iClip - transcriptome à l'échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

L'arrangement spatial des protéines liant l'ARN sur une transcription est un déterminant clé de la régulation post-transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons développé différents nucléotides réticulation UV résolution et immunoprécipitation (iClip) qui permet précisément l'échelle du génome de cartographie des sites de liaison d'une protéine liant l'ARN.

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Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

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Abstract

La composition unique et la disposition spatiale des protéines liant l'ARN (pratiques commerciales restrictives) sur une transcription guider les divers aspects de la régulation post-transcriptionnelle 1. Par conséquent, une étape essentielle vers la compréhension règlement transcription au niveau moléculaire est d'obtenir des informations de position sur les sites de liaison des pratiques commerciales restrictives 2.

Interactions protéines-ARN peut être étudiée par des méthodes biochimiques, mais ces approches ne tiennent pas compte liaison à l'ARN dans son contexte cellulaire native. Les premières tentatives pour étudier des protéines-ARN complexes dans leur environnement cellulaire employée purification par affinité ou immunoprécipitation combinée avec l'affichage différentiel ou de l'analyse des microréseaux (RIP-CHIP) 3-5. Ces approches ont été enclins à identifier les interactions indirectes ou non physiologiques 6. Afin d'accroître la spécificité et la résolution de position, une stratégie appelée CLIP (UV réticulation et immunoprécipitation) a été introduit 7,8. CLIP combine réticulation UV des protéines et des molécules d'ARN avec des schémas de purification rigoureux, y compris l'électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant. En combinaison avec les technologies de séquençage à haut débit, CLIP a prouvé qu'il était un outil puissant pour étudier les interactions protéines-ARN à l'échelle du génome entier (dénommé HITS-CLIP ou CLIP-seq) 9,10. Récemment, PAR-CLIP a été introduit qui utilise des analogues ribonucléoside photoréactif pour la réticulation 11,12.

Malgré la grande spécificité des données obtenues, des expériences CLIP génèrent souvent des banques d'ADNc de la complexité de séquence limitée. Ceci est partiellement dû à la quantité limitée de co-ARN purifié et les deux inefficaces réactions de ligature ARN nécessaires à la préparation de la bibliothèque. En outre, les analyses d'extension d'amorces ont indiqué que de nombreux ADNc tronquent prématurément à l'réticulé 13 nucléotides. Ces ADNc tronqués sont perdus pendant le protocole de préparation CLIP bibliothèque standard. Nous avons récemment développé iClip (CLIP résolution individuelle de nucléotides), qui capte l'ADNc tronqués en remplaçant l'une des étapes intermoléculaires inefficaces ligature d'ARN avec une circularisation plus efficace ADNc intramoléculaire (figure 1) 14. Surtout, le séquençage des ADNc tronqués fournit un aperçu de la position du site de liaison croisée avec une résolution de nucléotides. Nous appliquée avec succès pour étudier l'organisation iClip hnRNP particules C sur une échelle du génome entier et d'évaluer son rôle dans la régulation 14 d'épissage.

Protocol

1. UV réticulation des cellules de culture tissulaire

  1. Retirez le papier et ajouter 6 ml PBS glacé aux cellules cultivées dans une plaque de 10 cm (pour trois expériences).
  2. Retirer le couvercle et placer sur la glace. Irradier une fois avec 150 mJ / cm 2 à 254 nm.
  3. Récolter les cellules en grattant avec un lifter cellule.
  4. Transfert 2 ml de suspension cellulaire à chacun des trois microtubes. Spin à toute vitesse pendant 10 secondes à 4 ° C pour sédimenter les cellules, puis retirer le surnageant.
  5. Snap-geler les culots cellulaires sur la glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. La préparation de billes

  1. Ajouter 100 ul de la protéine A Dynabeads (Dynal, 100,02) par expérience pour un microtube frais (Utilisez la protéine G Dynabeads pour une souris ou d'anticorps de chèvre).
  2. Lavez perles 2x avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; désoxycholate de sodium à 0,5%; 1 / 100 inhibiteur de protéase cocktail III, Calbiochem).
  3. Remettre les billes dans 100 ul de tampon de lyse avec 2-10 anticorps ug.
  4. Rotation des tubes à température ambiante pendant 30-60 min.
  5. Laver 3x avec 900 ul de tampon de lyse et laisser dans le dernier lavage avant d'être prêt à passer à l'étape 4.1.

3. Lyse cellulaire et digestion partielle ARN

  1. Reprendre le culot cellulaire dans du tampon de lyse 1 ml et transférer à microtubes de 1,5 ml.
  2. Préparer une dilution 1 / 500 de la RNase I (Ambion, AM2295). Ajouter 10 ul RNase I dilution ainsi que 2 pl Turbo DNase au lysat cellulaire (1 / 500 RNase dilutions I [faible RNase] sont utilisées pour la préparation de la bibliothèque; 1 / 50 dilutions [haute RNase] sont nécessaires pour contrôler la spécificité des anticorps) .
  3. Incuber les échantillons pendant exactement 3 minutes à 37 ° C, en agitant à 1100 rpm. Immédiatement transfert à glace.
  4. Centrifuger à 4 ° C et 22 000 g pendant 20 min pour effacer le lysat. Recueillir soigneusement le surnageant (laisser environ 50 ul de lysat avec le culot).

