iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

Published 4/30/2011
71 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Die räumliche Anordnung der RNA-bindenden Proteinen auf eine Abschrift ist eine wichtige Determinante der post-transkriptionellen Regulation. Deshalb entwickelten wir individuelle-Nukleotid-Auflösung UV-Vernetzung und Immunpräzipitation (iClip), die eine präzise genomweite Kartierung der Bindungsstellen eines RNA-bindenden Proteins erlaubt.

Cite this Article

Copy Citation

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Die einzigartige Zusammensetzung und räumliche Anordnung der RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) auf ein Transkript führen die vielfältigen Aspekte der post-transkriptionellen Regulation 1. Daher ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis Transkript Regulierung auf der molekularen Ebene bis Positionsinformationen auf die Bindungsstellen der RBPs 2 Gain.

Protein-RNA Wechselwirkungen untersucht mit Hilfe biochemischer Methoden, aber diese Ansätze beziehen sich nicht auf RNA-Bindung in seiner nativen zellulären Kontext. Erste Versuche zur Protein-RNA-Komplexen in ihrer zellulären Umgebung Studie beschäftigt Affinitätsreinigung oder Immunpräzipitation mit Differential-Display-oder Mikroarray-Analyse (RIP-CHIP) 3-5 zusammengefasst. Diese Ansätze waren anfällig für die Identifizierung indirekte oder nicht-physiologischen Wechselwirkungen 6. Um die Spezifität und Ortsauflösung zu erhöhen, bezeichnet eine Strategie, um als CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) 7,8 eingeführt wurde. CLIP kombiniert UV-Vernetzung von Proteinen und RNA-Moleküle mit rigorosen Reinigung Systeme einschließlich denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese. In Kombination mit High-Throughput-Sequenzierung Technologien hat CLIP als ein mächtiges Werkzeug, um Protein-RNA-Wechselwirkungen auf einem genomweiten Maßstab (bezeichnet als HITS-CLIP oder CLIP-seq) 9,10 Studie unter Beweis gestellt. Kürzlich wurde PAR-CLIP eingeführt, photoreaktiven Ribonukleosid Analoga verwendet zur Vernetzung 11,12.

Trotz der hohen Spezifität der erhaltenen Daten, CLIP Experimente erzeugen oft cDNA-Bibliotheken von begrenzter Komplexität Folge. Dies ist zum Teil aufgrund der beschränkten Menge an Co-gereinigten RNA und die beiden ineffizient RNA Ligationsreaktionen für Bibliotheks-Vorbereitung erforderlich. Darüber hinaus gaben Primer Extension Assays, dass viele cDNAs vorzeitig abgeschnitten bei den vernetzten Nukleotid 13. Solche abgeschnitten cDNAs sind während der Standard-CLIP-Bibliothek Vorbereitung Protokoll verloren. Wir haben vor kurzem iClip (Einzel-Nukleotid-Auflösung CLIP), der die abgeschnittenen cDNAs erfasst durch den Ersatz eines der ineffizienten intermolekularen RNA Ligationsschritten mit einer effizienteren intramolekularen cDNA Umlaufverfahren (Abbildung 1) 14 entwickelt. Wichtig ist, dass die Sequenzierung des abgeschnitten cDNAs bietet Einblicke in die Position des Cross-Link-Website unter Nukleotid-Auflösung. Wir haben erfolgreich angewendet iClip zu hnRNP C Partikel Organisation auf einem genomweiten Maßstab Untersuchung und Bewertung ihrer Rolle in Spleißen Regel 14.

Protocol

1. UV-Vernetzung von Gewebekulturzellen

  1. Entfernen Sie die Medien und 6 ml eiskaltem PBS, um Zellen in einer 10 cm Platte (reicht für drei Versuchen) gewachsen.
  2. Entfernen Sie den Deckel und auf Eis stellen. Bestrahlen einmal mit 150 mJ / cm 2 bei 254 nm.
  3. Ernten Sie die Zellen, die durch Kratzen mit einem Zell-Lifter.
  4. Transfer 2 ml Zellsuspension jeweils drei Röhrchen. Spin bei Höchstgeschwindigkeit für 10 sec bei 4 ° C zu Pellet-Zellen, dann entfernen Überstand.
  5. Snap-freeze die Zellpellets auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Bead Vorbereitung

