उत्पादों (13.4 कदम) की जेल छवि एक आकार सीमा है कि 11.4 कदम (चित्र 4, गलियों 06/04) में शुद्ध सीडीएनए अंश (उच्च, मध्यम, या कम) से मेल खाती है दिखाना चाहिए. ध्यान दें कि पीसीआर प्राइमरों P3Solexa और P5Solexa सीडीएनए के आकार के लिए एक अतिरिक्त 76 NT के परिचय. यदि कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation के दौरान प्रयोग किया जाता है, कोई इसी पीसीआर उत्पादों की (चित्रा 4, 1-3 गलियों) पता होना चाहिए. प्राइमर डिमर उत्पाद के बारे में 140 NT के पर प्रदर्शित कर सकते हैं.

उच्च throughput अनुक्रमण और बाद में bioinformatic विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों के लिए 14 देखें.

चित्रा 1
चित्रा 1 iCLIP प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रोटीन शाही सेना परिसरों covalently यूवी विकिरण (चरण 1) का उपयोग vivo में पार से जुड़े. ब्याज की प्रोटीन एक साथ बाध्य शाही सेना (2-5 कदम) के साथ शुद्ध है. रिवर्स प्रतिलेखन के विशिष्ट अनुक्रम भड़काना के लिए अनुमति देते हैं, एक शाही सेना अनुकूलक 3 ligated है शाही सेना के अंत है, जबकि 5 'अंत radioactively (कदम 6 और 7) लेबल है. क्रॉस से जुड़े प्रोटीन शाही सेना परिसरों मुक्त एसडीएस पृष्ठ झिल्ली और हस्तांतरण (कदम 8) का उपयोग शाही सेना से शुद्ध कर रहे हैं. शाही सेना proteinase कश्मीर nucleotide पार से लिंक (कदम 9) में एक शेष पॉलीपेप्टाइड छोड़ने के साथ प्रोटीन को पचाने के द्वारा झिल्ली से बरामद किया है. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) शेष पॉलीपेप्टाइड truncates और दो cleavable एडाप्टर क्षेत्रों और बारकोड अनुक्रम (10 कदम) का परिचय है. साइज चयन circularization से पहले मुक्त आरटी प्राइमर निकालता है. निम्नलिखित linearization पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयुक्त टेम्पलेट्स (11-15 कदम) उत्पन्न करता है. अंत में, उच्च throughput अनुक्रमण पढ़ता है जिसमें बारकोड दृश्यों तुरंत सीडीएनए के अंतिम nucleotide (16 कदम) द्वारा पीछा कर रहे हैं उत्पन्न. इस nucleotide रेखांकित एक पार से जुड़े nucleotide के अपस्ट्रीम स्थिति के बाद से, बाध्यकारी साइट उच्च संकल्प के साथ deduced किया जा सकता है है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Autoradiograph के पार से जुड़े hnRNP सी आरएनए परिसरों denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन और झिल्ली हस्तांतरण का उपयोग कर. hnRNP सी आरएनए परिसरों सेल hnRNP सी के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करने के अर्क से इम्युनो - शुद्ध (α hnRNP सी, 3 नमूने और 4). शाही सेना आंशिक रूप से कम (+) या उच्च का उपयोग कर पचा गया था (+) RNase की एकाग्रता. प्रोटीन के आकार (40 केडीए) से ऊपर की ओर स्थानांतरण परिसर (4 नमूना) मनाया जा सकता है. पाली कम स्पष्ट है जब RNase के उच्च सांद्रता (3 नमूना) इस्तेमाल किया गया. रेडियोधर्मी संकेत गायब हो जाता है जब कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation में इस्तेमाल किया गया था (1 नमूनों और 2) है.