4. Immunoprécipitation

  1. Retirez le tampon de lavage des billes (de l'étape 2.5), puis ajouter le lysat cellulaire (de l'étape 3.4).
  2. Tournez les échantillons pendant 2 h à 4 ° C.
  3. Jeter le surnageant et laver les billes de 2x avec 900 pi de haut-sel tampon (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% de désoxycholate).
  4. Laver 2x avec 900 ul de tampon de lavage (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% de Tween-20).

5. La déphosphorylation des extrémités 3 'ARN

  1. Jeter le surnageant et remettre les billes en 20 PNK mélangez ul (15 ul d'eau; 4 pl pH 6,5 5x PNK buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul enzyme PNK; 0,5 ul RNasine [Promega]).
  2. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 500 ul de tampon de lavage et laver 1x avec forte teneur en sel tampon.
  4. Laver 2x avec un tampon de lavage.

6. Ligature Linker à l'ARN extrémités 3 '

  1. Retirez délicatement le surnageant et remettre les billes en 20 mélange de ligature ul (9 ul d'eau, 4 pi de tampon ligature 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 mM de dithiothréitol]; 1 pl ARN ligase [ONE]; 0,5 RNasine ul [Promega]; 1,5 ul pré-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 pl PEG400 [81170, Sigma]).
  2. Incuber une nuit à 16 ° C.
  3. Ajouter 500 ul de tampon de lavage, puis lavez 2x avec 1 ml de haute sel tampon.
  4. Laver 2x avec 1 ml de tampon de lavage et laisser dans 1 ml de la deuxième lavage.

7. Étiquetage fin ARN 5 '

  1. Retirer le surnageant et remettre les billes en 8 ul du PNK mélange à chaud (0,4 pi PNK [ONE]; 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul de tampon 10x PNK [ONE]; eau 6 pi).
  2. Incuber pendant 5 min à 37 ° C.
  3. Retirer le mélange PNK chaud et remettre en suspension les perles dans 20 tampon 1x chargement ul NuPAGE (Invitrogen).
  4. Incuber sur un thermomixer à 70 ° C pendant 10 min.
  5. Immédiatement placer sur un aimant pour précipiter les perles vide et charger le surnageant sur le gel (voir étape 8).

8. SDS-PAGE et transfert sur membrane

  1. Charger les échantillons sur un NuPAGE 4-12% de Bis-Tris gel (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Utiliser 0,5 L de 1x MOPS courir tampon (Invitrogen). Également charger 5 pi d'un marqueur pré-teint protéine de taille (par exemple la règle PAGE plus, Fermentas, SM1811).
  2. Exécutez le gel pendant 50 min à 180 V.
  3. Retirer le gel de l'avant et jeter les déchets solides (contient gratuitement ATP radioactif).
  4. Transfert des complexes protéines-ARN à partir du gel d'une membrane de nitrocellulose en utilisant l'appareil de transfert Novex humide selon les instructions du fabricant (Invitrogen, transférer 1 h à 30 V).
  5. Après le transfert, rincer la membrane dans du tampon PBS, puis l'envelopper dans du Saran Wrap et de l'exposer à un film Fuji à -80 ° C (placer un autocollant fluorescent à côté de la membrane pour l'aligner tqu'il film et la membrane; effectuer des expositions pendant 30 min, 1h et plus la nuit).

9. Isolement de l'ARN

  1. Isoler les complexes protéines-ARN à partir de l'expérience à faible RNase en utilisant l'autoradiographie de l'étape 8.5 comme un masque. Couper ce morceau de membrane en plusieurs petites tranches et les placer dans un microtube de 1,5 ml.
  2. Ajouter 200 ul de tampon PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM d'EDTA) et 10 pl protéinase K (Roche, 03115828001) pour les morceaux de membrane. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 20 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 200 pl de tampon PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM EDTA, 7 M d'urée) et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
  4. Recueillir la solution et l'ajouter avec 400 pi de phénol / chloroforme (Ambion, 9722) à une phase 2 ml de gel de verrouillage du tube lourd (713 à 2536, VWR) ARN.
  5. Incuber pendant 5 min à 30 ° C, en agitant à 1100 rpm. Séparer les phases en faisant tourner pendant 5 min à 13000 rpm à température ambiante.
  6. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube (attention à ne pas toucher le gel avec la pipette). Ajouter 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) et 40 pi 3 M pH acétate de sodium 5,5 et mélanger. Puis ajoutez 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

10. La transcription inverse

  1. Spin pendant 20 min à 15000 rpm et 4 ° C. Enlever le surnageant et laver le culot avec 0,5 ml d'éthanol à 80%.
  2. Reprendre le culot dans 7,25 ARN ul / mélange d'amorces (6,25 pi d'eau, 0,5 apprêt Rclip ul [0.5pmol/μl]; 0,5 ul de dNTP mix [10 mm]). Pour chaque expérience ou de reproduire, utiliser un apprêt Rclip différents contenant des séquences de codes à barres individuel (voir 14).
  3. Incuber pendant 5 min à 70 ° C avant de refroidir à 25 ° C.
  4. Ajouter 2,75 ul RT mélange (2 ul de tampon 5x RT; 0,5 ul DTT 0,1 M; 0,25 ul Exposant III de la transcriptase inverse [Invitrogen]).
  5. Incuber 5 min à 25 ° C, 20 min à 42 ° C, 40 min à 50 ° C et 5 min à 80 ° C avant de refroidir à 4 ° C.
  6. Ajouter 90 ul de tampon TE, 0,5 glycoblue ul et 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger. Puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