  1. 100 l Protein A Dynabeads (Dynal, 100,02) pro Experiment zu einem frischen Mikroröhrchen (Use Protein G Dynabeads für eine Maus oder Ziege-Antikörper).
  2. Wash Perlen 2x mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat; 1 / 100 Protease-Inhibitor-Cocktail III, Calbiochem).
  3. Resuspendieren Perlen in 100 ul Lysepuffer mit 2-10 pg Antikörper.
  4. Drehen Röhrchen bei Raumtemperatur für 30-60 min.
  5. Waschen mit 900 ul Lysepuffer 3x und verlassen in der letzten Waschung bis bereit, um fortzufahren auf 4,1 Schritt.

3. Zelllyse und partielle RNA Verdauung

  1. Zellpellet in 1 ml Lysepuffer und Transfer bis 1,5 ml Röhrchen.
  2. Bereiten Sie eine 1 / 500 Verdünnung von RNase I (Ambion, AM2295). Fügen Sie 10 ul RNase I Verdünnung sowie 2 ul Turbo DNase dem Zelllysat (1 / 500 RNase I Verdünnungen [low RNase] sind für die Bibliothek der Zubereitung verwendet, 1 / 50 Verdünnungen [high RNase] notwendig sind, um für die Antikörper-Spezifität control) .
  3. Inkubieren Sie die Proben für exakt 3 min bei 37 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Sofort auf Eis zu übertragen.
  4. Spin bei 4 ° C und 22.000 g für 20 min zum Lysat klar. Vorsichtig den Überstand (leave etwa 50 ul Lysat mit dem Pellet).

4. Immunpräzipitation

  1. Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Perlen (aus Schritt 2,5), dann fügen Sie das Zelllysat (aus Schritt 3.4).
  2. Drehen Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C.
  3. Überstand verwerfen und waschen Sie die Perlen 2x mit 900 ul High-Salz-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat).
  4. Wash 2x mit 900 ul Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% Tween-20).

5. Dephosphorylierung von RNA 3'-Enden

  1. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kügelchen in 20 ul PNK-Mix (15 ul Wasser, 4 ul 5x PNK pH 6,5-Puffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK Enzym, 0,5 ul RNasin [Promega]).
  2. Inkubieren für 20 min bei 37 ° C.
  3. Add 500 ul Waschpuffer waschen 1x mit Hochsalzpuffer.
  4. Wash 2x mit Waschpuffer.

6. Linkerligation bis 3 'Enden RNA

  1. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 20 ul Ligationsgemisch (9 ul Wasser, 4 ul 4x Ligationspuffer [200 mM Tris-HCl, 40 MM GCL 2; 40 mM Dithiothreitol], 1 ul RNA-Ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylierte Linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]).
  2. Inkubieren über Nacht bei 16 ° C.
  3. Add 500 ul Waschpuffer und dann waschen mit 1 ml Hochsalzpuffer 2x.
  4. Wash 2x mit 1 ml Waschpuffer und in 1 ml der zweiten waschen zu lassen.

7. RNA 5 'Ende Kennzeichnung

  1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 8 ul heißen PNK-Mix (0,4 ul PNK [NEB], 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul 10x PNK-Puffer [NEB]; 6 ul Wasser).
  2. Inkubieren für 5 min bei 37 ° C.
  3. Entfernen Sie die heißen PNK-Mix und resuspendieren die Perlen in 20 ul 1x NuPAGE Ladepuffer (Invitrogen).
  4. Inkubieren auf einem Thermomixer bei 70 ° C für 10 min.
  5. Unmittelbar auf einem Magneten Ort, um Niederschlag der leeren Perlen und Last der Überstand auf das Gel (siehe Schritt 8).