चित्रा 3
चित्रा 3. योजनाबद्ध 6% जेल TBE - यूरिया (Invitrogen) iCLIP सीडीएनए उत्पादों के छांटना मार्गदर्शन करने के लिए. जेल के 180 और जेल में cDNAs रंजक (प्रकाश और गहरे नीले रंग) की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रवास पैटर्न के लिए प्रमुख वी पर 40 मिनट के लिए चलाया जाता है. एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें (लाल रेखा) उच्च (एच), (एम), मध्यम और कम (एल) सीडीएनए भिन्न कटौती. प्लास्टिक जेल कैसेट पर हल्के नीले रंग की डाई के बीच में और तुरंत निशान से ऊपर काटने के द्वारा शुरू करो. मध्यम और कम भिन्न फूट डालो और हल्के नीले रंग की डाई ऊपर 1 सेमी के बारे में उच्च अंश ट्रिम. ऊर्ध्वाधर जेब और डाई द्वारा निर्देशित करने के लिए अलग अलग गलियों (इस उदाहरण में 1-4) में कटौती का उपयोग करें. मार्कर लेन (मीटर) और दाग नियंत्रण imaged किया जा सकता हैकाटने के बाद आकार. टुकड़ा आकार दाईं तरफ संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4 पीसीआर प्रवर्धित iCLIP सीडीएनए जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग पुस्तकालयों का विश्लेषण . शाही सेना रिवर्स लिखित और आकार शुद्ध denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2) का उपयोग झिल्ली (चित्रा 1) से बरामद किया. तीन का आकार भिन्न सीडीएनए (उच्च [एच]: 120-200 NT के, मध्यम [एम]: 85-120 NT और कम [L]: NT के 70-85) बरामद किए गए, circularized, फिर linearized और पीसीआर प्रवर्धित. विभिन्न आकार के वितरण के पीसीआर उत्पादों इनपुट भिन्न के विभिन्न आकारों का एक परिणाम के के रूप में मनाया जा सकता है. चूंकि पीसीआर प्राइमर सीडीएनए 76 NT के परिचय, आकार 196-276 NT के बीच उच्च, 161-196 NT के लिए मध्यम और कम आकार भिन्न के लिए 146-161 NT के के लिए सीमा चाहिए. पीसीआर उत्पादों अनुपस्थित रहे हैं जब कोई एंटीबॉडी immunoprecipitation (03/01 गलियों) के लिए इस्तेमाल किया गया था.

Discussion

चूंकि iCLIP प्रोटोकॉल एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और शुद्धि चरणों की एक विविध रेंज शामिल हैं, यह हमेशा आसान नहीं है एक समस्या है जब एक प्रयोग विफल रहता है की पहचान. आदेश में शाही सेना पार से लिंक साइटों की पहचान की विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए, एक या अधिक नकारात्मक नियंत्रण पूरा प्रयोग और बाद में कम्प्यूटेशनल विश्लेषण भर में बनाए रखा जाना चाहिए. इन नियंत्रणों नमूना नहीं एंटीबॉडी, गैर पार से जुड़े कोशिकाओं, या पीटकर कोशिकाओं या ऊतकों से immunoprecipitation जा सकता है. आदर्श रूप में, इन नियंत्रण प्रयोगों किसी भी प्रोटीन शाही सेना परिसरों नहीं शुद्ध, और इसलिए जेल एसडीएस पृष्ठ पर कोई संकेत है, और पीसीआर प्रवर्धन के बाद कोई detectable उत्पादों देना चाहिए चाहिए. इन नियंत्रण पुस्तकालयों के उच्च throughput अनुक्रमण बहुत कुछ अद्वितीय दृश्यों लौट जाना चाहिए. नॉकडाउन कोशिकाओं एक अनुक्रमण नियंत्रण के रूप में की सिफारिश नहीं कर रहे हैं, क्योंकि परिणामस्वरूप दृश्यों अभी भी एक ही प्रोटीन है, जो छोटी मात्रा में पछाड़ना कोशिकाओं से शुद्ध होता है के पार से लिंक साइटों के लिए अनुरूप.