11. Purification sur gel d'ADNc

  1. Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans 6 pl d'eau.
  2. Ajouter 6 ul de tampon de chargement 2x TBE-urée (Invitrogen). Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 3 min avant de le charger directement.
  3. Charger les échantillons sur un préfabriqué 6% TBE-urée gel (Invitrogen) et courir pendant 40 min à 180 V comme décrit par le fabricant. Également charger un marqueur de faible poids moléculaire pour le découpage ultérieur (voir ci-dessous).
  4. Couper trois bandes à 120-200 NT (élevé), de 85 à 120 nt (moyen) et 70 à 85 nt (basse). Utilisez theupper colorant et les marques sur le support de gel de plastique afin de guider l'excision (voir Figure 3). Notez que l'amorce et la séquence Rclip L3 représentent ensemble 52 nt de la séquence de CLIP.
  5. Ajouter 400 ul de TE et écraser la tranche de gel en petits morceaux à l'aide d'un piston de seringue 1 ml. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 2 h à 37 ° C.
  6. Placer deux de 1 cm de verre pré-filtres (Whatman, 1.823.010) dans une colonne Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Transfert de la partie liquide de l'échantillon à la colonne. Spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un tube de 1,5 ml.
  7. Ajouter 0,5 glycoblue ul et 40 ul d'acétate de sodium pH 5,5, puis mélanger l'échantillon. Ajouter 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

12. Ligature d'apprêt à l'extrémité 5 'de l'ADNc

  1. Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans huit mélange de ligature ul (6,5 ul d'eau, 0,8 ul de tampon 10x CircLigase II; 0,4 pi 50 mM MnCl2; 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) et incuber pendant 1 h à 60 ° C.
  2. Ajouter 30 ul mélange d'oligo recuit (26 ul d'eau, 3 tampons FastDigest ul [Fermentas]; 1 pl cut_oligo [10 pM]). Incuber 1 min à 95 ° C. Puis baisser la température toutes les 20 sec de 1 ° C jusqu'à 25 ° C sont atteints.
  3. Ajouter 2 ul BamHI (Fast Fermentas) et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
  4. Ajouter 50 ul de TE et 0,5 glycoblue ul et mélanger. Ajouter 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger, puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%. Mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C.

13. L'amplification par PCR

  1. Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remise en suspension le culot dans 19 ul d'eau.
  2. Préparer le mélange de PCR (19 ul d'ADNc; 1 pl apprêt mélangez P5/P3 Solexa, 10 uM de chacun; 20 Accuprime ul Supermix une enzyme [Invitrogen]).
  3. Exécutez le programme PCR suivant: 94 ° C pendant 2 min, [94 ° C pendant 15 sec, 65 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 30 sec] 25-35 cycles, 68 ° C pendant 3 min, 4 ° C pour toujours.
  4. Mélanger 8 produit ul PCR avec 2 pi de tampon TBE chargement 5x et charge sur un gel de TBE préfabriqué 6% (InvitRogen). Tache le gel avec SybrGreen I (Invitrogen) et d'analyser avec un imageur de gel.
  5. Le code-barres dans les amorces Rclip permettent à des échantillons de différents multiplex avant de soumettre pour le séquençage à haut débit. Soumettez 15 ul de la bibliothèque pour le séquençage et de stocker le reste.

14. Des séquences de liaison et de l'amorce

ADN lieur Pré-adenylated 3 ':

[Nous commandons l'adaptateur d'ADN de IDT et ensuite faire des aliquotes de 20μM.]

L'ADN

15. Les résultats représentatifs:

Avant de séquençage de la bibliothèque iClip, le succès de l'expérience peuvent être surveillés à deux étapes: l'autoradiographie du complexe protéine-ARN, après transfert sur membrane (étape 8.5) et l'image du gel des produits de PCR (étape 13.4). Dans l'autoradiographie des échantillons à faible RNase, la radioactivité diffuse doit être considéré au-dessus du poids moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 4). Pour haute RNase échantillons, cette radioactivité est concentrée près de la masse moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 3). Si aucun anticorps n'est utilisé dans l'immunoprécipitation, aucun signal doit être détecté (figure 2, les échantillons 1 et 2). D'autres commandes importantes pour la spécificité de l'immunoprécipitation omettez d'irradiation UV ou les cellules utilisent qui n'expriment pas la protéine d'intérêt 14.

L'image du gel des produits de PCR (étape 13.4) devrait montrer une gamme de taille qui correspond à la fraction d'ADNc (haute, moyenne ou faible) purifié à l'étape 11.4 (Figure 4, voies 4-6). Notez que les amorces PCR P3Solexa et P5Solexa introduire un supplémentaire 76 nt à la taille de l'ADNc. Si aucun anticorps n'est utilisé pendant l'immunoprécipitation, aucun produit correspondant PCR devrait être détectés (figure 4, pistes 1-3). Produit dimère Primer peut apparaître à environ 140 nt.

Pour obtenir des résultats représentatifs de séquençage à haut débit et des analyses ultérieures bioinformatiques voir 14.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique du protocole de iClip. Protéines-ARN sont des complexes de liaisons croisées covalentes in vivo en utilisant l'irradiation UV (étape 1). La protéine d'intérêt est purifié avec l'ARN lié (étapes 2-5). Afin de permettre une séquence-spécifique d'amorçage de la transcription inverse, un adaptateur ARN est ligaturé à l'extrémité 3 'de l'ARN, tandis que l'extrémité 5' est marquée radioactivement (étapes 6 et 7). Réticulé complexes protéine-ARN sont purifiés à partir d'ARN gratuitement en utilisant SDS-PAGE et transfert sur membrane (étape 8). L'ARN est récupéré à partir de la membrane en digérant les protéines à la protéinase K laissant un polypeptide restant à la réticulation de nucléotides (étape 9). La transcription inverse (RT) tronque le polypeptide restant et introduit deux régions adaptateur clivables et des séquences de codes à barres (étape 10). Sélection taille supprime sans apprêt RT avant circularisation. La linéarisation suivante génère des modèles appropriés pour l'amplification par PCR (étapes 11-15). Enfin, séquençage à haut débit génère lit dans lequel les séquences de codes à barres sont immédiatement suivis par le dernier nucléotide de l'ADNc (étape 16). Depuis ce nucléotide localise une position en amont du nucléotide réticulé, le site de liaison peut être déduite à haute résolution.