8. SDS-PAGE und Membran übertragen

  1. Laden Sie die Proben auf einem 4-12% NuPAGE Bis-Tris-Gel (Invitrogen) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 0,5 l 1x MOPS-Laufpuffer (Invitrogen). Auch Last 5 ul einer pre-gefärbten Protein-Größenmarker (zB PAGE Herrscher plus, Fermentas, SM1811).
  2. Führen Sie das Gel für 50 min bei 180 V.
  3. Entfernen Sie das Gel vor und entsorgen Sie als feste Abfälle (enthält freie radioaktive ATP).
  4. Übertragen Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran mit dem Novex nassen Übertragung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, je 1 h bei 30 V).
  5. Nach der Übertragung, spülen Sie die Membran in PBS-Puffer, dann wickeln Sie es in Frischhaltefolie und setzen Sie es zu einem Fuji-Film bei -80 ° C (statt einem fluoreszierenden Aufkleber neben der Membran zu einem späteren Zeitpunkt align ter Film und die Membran; durchführen Forderungen für 30 min, 1h und über Nacht).

9. RNA-Isolierung

  1. Isolieren Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Low-RNase Experiment mit dem Autoradiogramm von Schritt 8.5 als eine Maske. Cut dieses Stück Membran in mehrere kleine Scheiben schneiden und diese in ein 1,5 ml Mikroröhrchen.
  2. Geben Sie 200 ul PK-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) und 10 ul Proteinase K (Roche, 03115828001) an die Membran Stücke. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 20 min bei 37 ° C.
  3. Add 200 ul PKurea Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M Harnstoff) und Inkubation für 20 min bei 37 ° C.
  4. Sammeln Sie die Lösung und fügen Sie ihn zusammen mit 400 ul RNA Phenol / Chloroform (Ambion, 9722) zu einem 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohr (713 bis 2536, VWR).
  5. Inkubieren für 5 min bei 30 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Trennen Sie die Phasen, durch Drehen für 5 min bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur.
  6. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen (darauf achten, nicht auf das Gel mit der Pipette berühren). Add 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) und 40 ul 3 M Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C.

10. Reverse Transkription

  1. Spin für 20 min bei 15.000 rpm und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 0,5 ml 80% Ethanol.
  2. Das Pellet in 7,25 ul RNA / Primer-Mix (6,25 &mgr; l Wasser, 0,5 ul Rclip Primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP-Mix [10 mM]). Für jedes Experiment oder replizieren, verwenden Sie ein anderes Rclip Primer mit individuellen Barcode-Sequenzen (siehe 14).
  3. Inkubieren für 5 min bei 70 ° C vor dem Abkühlen auf 25 ° C.
  4. Add 2,75 ul RT-Mix (2 ul 5x RT-Puffer, 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III-Reverse-Transkriptase [Invitrogen]).
  5. Inkubieren 5 min bei 25 ° C, 20 min bei 42 ° C, 40 min bei 50 ° C und 5 min bei 80 ° C vor dem Abkühlen auf 4 ° C.
  6. Add 90 ul TE-Puffer, 0,5 ul glycoblue und 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C.

11. Gel Reinigung der cDNA

  1. Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 6 l Wasser.
  2. Add 6 ul 2x TBE-Harnstoff-Ladepuffer (Invitrogen). Hitze Proben bis 80 ° C für 3 min direkt vor dem Laden.
  3. Laden Sie die Proben auf einem vorgefertigten 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) und führen Sie für 40 min bei 180 V, wie vom Hersteller beschrieben. Auch Last mit niedrigem Molekulargewicht-Marker für die spätere Schneiden (siehe unten).
  4. Cut drei Bands bei 120-200 nt (hoch), 85-120 nt (medium) und 70-85 nt (low). Verwenden Sie theupper Farbstoff und die Markierungen auf der Kunststoff-Gel unterstützt Exzision Guide (siehe Abbildung 3). Beachten Sie, dass die Rclip Primer und der L3-Sequenz machen zusammen über 52 nt der CLIP-Sequenz.
  5. Add 400 ul TE zugeben und Gelscheibe in kleine Stücke mit einer 1 ml Spritze Kolben. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 2 h bei 37 ° C.
  6. Legen Sie zwei 1 cm Glas Vorfilter (Whatman, 1823010) in eine Costar SpinX Spalte (Corning Incorporated, 8161). Die Flüssigkeit Teil der Probe auf die Säule. Spin für 1 min bei 13.000 rpm in ein 1,5 ml-Tube.
  7. Add 0,5 ul glycoblue und 40 ul Natriumacetat pH 5,5, dann mischen Sie die Probe. 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C.