सावधानियां भी पिछले प्रयोगों से पीसीआर उत्पादों के साथ संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इस समस्या को कम करने के लिए सबसे अच्छा तरीका spatially पूर्व और बाद पीसीआर के चरणों अलग है. आदर्श रूप में, पीसीआर उत्पादों और बाद के सभी चरणों के विश्लेषण एक अलग कमरे में किया जाना चाहिए. इसके अलावा, प्रयोगशाला के प्रत्येक सदस्य buffers और अन्य अभिकर्मकों के अपने स्वयं के सेट का उपयोग करना चाहिए. इस तरह, संदूषण के स्रोतों की पहचान आसान हो सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

लेखकों चर्चा और प्रयोगात्मक सहायता के लिए Ule Luscombe, और Zupan प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों को धन्यवाद. हम उच्च throughput अनुक्रमण के लिए जेम्स Hadfield और Nik मैथ्यू धन्यवाद. हम बाहर बिंदु है कि iCLIP विधि यहाँ वर्णित शेयर मूल क्लिप प्रोटोकॉल के साथ कई कदम, रॉबर्ट Darnell की प्रयोगशाला में कर्क जेन्सेन और JU द्वारा विकसित करना चाहते हैं. इस काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद JU और एक लंबी अवधि के मानव सीमाओं विज्ञान कार्यक्रम जेके करने के लिए फैलोशिप के लिए 206,726 - क्लिप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

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References

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  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Comments

71 Comments

  1. Hi,

    First I would like to say this latest method is really neat. I also like Julian's comment at the end of the video when he said with a big smirk, "You have to perform each of the 64 steps with 100% accuracy". :D That is epic.

    On a more serious note, I am just wondering if anyone can suggest what sort of primer I should use if I want to start by cloning my insert into TOPO vector instead of doing nextGen sequencing. Any help is appreciated.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 3:47 AM
  2. Hi Paul, thanks for your fun comment! TOPO cloning dŒsn²17;t require any specific primer, so you could use the one described in the protocol. Unless you wish to do something specific, such as concatemerization of sequences before inserting them into vector. Feel free to post more questions! Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 11, 2011 - 4:19 PM
  3. For more iCLIP questions and answers, use the following Googledoc: http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 11:28 AM
  4. Hi Jernej,
    Is it possible to use a 3' linker with a phosphorylated 5' end instead of a pre-adenylated 5' end and adding some ATP during the 3' linker ligation step? Thanks. Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 10:13 PM
  5. Yes, just follow the protocol as described in Konig et al, NSMB ²010 (PMID ²0601959). More on Googledoc.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 14, 2011 - 3:48 AM
  6. Hi Jernej,

    Sorry to keep bombarding you with questions. In the supplementary section of your NSMB ²010 paper, shrimp alkaline phosphatase was used to desphosphorylate 3' ends. My understanding is that SAP can only desphosphorylate 5' ends. I am wondering if you had dephosphorylated 3' ends step using PNK before using SAP to dephosphorylate 5' ends.

    Quote from Konig et al, NSMB ²010: "For dephosphorylation of 3²4²; ends, Dynabeads were resuspended in ² µl 10&#²15; Shrimp alkaline phosphatase buffer (Promega), 17.5 µl H²O and 0.1 µl Shrimp alkaline
    phosphatase (Promega) and incubated at 37°C for 10 min with intermittent shaking (10 sec at 700 rpm followed by ²0 sec pause)."

    Thank you again for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 4:04 AM
  7. We did use SAP in the NSMB protocol - it dŒsn't work as well as PNK on the 3' ends. We couldn't use PNK at the time, because PNK carryover into ligation reaction would create problems in the presence of ATP. In jove protocol, ligation reaction lacks ATP, therefore we can use PNK to dephosphorylate the 3' ends.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 6:30 PM
  8. Hi Jernej,

    On 3.² it says add ²ml Turbo DNAse into the 1.5 ml tube. I am wondering if that amount is correct.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 11:45 PM
  9. Hello Paul,
    you are right, it should be two micro liters. Sorry for that, I will try to have it changed,
    Julian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 6:56 AM
  10. Hi Jernej, great protocol! Just a precision, the L3 oligo is a pre-adenylated DNA or RNA oligo? Not clear as the original Clip and iClip uses RNA...