Figure 2
Figure 2. Autoradiographie d'réticulé hnRNP C-ARN complexes en utilisant l'électrophorèse sur gel dénaturant et transfert sur ​​membrane. hnRNP C-ARN étaient complexes immuno-purifié à partir d'extraits cellulaires utilisant un anticorps contre hnRNP C (α hnRNP C, les échantillons 3 et 4). L'ARN a été partiellement digéré avec faible (+) ou haute (+ +) concentration de RNase. Complexes déplacer vers le haut de la taille de la protéine (40 kDa) peuvent être observés (échantillon 4). Le décalage est moins prononcée lorsque de fortes concentrations de RNase ont été utilisés (échantillon 3). Le signal radioactif disparaît lorsque aucun anticorps a été utilisé dans l'immunoprécipitation (échantillons 1 et 2).

Figure 3
Figure 3. Schéma 6% TBE-urée gel (Invitrogen) pour guider l'excision des produits iClip ADNc. Le gel est géré pendant 40 min à 180 V conduisant à un modèle de migration reproductible des ADNc et des colorants (la lumière et bleu foncé) dans le gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper (ligne rouge) du haut (H), moyenne (M), et faible (L) des fractions d'ADNc. Commencez par couper au milieu du colorant bleu clair et immédiatement au-dessus de la marque sur la cassette de gel en plastique. Diviser les fractions moyennes et basses et les garnitures de la fraction haute d'environ 1 cm au-dessus du colorant bleu clair. Utilisez des coupes verticales guidé par les poches et le colorant de séparer les différentes voies (dans cet exemple 1-4). La voie de marqueur (m) peut être teinté et imagé pour contrôlertailles après la coupe. Fragment tailles sont indiquées sur la droite.

Figure 4
Figure 4. Analyse des bibliothèques iClip amplifiée par PCR d'ADNc en utilisant l'électrophorèse sur gel. L'ARN récupéré de la membrane (figure 1) était une transcription inverse et la taille purifié par électrophorèse sur gel dénaturant (figure 2). Trois fractions granulométriques de l'ADNc (haute [H]: 120-200 NT, moyenne [M]: 85-120 nt et basse [L]: 70-85 nt) ont été récupérés, circularisé, re-linéarisé et amplifiée par PCR. Les produits de PCR de la distribution de tailles différentes peuvent être observées en raison des différentes tailles des fractions d'entrée. Depuis l'amorce de PCR introduit 76 nt à l'ADNc, tailles devrait se situer entre 196 à 276 nt pour élevée, de 161 à 196 nt pour les moyennes et 146-161 nt pour des fractions de faible taille. Les produits de PCR sont absents lorsque aucun anticorps a été utilisé pour l'immunoprécipitation (pistes 1-3).

Discussion

Depuis le protocole de iClip contient un large éventail de réactions enzymatiques et des étapes de purification, il n'est pas toujours facile d'identifier un problème quand une expérience échoue. Afin de contrôler la spécificité de l'ARN identifiés réticuler des sites, un ou plusieurs contrôles négatifs doivent être maintenues tout au long de l'expérience complète et des analyses ultérieures de calcul. Ces contrôles peuvent être l'échantillon ne-anticorps, les cellules non-réticulés, ou immunoprécipitation à partir de cellules ou de tissus KO. Idéalement, ces expériences de contrôle ne doit pas purifier tout complexes protéines-ARN, et ne devrait donc pas émettre de signal sur le gel SDS-PAGE, et aucun produit détectable après amplification par PCR. Séquençage à haut débit de ces bibliothèques de contrôle devrait revenir très peu de séquences uniques. Knockdown cellules ne sont pas recommandés comme un contrôle séquençage, puisque les séquences résultantes correspondent toujours à liaison croisée des sites de la même protéine, qui est purifiée à partir de cellules knockdown en plus petites quantités.

Des précautions doivent également être prises pour éviter toute contamination avec les produits de PCR à partir d'expériences antérieures. La meilleure façon de minimiser ce problème est de séparer spatialement les étapes pré-et post-PCR. Idéalement, l'analyse des produits de PCR et de toutes les mesures ultérieures doivent être effectuées dans une pièce séparée. Par ailleurs, chaque membre du laboratoire devrait utiliser son propre ensemble de tampons et d'autres réactifs. De cette façon, les sources de contamination peuvent être facilement identifiés.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Les auteurs remercient tous les membres des laboratoires de Ule, Luscombe et Zupan de discussion et d'assistance expérimentale. Nous remercions James Hadfield et Nik Matthews pour séquençage à haut débit. Nous tenons à souligner que la méthode décrite ici iClip part plusieurs étapes avec le protocole clip original, développé par Kirk Jensen et JU dans le laboratoire de Robert Darnell. Ce travail a été soutenu par la subvention européenne du Conseil de recherches 206726-CLIP à JU et une longue durée bourse Human Frontiers Science Program à JK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

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References

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  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Comments

71 Comments

  1. Hi,

    First I would like to say this latest method is really neat. I also like Julian's comment at the end of the video when he said with a big smirk, "You have to perform each of the 64 steps with 100% accuracy". :D That is epic.