12. Ligation der Primer 5'-Ende der cDNA

  1. Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 8 ul Ligationsgemisch (6,5 ul Wasser, 0,8 ul 10x CircLigase Buffer II, 0,4 ul 50 mM MnCl 2, 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) und inkubieren 1 h bei 60 ° C.
  2. Zugabe von 30 ul Oligo Glühen Mix (26 ul Wasser, 3 ul FastDigest Buffer [Fermentas], 1 ul cut_oligo [10 uM]). Inkubation für 1 min bei 95 ° C. Dann verringern Sie die Temperatur alle 20 sec um 1 ° C bis 25 ° C erreicht sind.
  3. Add 2 ul BamHI (Fast Fermentas) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
  4. Dann werden 50 ul TE und 0,5 ul glycoblue und mischen. Fügen Sie 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen, dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol. Mix wieder und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C.

13. PCR-Amplifikation

  1. Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Pellet in 19 ul Wasser.
  2. Bereiten Sie die PCR-Mix (19 ul cDNA, 1 ul Primer-Mix P5/P3 Solexa, 10 uM jedes, 20 ul Accuprime Supermix 1-Enzym [Invitrogen]).
  3. Führen Sie den folgenden PCR-Programm: 94 ° C für 2 min, [94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 68 ° C für 30 sec] 25-35 Zyklen, 68 ° C für 3 min, 4 ° C für immer.
  4. Mix 8 ul PCR-Produkt mit 2 ul 5x TBE-Ladepuffer und Last auf einem vorgefertigten 6% TBE-Gel (InvitRogen). Stain das Gel mit SybrGreen I (Invitrogen) und zu analysieren, mit einem Gel-Imager.
  5. Der Barcode in der Rclip Primer erlauben Multiplex verschiedenen Proben vor der Einreichung für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Submit 15 ul der Bibliothek für die Sequenzierung und speichern Sie die Ruhe.

14. Linker und Primersequenzen

Pre-adenylierte 3 'Linker-DNA:

[Wir bestellen die DNA-Adapter von IDT und dann Aliquots von 20 um.]

DNA

15. Repräsentative Ergebnisse:

Vor Sequenzierung des iClip Bibliothek kann der Erfolg des Experiments auf zwei Schritte überwacht werden: die Autoradiogramm des Protein-RNA-Komplex nach Membran übertragen (Schritt 8,5) und das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13,4). Im Autoradiogramm des Low-RNase Proben sollten diffuse Radioaktivität über dem Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 4) gesehen werden. Für High-RNase Proben ist diese Radioaktivität konzentriert näher an das Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 3). Wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte kein Signal erkannt wird (Abb. 2, Proben 1 und 2). Weitere wichtige Steuerelemente für die Spezifität der Immunpräzipitation entweder weglassen UV-Bestrahlung oder Zellen, die nicht exprimieren das Protein von Interesse 14.

Das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13.4) sollte eine Größenordnung, die die cDNA Fraktion (hoch, mittel oder niedrig) in Schritt 11,4 (Abbildung 4, Spuren 4-6) gereinigt entspricht. Beachten Sie, dass die PCR-Primer P3Solexa und P5Solexa eine zusätzliche 76 nt einzuführen, um die Größe der cDNA. Wenn keine Antikörper während der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte keine entsprechende PCR-Produkten nachgewiesen werden (Abbildung 4, Spuren 1-3). Primer-Dimer Produkt kann bei etwa 140 nt erscheinen.