    Thanks a bunch,

    Marco

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 3:58 PM
  11. Hi Marco. It's a DNA oligo. Best, Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 4:02 PM
  12. Hi Jernej,

    I am wondering if the 3²P-ATP batch that you normally use in your lab for step 6.1 always has close to a 100% reported radioactivity. What is the lowest percentage of remaining 3²P that you can usually still get away with? I can still get some decent signal when using 3²P-ATP that has ~50-60% remaining radioactivity but my bands on the films are not as intense as the one that I see in your publications. I am trying to work out the best schedule for ordering some 3²P-ATP and starting my experiments. Thanks again.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 11:32 PM
  13. We don't use ATP if it's more than two weeks old, thus we have >50% radioactivity. But signal intensity also depends on the efficiency of crosslinking and IP,and amount of protein expression in the cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2011 - 4:23 AM
  14. Hi Jernej,
    Thank you for the protocol. What results if I reduce the cell samples to 100-1000 (not 10*6-7 cells) ? Thanks for your reply.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 12:24 AM
  15. That would be challenging. If you have an abundant protein that cross-links well to RNA, then it might be possible. So try running the radioactive protein-RNA complex on the gel - if you good signal after overnight exposure, then it's doable.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 4:52 AM
  16. Hi, Jernej !
    Thank you for the reply. I have another questions: How stable if the RNA-RNA and RNA-Protein photocrosslinking? How to degrade these proteins or remove the photocrosslinking? Thank you a lots.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 6:36 AM
  17. Hi Jernej,

    I again have some more questions. Do you still expose the nitrocellulose membrane at -80C when using phosphoimager instead of a film? I'm also wondering what exposure time your lab uses when using a phosphorimager screen.

    Secondly, I am wondering how many libraries containing different barcodes you can run together in a single flow cells.

    Thank you again Jernej. This protocol has been extremely useful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:49 PM
  18. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  19. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  20. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  21. Hi Jernej,

    In regards to one of the FAQs from Google docs.

    - When analysing PCR products, I see a band corresponding to the size of primer dimers, especially in the sample that was cut low from cDNA gel.

    Yes, it is common to see this band in the sample that was cut low from cDNA gel, and sometimes also in other samples. This is due to contamination from short cDNAs that only contain the sequence of RT primer. If this primer dimer is the dominant product on gel, we advise against sequencing the corresponding sample.

    I seem to be getting this short cDNA contamination all the time. Do you have any advice on how I could try to minimise the contamination? Have you ever isolated fragments of correct-size cDNA from a TBE-urea gel and sent only the isolated fragment for sequencing when you have short cDNA contaminations? Do you think that will work? I think that the concentration of L3 linker that I had used might have been too much. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 7:45 PM
  22. There are several possible reasons for this. Maybe one aspect of the protocol is not working, and therefore you are not producing any specific cDNA. If you have no cDNA input, then with enough cycles, you can amplify the primer-primer from any part of the gel. If you are using mammalian cells, try to get the protocol working first with hnRNP C or TIA with Santa cruz antibodies that we used in recent publications. Otherwise, using too much L3 can be a problem.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 23, 2011 - 4:35 AM
  23. Very useful protocol. I have two questions.

    1. For dephosphorylation of RNA 3'ends, pH 6.5 PNK buffer is used, rather than the pH 7.6 buffer, provided by NEB. Have you compared these two conditions internally?
    ². In the protocol, the final PCR product is not isolated and quantitated before submitting for the sequencing. Are there any potential problems of doing these two steps? Can I isolate the PCR product and re-PCR using the same primers to get more product (for Illumina Hiseq)? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 3:40 PM
  24. You can find more related answers in Googledoc http://goo.gl/4tSci, but short answers are also below:

    1. We haven²17;t compared conditions, but increased phophatase activity of PNK at lower pH has been reported in literature, you can read more in the Pubmed ID 1184²1²0.