    On a more serious note, I am just wondering if anyone can suggest what sort of primer I should use if I want to start by cloning my insert into TOPO vector instead of doing nextGen sequencing. Any help is appreciated.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 3:47 AM
  2. Hi Paul, thanks for your fun comment! TOPO cloning dŒsn²17;t require any specific primer, so you could use the one described in the protocol. Unless you wish to do something specific, such as concatemerization of sequences before inserting them into vector. Feel free to post more questions! Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 11, 2011 - 4:19 PM
  3. For more iCLIP questions and answers, use the following Googledoc: http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 11:28 AM
  4. Hi Jernej,
    Is it possible to use a 3' linker with a phosphorylated 5' end instead of a pre-adenylated 5' end and adding some ATP during the 3' linker ligation step? Thanks. Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 10:13 PM
  5. Yes, just follow the protocol as described in Konig et al, NSMB ²010 (PMID ²0601959). More on Googledoc.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 14, 2011 - 3:48 AM
  6. Hi Jernej,

    Sorry to keep bombarding you with questions. In the supplementary section of your NSMB ²010 paper, shrimp alkaline phosphatase was used to desphosphorylate 3' ends. My understanding is that SAP can only desphosphorylate 5' ends. I am wondering if you had dephosphorylated 3' ends step using PNK before using SAP to dephosphorylate 5' ends.

    Quote from Konig et al, NSMB ²010: "For dephosphorylation of 3²4²; ends, Dynabeads were resuspended in ² µl 10&#²15; Shrimp alkaline phosphatase buffer (Promega), 17.5 µl H²O and 0.1 µl Shrimp alkaline
    phosphatase (Promega) and incubated at 37°C for 10 min with intermittent shaking (10 sec at 700 rpm followed by ²0 sec pause)."

    Thank you again for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 4:04 AM
  7. We did use SAP in the NSMB protocol - it dŒsn't work as well as PNK on the 3' ends. We couldn't use PNK at the time, because PNK carryover into ligation reaction would create problems in the presence of ATP. In jove protocol, ligation reaction lacks ATP, therefore we can use PNK to dephosphorylate the 3' ends.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 6:30 PM
  8. Hi Jernej,

    On 3.² it says add ²ml Turbo DNAse into the 1.5 ml tube. I am wondering if that amount is correct.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 11:45 PM
  9. Hello Paul,
    you are right, it should be two micro liters. Sorry for that, I will try to have it changed,
    Julian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 6:56 AM
  10. Hi Jernej, great protocol! Just a precision, the L3 oligo is a pre-adenylated DNA or RNA oligo? Not clear as the original Clip and iClip uses RNA...

    Thanks a bunch,

    Marco

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 3:58 PM
  11. Hi Marco. It's a DNA oligo. Best, Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 4:02 PM
  12. Hi Jernej,

    I am wondering if the 3²P-ATP batch that you normally use in your lab for step 6.1 always has close to a 100% reported radioactivity. What is the lowest percentage of remaining 3²P that you can usually still get away with? I can still get some decent signal when using 3²P-ATP that has ~50-60% remaining radioactivity but my bands on the films are not as intense as the one that I see in your publications. I am trying to work out the best schedule for ordering some 3²P-ATP and starting my experiments. Thanks again.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 11:32 PM
  13. We don't use ATP if it's more than two weeks old, thus we have >50% radioactivity. But signal intensity also depends on the efficiency of crosslinking and IP,and amount of protein expression in the cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2011 - 4:23 AM
  14. Hi Jernej,
    Thank you for the protocol. What results if I reduce the cell samples to 100-1000 (not 10*6-7 cells) ? Thanks for your reply.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 12:24 AM
  15. That would be challenging. If you have an abundant protein that cross-links well to RNA, then it might be possible. So try running the radioactive protein-RNA complex on the gel - if you good signal after overnight exposure, then it's doable.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 4:52 AM
  16. Hi, Jernej !
    Thank you for the reply. I have another questions: How stable if the RNA-RNA and RNA-Protein photocrosslinking? How to degrade these proteins or remove the photocrosslinking? Thank you a lots.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 6:36 AM
  17. Hi Jernej,

    I again have some more questions. Do you still expose the nitrocellulose membrane at -80C when using phosphoimager instead of a film? I'm also wondering what exposure time your lab uses when using a phosphorimager screen.

    Secondly, I am wondering how many libraries containing different barcodes you can run together in a single flow cells.

    Thank you again Jernej. This protocol has been extremely useful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:49 PM
  18. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  19. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  20. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  21. Hi Jernej,

    In regards to one of the FAQs from Google docs.

    - When analysing PCR products, I see a band corresponding to the size of primer dimers, especially in the sample that was cut low from cDNA gel.

    Yes, it is common to see this band in the sample that was cut low from cDNA gel, and sometimes also in other samples. This is due to contamination from short cDNAs that only contain the sequence of RT primer. If this primer dimer is the dominant product on gel, we advise against sequencing the corresponding sample.