    ². The PCR product needs to be quantified. We use both qPCR and bioanalyser. Normally, the products of the first PCR should look clean on the gel, otherwise it is a sign of a library that is of low complexity, and is unlikely to generate informative data. Therefore we advise against re-PCR, but it can be done as the last resource.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 4:56 PM
  25. Hi Jernej,

    I noticed you use +/- 10 multiplexed libraries; I was wondering if you knew how many are necessary for a successful run (i.e. to provide sufficient distribution for cluster identification)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:20 PM
  26. The way the primers are designed here, no multiplexing is necessary, because the first three nucleotides in the primer sequence are random (part of randomer = NNN).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:28 PM
  27. I appreciate your experiment. I have some qeustions.

    In this protocol, what dŒs barcode do high-throughout squencing?

    I don't understand function of barcode



    Reply
    Posted by: seung kuk P.
    May 23, 2012 - 6:45 AM
  28. Hi,
    this might be a really naive question but I'm wondering at the UV cross linking step, when you say you irradiate once, dŒ's this mean 1 min?

    Thank you!
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    June 18, 2012 - 1:19 PM
  29. Hello, Thank you for this helpful technique, I just have a question. My experiments protocols are: 1. UV-crosslink RNA-protein; ². Isolate the RNA-protein complex by immunopricitation; 3. Isolate the binding RNA. 3²P-labeling the binding RNA. 4. Analysis the RNA by microarray.
    Because I do not need to sequence the RNA, and I only want to isolate the binding RNA for microarray analysis after UV-crosslink RNA-protein, so I wonder whether I need to do the step 5-7 in your protocols or I could skip from step 4 to step 8 in your protocol?

    Thanks very much, I look forward to your kind reply!

    Sean

    Reply
    Posted by: xiaoyun w.
    July 22, 2012 - 9:09 PM
  30. It is unlikely you will have enough cDNA for microarray hybridisation without some kind of amplification. You can try using steps 4-8, but you could also amplify in other ways.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2012 - 6:03 AM
  31. Hi Jernej,

    Is there any published article on how to analyse iCLIP's high-throughput sequencing data? I have just got my sequencing results back following steps in your protocol. I want to make sure I check with you before digging into the data. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 1, 2012 - 10:15 PM
  32. The article is not yet published, but is in preparation by Tomaz Curk ( http://www.fri.uni-lj.si/en/tomaz-curk/), who made a public server: http://icount.biolab.si/. You can contact Tomaz at tomaz.curk@fri.uni-lj.si for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2012 - 5:47 AM
  33. Hi,
    it is so powerful technique! But I cannot IP any protein follow protocol. Is there any difference in affinity between different antibodies and their antigen? Could you give me some advice? Maybe we could decrease concentration of SDS or sodium deoxycholate?
    Thanks, I look forward to your kind reply!
    Min

    Reply
    Posted by: Min S.
    August 5, 2012 - 11:04 PM
  34. Hi Min, you can find advice on IP googledoc http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 3:35 AM
  35. Hi Jernej,

    With the barcoding system, I am just wondering if the three random nucleotides are there for indexing purpose during Illumina sequencing run but it's not necessary for splitting the different libraries later on. For RC1, the sequencing results will be something like NNNGGTTNN.... During analysis, do you usually trim the 3-bp from the 5'-end of the results and split the different replicates after the trimming step? I have just realised this was slightly different to the barcoding system used in your NSMB paper. -paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 9:41 PM
  36. Hi Paul! You can find the answer under the topic of "Use of random barcode in data analysis" in http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2012 - 7:58 AM
  37. Hi Jernej,

    I started optimising CLIP couple of months ago and I'm at the stage that I'm convinced that I can efficiently cross link RNA to my protein (checked it by specific qRT PCR). I'm lucky because I don't need to fiddle with the IP since I've optimised before and works fine. But just to double check, after IP and western blotting a smear and a lower amount of original kDa protein is a good sing for cross linking yes?
    So my problems started at the RNase A step, I don't see any changes in size/appearance on WB after treatment... I'm convinced that my protein creates a massive complex (couple of 100 kDa) and it is because my target RNA is 10 kb to start with and there are at least 3 proteins binding to it. I'm working with a RNA virus, that's the explanation for it. I think the reason I don't see any change in kDA is because the complex dŒsn't even enter the gel to start up with. Although I used the given buffer which should break any membrane apart but the proteins are still there possibly protecting the RNA. Did you ever come across similar problems and would you have any suggestions? Also, I understand that the RNase trimming is necessary for the efficient RT step but is it a problem if the RNA is too long? What is too long? DŒs this depend on the RT enzyme used I recon or is this also important for the sequencing?

    I would greatly appreciate yur help because I'm stuck...

    Thank you,
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    October 10, 2012 - 7:38 AM
  38. Hi Zsofi,

    For partial RNAse digestion we use RNase I (step 3). We use two different concentrations: a lower one that makes fragments with a mean between 50-100 bp and a higher concentration that fragments RNA to around 10bp. The lower one is used for preparing libraries, the higher one is used for analytical reasons.

    The RNAse step is important to (1) allow the protein RNA complex enter the Gel (²) to narrow down the crosslink site to a fragment with a size compatible with high throughput sequencing (maximum around 300 bp). So you definitely need to optimize this step for your experiments.

    If the complex you are studying is not covalently linked it should fall apart during the denaturing Gel run. Only a small fraction of your complex will have all the proteins of your complex crosslinked to the RNA at the same time since crosslinking is a very inefficient step. Therefore with the higher RNAse concentration you should be able to see a radioactive signal at the size of the protein you are studying.

    I hope that helps, best regards,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    October 11, 2012 - 9:49 AM
  39. Hi Julian,

    I have had some trouble with the RNase step when nuclease-ing the total lysate... In my troubleshooting efforts I read that RNase I is inhibited by 0.1% SDS, which is the concentration used in your lysis buffer. It dŒsn't seem that you guys have any problem though...do you think this is due to using an excess of RNase I or what? Just curiously confused. Thanks,

    sam

    Reply
    Posted by: Sam F.
    February 5, 2013 - 6:00 PM
  40. Hi Sam,

    in our experience the inhibition of RNase I by SDS is not an issue. You just optimize the concentration of RNase I to obtain the desired fragmentation. If you have problems doing that with your buffer conditions, you could also do the RNase digestion on the beads instead of in the lysate.

    Best,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 6, 2013 - 6:19 AM
  41. Thanks for the quick reply Julian. Your recommendation to do the "on bead" digestion is exactly what I have done and it seems to be working fine. Cheers

    Posted by: Sam F.
    February 6, 2013 - 10:12 AM
  42. Hi,

    I was wondering how many minutes have you irradiated the cells in case of HNRNP C?

    Reply
    Posted by: Niaz M.
    November 26, 2012 - 6:29 PM
  43. Hi Niaz,
    we are normally not measuring time of irradiation but the Energy per square centimeter:
    Step 1.²: ... Irradiate once with 150 mJ/cm² at ²54 nm.
    In our Stratalinker this takes 50s. However time of irradiation is not very informative here since it changes with the age or quality of the lamps, etc.
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    November 27, 2012 - 6:20 AM
  44. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  45. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  46. Hi Lisa,

    it is correct that the ends of P3 and P5 primers are the same. This is because of Illumina's primer design for their high throughput sequencing platform. When you look at the 3' end of the Rclip primers (after the Bamhi cleavage site) you can see that they are actually complementary to the 3'end of the L3 adapter.