    I seem to be getting this short cDNA contamination all the time. Do you have any advice on how I could try to minimise the contamination? Have you ever isolated fragments of correct-size cDNA from a TBE-urea gel and sent only the isolated fragment for sequencing when you have short cDNA contaminations? Do you think that will work? I think that the concentration of L3 linker that I had used might have been too much. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 7:45 PM
  22. There are several possible reasons for this. Maybe one aspect of the protocol is not working, and therefore you are not producing any specific cDNA. If you have no cDNA input, then with enough cycles, you can amplify the primer-primer from any part of the gel. If you are using mammalian cells, try to get the protocol working first with hnRNP C or TIA with Santa cruz antibodies that we used in recent publications. Otherwise, using too much L3 can be a problem.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 23, 2011 - 4:35 AM
  23. Very useful protocol. I have two questions.

    1. For dephosphorylation of RNA 3'ends, pH 6.5 PNK buffer is used, rather than the pH 7.6 buffer, provided by NEB. Have you compared these two conditions internally?
    ². In the protocol, the final PCR product is not isolated and quantitated before submitting for the sequencing. Are there any potential problems of doing these two steps? Can I isolate the PCR product and re-PCR using the same primers to get more product (for Illumina Hiseq)? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 3:40 PM
  24. You can find more related answers in Googledoc http://goo.gl/4tSci, but short answers are also below:

    1. We haven²17;t compared conditions, but increased phophatase activity of PNK at lower pH has been reported in literature, you can read more in the Pubmed ID 1184²1²0.

    ². The PCR product needs to be quantified. We use both qPCR and bioanalyser. Normally, the products of the first PCR should look clean on the gel, otherwise it is a sign of a library that is of low complexity, and is unlikely to generate informative data. Therefore we advise against re-PCR, but it can be done as the last resource.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 4:56 PM
  25. Hi Jernej,

    I noticed you use +/- 10 multiplexed libraries; I was wondering if you knew how many are necessary for a successful run (i.e. to provide sufficient distribution for cluster identification)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:20 PM
  26. The way the primers are designed here, no multiplexing is necessary, because the first three nucleotides in the primer sequence are random (part of randomer = NNN).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:28 PM
  27. I appreciate your experiment. I have some qeustions.

    In this protocol, what dŒs barcode do high-throughout squencing?

    I don't understand function of barcode



    Reply
    Posted by: seung kuk P.
    May 23, 2012 - 6:45 AM
  28. Hi,
    this might be a really naive question but I'm wondering at the UV cross linking step, when you say you irradiate once, dŒ's this mean 1 min?

    Thank you!
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    June 18, 2012 - 1:19 PM
  29. Hello, Thank you for this helpful technique, I just have a question. My experiments protocols are: 1. UV-crosslink RNA-protein; ². Isolate the RNA-protein complex by immunopricitation; 3. Isolate the binding RNA. 3²P-labeling the binding RNA. 4. Analysis the RNA by microarray.
    Because I do not need to sequence the RNA, and I only want to isolate the binding RNA for microarray analysis after UV-crosslink RNA-protein, so I wonder whether I need to do the step 5-7 in your protocols or I could skip from step 4 to step 8 in your protocol?

    Thanks very much, I look forward to your kind reply!

    Sean

    Reply
    Posted by: xiaoyun w.
    July 22, 2012 - 9:09 PM
  30. It is unlikely you will have enough cDNA for microarray hybridisation without some kind of amplification. You can try using steps 4-8, but you could also amplify in other ways.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2012 - 6:03 AM
  31. Hi Jernej,

    Is there any published article on how to analyse iCLIP's high-throughput sequencing data? I have just got my sequencing results back following steps in your protocol. I want to make sure I check with you before digging into the data. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 1, 2012 - 10:15 PM
  32. The article is not yet published, but is in preparation by Tomaz Curk ( http://www.fri.uni-lj.si/en/tomaz-curk/), who made a public server: http://icount.biolab.si/. You can contact Tomaz at tomaz.curk@fri.uni-lj.si for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2012 - 5:47 AM
  33. Hi,
    it is so powerful technique! But I cannot IP any protein follow protocol. Is there any difference in affinity between different antibodies and their antigen? Could you give me some advice? Maybe we could decrease concentration of SDS or sodium deoxycholate?
    Thanks, I look forward to your kind reply!
    Min

    Reply
    Posted by: Min S.
    August 5, 2012 - 11:04 PM
  34. Hi Min, you can find advice on IP googledoc http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 3:35 AM
  35. Hi Jernej,

    With the barcoding system, I am just wondering if the three random nucleotides are there for indexing purpose during Illumina sequencing run but it's not necessary for splitting the different libraries later on. For RC1, the sequencing results will be something like NNNGGTTNN.... During analysis, do you usually trim the 3-bp from the 5'-end of the results and split the different replicates after the trimming step? I have just realised this was slightly different to the barcoding system used in your NSMB paper. -paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 9:41 PM
  36. Hi Paul! You can find the answer under the topic of "Use of random barcode in data analysis" in http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2012 - 7:58 AM
  37. Hi Jernej,

    I started optimising CLIP couple of months ago and I'm at the stage that I'm convinced that I can efficiently cross link RNA to my protein (checked it by specific qRT PCR). I'm lucky because I don't need to fiddle with the IP since I've optimised before and works fine. But just to double check, after IP and western blotting a smear and a lower amount of original kDa protein is a good sing for cross linking yes?
    So my problems started at the RNase A step, I don't see any changes in size/appearance on WB after treatment... I'm convinced that my protein creates a massive complex (couple of 100 kDa) and it is because my target RNA is 10 kb to start with and there are at least 3 proteins binding to it. I'm working with a RNA virus, that's the explanation for it. I think the reason I don't see any change in kDA is because the complex dŒsn't even enter the gel to start up with. Although I used the given buffer which should break any membrane apart but the proteins are still there possibly protecting the RNA. Did you ever come across similar problems and would you have any suggestions? Also, I understand that the RNase trimming is necessary for the efficient RT step but is it a problem if the RNA is too long? What is too long? DŒs this depend on the RT enzyme used I recon or is this also important for the sequencing?