    Cheers,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    December 18, 2012 - 10:05 AM
  47. I got it !!!
    Thank you :)

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 1:11 PM
  48. Hi
    Thanks for the protocol. I have one question that has been bothering me, though. Both the RNA ligase and PNK buffers will expose the antibody column to relatively high dithiothreitol (DTT) concentrations (10 mM and 5 mM respectively). Why dŒsn't this destroy the column by reducing the disulphide bonds holding the heavy and light antibody chains together? Have you ever tried to improve the immunoprecipitation step by attempting to minimize the DTT concentration as much as possible or is this not an issue. Any assistance would be greatly appreciated. Thanks - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 3, 2013 - 2:13 PM
  49. Hi Greg, we haven't seen an effect of the DTT in the buffers on the IP efficiency, it seems that the concentration is not high enough to reduce the IgG - however, it is worth testing this the first time you do IP, since it is plausible that this will vary dependent on the source of your buffers (company used for PNK and ligase), or antibodies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2013 - 2:45 AM
  50. Hi Jernej,
    Thanks for the reply. The antibody I am using is definitely sensitive to the level of DTT found in the PNK buffer and I need to limit the over-all exposure of the column to DTT as much as possible. As a result, rather than using PNK as the 3' phosphatase, I would like to use an alkaline phosphatase. I noticed that in your ²010 NSMB paper you are using Shrimp Alkaline Phosphatase and in your ²009 Methods paper you use FAST AP. Did you find that the Shrimp phosphatase is significantly better ?

    Thanks again - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 8, 2013 - 3:52 PM
  51. Hi Greg, we don't have any evidence to suggest that one is better than the other for the on-bead reaction. At the time we were using SAP in the lab generally since it can be heat-inactivated, so therefore we also used it for on-bead (even though here you can't heat-inactivate it on beads). So you can go ahead with either one.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:29 AM
  52. I should also add that even though we didn't compare FAST AP and SAP, we did compare SAP with PNK, and we had a lot better results with PNK. It seems that SAP is not efficient as a 3' phosphatase. So it may be better for you to determine the minimal DTT amount in the buffer that is compatible with your antibody, and then continue using it with PNK and ligase. If you use fresh DTT, 1mM is likely to be sufficient both for PNK and RNA ligase.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:39 AM
  53. Thanks, I really appreciate the advice.
    -Greg

    Posted by: Greg C.
    February 9, 2013 - 9:03 AM
  54. Hi, thanks for the awesome video. I have two questions related to the reagents:
    1. What concentration is the PEG400? (it only says 4 ul in the protocol).
    ². Under "Reverse transcription", step 6, what is the pH of the TE buffer you use? Is it pH 8?
    Thank you very much for your help. -QT

    Reply
    Posted by: Qiumin T.
    February 7, 2013 - 1:22 PM
  55. Hi QT,
    (1) we are using PEG400 from Sigma (²0²398). It is a viscous liquid.
    (²) Yes, the it is pH 8
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 7, 2013 - 4:56 PM
  56. Thank you so much Julian. I have another question. Could you recommend a protocol for doing iCLIP with mouse brain tissue? Do you know whether the tissue prep steps from this protocol ( http://ago.rockefeller.edu/Ago_HITS_CLIP_Protocol_June_²009.pdf) will work well for iCLIP as well?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2013 - 5:52 PM
  57. This protocol should be fine. We also recently published a bookchapter about the iCLIP protocol which contains information on tissue samples and lots of other useful info and background:
    http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.100²/97835²764458².ch10/summary

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 14, 2013 - 5:19 AM
  58. The pre-publication version of the book chapter is available here: http://www².mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/jule/publications/Konig_wiley.pdf.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2013 - 1:54 PM
  59. I enjoyed reading about your updated iCLIP protocol in the book Tag-based Next Generation Sequencing from Wiley. I would be grateful for more details about the amount and activity of the 3²-P that you use to radioalabel the RNA. In both the book chapter and the JoVE article I see only volumes, not activities.