    I would greatly appreciate yur help because I'm stuck...

    Thank you,
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    October 10, 2012 - 7:38 AM
  38. Hi Zsofi,

    For partial RNAse digestion we use RNase I (step 3). We use two different concentrations: a lower one that makes fragments with a mean between 50-100 bp and a higher concentration that fragments RNA to around 10bp. The lower one is used for preparing libraries, the higher one is used for analytical reasons.

    The RNAse step is important to (1) allow the protein RNA complex enter the Gel (²) to narrow down the crosslink site to a fragment with a size compatible with high throughput sequencing (maximum around 300 bp). So you definitely need to optimize this step for your experiments.

    If the complex you are studying is not covalently linked it should fall apart during the denaturing Gel run. Only a small fraction of your complex will have all the proteins of your complex crosslinked to the RNA at the same time since crosslinking is a very inefficient step. Therefore with the higher RNAse concentration you should be able to see a radioactive signal at the size of the protein you are studying.

    I hope that helps, best regards,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    October 11, 2012 - 9:49 AM
  39. Hi Julian,

    I have had some trouble with the RNase step when nuclease-ing the total lysate... In my troubleshooting efforts I read that RNase I is inhibited by 0.1% SDS, which is the concentration used in your lysis buffer. It dŒsn't seem that you guys have any problem though...do you think this is due to using an excess of RNase I or what? Just curiously confused. Thanks,

    sam

    Reply
    Posted by: Sam F.
    February 5, 2013 - 6:00 PM
  40. Hi Sam,

    in our experience the inhibition of RNase I by SDS is not an issue. You just optimize the concentration of RNase I to obtain the desired fragmentation. If you have problems doing that with your buffer conditions, you could also do the RNase digestion on the beads instead of in the lysate.

    Best,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 6, 2013 - 6:19 AM
  41. Thanks for the quick reply Julian. Your recommendation to do the "on bead" digestion is exactly what I have done and it seems to be working fine. Cheers

    Posted by: Sam F.
    February 6, 2013 - 10:12 AM
  42. Hi,

    I was wondering how many minutes have you irradiated the cells in case of HNRNP C?

    Reply
    Posted by: Niaz M.
    November 26, 2012 - 6:29 PM
  43. Hi Niaz,
    we are normally not measuring time of irradiation but the Energy per square centimeter:
    Step 1.²: ... Irradiate once with 150 mJ/cm² at ²54 nm.
    In our Stratalinker this takes 50s. However time of irradiation is not very informative here since it changes with the age or quality of the lamps, etc.
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    November 27, 2012 - 6:20 AM
  44. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  45. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  46. Hi Lisa,

    it is correct that the ends of P3 and P5 primers are the same. This is because of Illumina's primer design for their high throughput sequencing platform. When you look at the 3' end of the Rclip primers (after the Bamhi cleavage site) you can see that they are actually complementary to the 3'end of the L3 adapter.

    Cheers,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    December 18, 2012 - 10:05 AM
  47. I got it !!!
    Thank you :)

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 1:11 PM
  48. Hi
    Thanks for the protocol. I have one question that has been bothering me, though. Both the RNA ligase and PNK buffers will expose the antibody column to relatively high dithiothreitol (DTT) concentrations (10 mM and 5 mM respectively). Why dŒsn't this destroy the column by reducing the disulphide bonds holding the heavy and light antibody chains together? Have you ever tried to improve the immunoprecipitation step by attempting to minimize the DTT concentration as much as possible or is this not an issue. Any assistance would be greatly appreciated. Thanks - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 3, 2013 - 2:13 PM
  49. Hi Greg, we haven't seen an effect of the DTT in the buffers on the IP efficiency, it seems that the concentration is not high enough to reduce the IgG - however, it is worth testing this the first time you do IP, since it is plausible that this will vary dependent on the source of your buffers (company used for PNK and ligase), or antibodies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2013 - 2:45 AM
  50. Hi Jernej,
    Thanks for the reply. The antibody I am using is definitely sensitive to the level of DTT found in the PNK buffer and I need to limit the over-all exposure of the column to DTT as much as possible. As a result, rather than using PNK as the 3' phosphatase, I would like to use an alkaline phosphatase. I noticed that in your ²010 NSMB paper you are using Shrimp Alkaline Phosphatase and in your ²009 Methods paper you use FAST AP. Did you find that the Shrimp phosphatase is significantly better ?