    In the figure for step 9, the radiolabel on the 5' end of the RNA is missing, but shouldn't it still be there? At what point in the protocol can we be reasonably sure that we are dealing with unlabeled material?

    Also, have you ever explored non-radioactive approaches to labeling, or is the sensitivity of these methods too low for the purposes of this protocol?

    Thanks!

    John

    Reply
    Posted by: John S.
    June 17, 2013 - 9:23 AM
  60. Dear John,

    with the current protocol most of the radioactivity is gone after the gel purification of the cDNA. You can increase this effect by treating the samples with RNAse after the reverse transcription (The radioactive RNA fragments then running much faster then the cDNAs in the gel). We are currently working on a protocol where we fragment the RNA by alkaline hydrolysis, which will be available soon (We want to avoid using too much RNAse at our desks).

    In addition you should always measure your samples with a Geiger counter. If your final PCRs are still hot, then you should decrease the fraction of beads that go into the labeling reaction.

    Best wishes,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    June 19, 2013 - 11:52 AM
  61. Hi,
    I have a question which relies on your experience with the data generated with CLIP:
    because of the UV irradiation the protein crosslinks to the RNA which even after proteinase K treatment presents an obstruction to the reverse transcriptase which therefore either skips or adds random nucleotide(s). So my question is that how long the deletions/insertions can be? Is it only one nucleotide or can also be 20?

    Thank you very much!!!

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    August 8, 2013 - 12:06 PM
  62. We see that >80% of cDNAs truncate at the crosslink site, and the mutations are quite rare in the remaining sequences. All we know about crosslink-induced mutations has been published here: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22863408.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2013 - 12:15 PM
  63. Thanks for your protocol. I have a question about the IgG background signal in the p32 labeled Western Blot. I used mouse IgG1 isotype as a control. I did not crosslink the IgG to the beads, so IgG1 stays around 50 and 25 KDa region. I do observe some radioactivity band around 50 kDa. Do you notice this in your experiments as well? Since it is close to my protein region, can you give me some suggestions to avoid this?

    Sincerely,
    Mei

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 9, 2013 - 1:42 PM
  64. We don't get a signal in control IP. Most likely this is an RBP that non-specifically binds under your conditions. It is important to wash with high-salt buffer, and rotate the tubes for ±5min during these washes. Also, diluting the lysate before IP may help. Standard IP optimisations, basically.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2013 - 2:24 PM
  65. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:29 AM
  66. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:57 AM
  67. Hi,
    I have 2 more questions. In this protocol you did not remove 5' phosphate of the RNA, can you still label the 5' side with P32 by PNK later? Another question, is it possible to just p32 label the RNA, cut the band, extract, degrade the protein and add 3' linker for RT later?

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:06 PM
  68. Normal PNK has phosphatase activity, so it can replace the 5' phosphate. The original CLIP protocol from Ule et al, Science 2003 added 3' linker after RNA extraction, but as explained in Ule et al, Methods 2005., the efficiency and purity of the protocol increases if linker is ligated on beads.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2013 - 2:15 PM
  69. Thanks for this amazing protocol and your rapid and very helpful exchange here in this site.

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:26 PM
  70. Hello, thank you for this wonderful protocol.
    I have a question:
    -I get positive Radioactive signal at the right size of positive CTRL used in this protocol in the NOT UV samples, it looks exactly as I was using high RNAse condition. why?
    I am phosphorylating the protein? is it possible?
    thank you

    Reply
    Posted by: jessica c.
    February 27, 2016 - 8:45 PM
  71. Hi Jessica, you are right, if you see signal in the non-UV control, this means that the protein is getting phosphorylated in some other way. If it has a kinase domain it may even phosphorylate itself. Or maybe some kinase is getting co-purified? You could check for this by omitting PNK from the phosphorylation reaction.

    Reply
    Posted by: Jernej U.
    March 16, 2016 - 11:07 AM

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