    Thanks again - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 8, 2013 - 3:52 PM
  51. Hi Greg, we don't have any evidence to suggest that one is better than the other for the on-bead reaction. At the time we were using SAP in the lab generally since it can be heat-inactivated, so therefore we also used it for on-bead (even though here you can't heat-inactivate it on beads). So you can go ahead with either one.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:29 AM
  52. I should also add that even though we didn't compare FAST AP and SAP, we did compare SAP with PNK, and we had a lot better results with PNK. It seems that SAP is not efficient as a 3' phosphatase. So it may be better for you to determine the minimal DTT amount in the buffer that is compatible with your antibody, and then continue using it with PNK and ligase. If you use fresh DTT, 1mM is likely to be sufficient both for PNK and RNA ligase.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:39 AM
  53. Thanks, I really appreciate the advice.
    -Greg

    Posted by: Greg C.
    February 9, 2013 - 9:03 AM
  54. Hi, thanks for the awesome video. I have two questions related to the reagents:
    1. What concentration is the PEG400? (it only says 4 ul in the protocol).
    ². Under "Reverse transcription", step 6, what is the pH of the TE buffer you use? Is it pH 8?
    Thank you very much for your help. -QT

    Reply
    Posted by: Qiumin T.
    February 7, 2013 - 1:22 PM
  55. Hi QT,
    (1) we are using PEG400 from Sigma (²0²398). It is a viscous liquid.
    (²) Yes, the it is pH 8
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 7, 2013 - 4:56 PM
  56. Thank you so much Julian. I have another question. Could you recommend a protocol for doing iCLIP with mouse brain tissue? Do you know whether the tissue prep steps from this protocol ( http://ago.rockefeller.edu/Ago_HITS_CLIP_Protocol_June_²009.pdf) will work well for iCLIP as well?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2013 - 5:52 PM
  57. This protocol should be fine. We also recently published a bookchapter about the iCLIP protocol which contains information on tissue samples and lots of other useful info and background:
    http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.100²/97835²764458².ch10/summary

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 14, 2013 - 5:19 AM
  58. The pre-publication version of the book chapter is available here: http://www².mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/jule/publications/Konig_wiley.pdf.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2013 - 1:54 PM
  59. I enjoyed reading about your updated iCLIP protocol in the book Tag-based Next Generation Sequencing from Wiley. I would be grateful for more details about the amount and activity of the 3²-P that you use to radioalabel the RNA. In both the book chapter and the JoVE article I see only volumes, not activities.

    In the figure for step 9, the radiolabel on the 5' end of the RNA is missing, but shouldn't it still be there? At what point in the protocol can we be reasonably sure that we are dealing with unlabeled material?

    Also, have you ever explored non-radioactive approaches to labeling, or is the sensitivity of these methods too low for the purposes of this protocol?

    Thanks!

    John

    Reply
    Posted by: John S.
    June 17, 2013 - 9:23 AM
  60. Dear John,

    with the current protocol most of the radioactivity is gone after the gel purification of the cDNA. You can increase this effect by treating the samples with RNAse after the reverse transcription (The radioactive RNA fragments then running much faster then the cDNAs in the gel). We are currently working on a protocol where we fragment the RNA by alkaline hydrolysis, which will be available soon (We want to avoid using too much RNAse at our desks).

    In addition you should always measure your samples with a Geiger counter. If your final PCRs are still hot, then you should decrease the fraction of beads that go into the labeling reaction.

    Best wishes,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    June 19, 2013 - 11:52 AM
  61. Hi,
    I have a question which relies on your experience with the data generated with CLIP:
    because of the UV irradiation the protein crosslinks to the RNA which even after proteinase K treatment presents an obstruction to the reverse transcriptase which therefore either skips or adds random nucleotide(s). So my question is that how long the deletions/insertions can be? Is it only one nucleotide or can also be 20?

    Thank you very much!!!

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    August 8, 2013 - 12:06 PM
  62. We see that >80% of cDNAs truncate at the crosslink site, and the mutations are quite rare in the remaining sequences. All we know about crosslink-induced mutations has been published here: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22863408.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2013 - 12:15 PM
  63. Thanks for your protocol. I have a question about the IgG background signal in the p32 labeled Western Blot. I used mouse IgG1 isotype as a control. I did not crosslink the IgG to the beads, so IgG1 stays around 50 and 25 KDa region. I do observe some radioactivity band around 50 kDa. Do you notice this in your experiments as well? Since it is close to my protein region, can you give me some suggestions to avoid this?

    Sincerely,
    Mei

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 9, 2013 - 1:42 PM
  64. We don't get a signal in control IP. Most likely this is an RBP that non-specifically binds under your conditions. It is important to wash with high-salt buffer, and rotate the tubes for ±5min during these washes. Also, diluting the lysate before IP may help. Standard IP optimisations, basically.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2013 - 2:24 PM
  65. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:29 AM
  66. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:57 AM
  67. Hi,
    I have 2 more questions. In this protocol you did not remove 5' phosphate of the RNA, can you still label the 5' side with P32 by PNK later? Another question, is it possible to just p32 label the RNA, cut the band, extract, degrade the protein and add 3' linker for RT later?

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:06 PM
  68. Normal PNK has phosphatase activity, so it can replace the 5' phosphate. The original CLIP protocol from Ule et al, Science 2003 added 3' linker after RNA extraction, but as explained in Ule et al, Methods 2005., the efficiency and purity of the protocol increases if linker is ligated on beads.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2013 - 2:15 PM
  69. Thanks for this amazing protocol and your rapid and very helpful exchange here in this site.

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:26 PM
  70. Hello, thank you for this wonderful protocol.
    I have a question:
    -I get positive Radioactive signal at the right size of positive CTRL used in this protocol in the NOT UV samples, it looks exactly as I was using high RNAse condition. why?
    I am phosphorylating the protein? is it possible?
    thank you

    Reply
    Posted by: jessica c.
    February 27, 2016 - 8:45 PM
  71. Hi Jessica, you are right, if you see signal in the non-UV control, this means that the protein is getting phosphorylated in some other way. If it has a kinase domain it may even phosphorylate itself. Or maybe some kinase is getting co-purified? You could check for this by omitting PNK from the phosphorylation reaction.

    Reply
    Posted by: Jernej U.
    March 16, 2016 - 11:07 AM

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