Für repräsentative Ergebnisse der Hochdurchsatz-Sequenzierung und anschließende bioinformatischen Analysen siehe 14.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der iClip-Protokoll. Protein-RNA-Komplexen sind kovalent in vivo mittels UV-Bestrahlung (Schritt 1)-vernetzt. Das Protein von Interesse ist zusammen mit der gebundenen RNA (Schritte 2-5) gereinigt. Um für die Sequenz-spezifische Grundierung der reversen Transkription wird eine RNA-Adapter an den 3 ligiert 'Ende der RNA, während das 5'-Ende radioaktiv markiert wird (Schritt 6 und 7). Vernetzte Protein-RNA-Komplexe werden von freien RNA mittels SDS-PAGE und Membran übertragen (Schritt 8) gereinigt. Die RNA wird von der Membran durch Verdau des Proteins mit Proteinase K Verlassen eines Polypeptids Verbleib in der Cross-Link Nukleotid (Stufe 9) gewonnen. Reverse Transkription (RT) schneidet bei den restlichen Polypeptid und führt zwei spaltbare Adapter Regionen und Barcode-Sequenzen (Schritt 10). Größe Auswahl entfernt freies RT Primer vor Umlaufverfahren. Die folgenden Linearisierung erzeugt geeignete Vorlagen für die PCR-Amplifikation (Schritte 11-15). Schließlich erzeugt der Hochdurchsatz-Sequenzierung liest, in dem die Barcode-Sequenzen unmittelbar von den letzten Nukleotid der cDNA (Schritt 16). Da diese Nukleotid lokalisiert eine Position vor dem vernetzten Nukleotid kann die Bindungsstelle mit hoher Auflösung abgeleitet werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Autoradiogramm vernetzten hnRNP C-RNA-Komplexen mit denaturierende Gelelektrophorese und Membran übertragen. hnRNP C-RNA-Komplexe wurden aus Zellextrakten mit einem Antikörper gegen hnRNP C Immun-gereinigt (α hnRNP C, die Proben 3 und 4). RNA wurde teilweise verdaut mit niedriger (+) oder hohen (+ +)-Konzentration von RNase. Komplexe Verschiebung nach oben aus der Größe des Proteins (40 kDa) zu beobachten (Probe 4). Die Verschiebung ist weniger ausgeprägt, wenn hohe Konzentrationen von RNase verwendet wurden (Probe 3). Das radioaktive Signal verschwindet, wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wurde (Proben 1 und 2).

Abbildung 3
Abbildung 3. Schematische 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) zur Führung der Exzision iClip cDNA-Produkte. Das Gel wird für 40 min bei 180 V führt zu einem reproduzierbaren Migration Muster von cDNAs und Farbstoffe (hell-und dunkelblau) in das Gel laufen. Verwenden einer Rasierklinge zu schneiden (rote Linie) die hohe (H), medium (M) und niedrig (L) cDNA-Fraktionen. Beginnen Sie mit dem Schneiden in der Mitte des hellblauen Farbstoff und unmittelbar oberhalb der Markierung auf der Kunststoff-Gel-Kassette. Teilen Sie die mittleren und niedrigen Fraktionen und schneiden den hohen Anteil von etwa 1 cm oberhalb der leichten blauen Farbstoff. Verwenden Sie vertikale Schnitte durch die Taschen und der Farbstoff geführt, um die verschiedenen Bahnen (in diesem Beispiel 1-4) zu trennen. Der Marker Spur (m) ergibt gebeizt und abgebildet, die KontrolleGrößen nach dem Schneiden. Fragmentgrößen sind auf der rechten Seite angegeben.

Abbildung 4
Abbildung 4. Analyse von PCR-amplifizierten iClip cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Gel-Elektrophorese. RNA erholte sich von der Membran (Abbildung 1) wurde revers transkribiert und die Größe der unter Verwendung denaturierende Gelelektrophorese (Abbildung 2). Drei Kornfraktionen von cDNA (hohe [H]: 120-200 nt-, mittel-[M]: 85-120 nt und niedrige [L]: 70-85 nt) wurden gewonnen, zirkularisiert, wieder linearisiert und PCR-amplifiziert. PCR-Produkte von unterschiedlichen Größenverteilung kann als Ergebnis der unterschiedlichen Größen der Eingangs-Fraktionen beobachtet werden. Da die PCR-Primer stellt 76 nt der cDNA sollte Größen zwischen 196-276 nt für hohe, 161-196 nt Bereich für mittlere und 146-161 nt für geringe Größe Fraktionen. PCR-Produkte fehlen, wenn keine Antikörper für die Immunpräzipitation (Spuren 1-3) verwendet wurde.

Discussion

Da die iClip Protokoll enthält ein breites Spektrum von enzymatischen Reaktionen und Reinigungsschritte, ist es nicht immer leicht zu einem Problem, wenn ein Experiment nicht zu identifizieren. Um die Spezifität der identifizierten RNA Cross-Link-Sites kontrollieren, sollten eine oder mehrere negative Kontrollen während des gesamten Experiments und anschließender rechnerische Analysen beibehalten werden. Diese Kontrollen können die nicht-Antikörper-Probe, die nicht-vernetzten Zellen oder Immunpräzipitation von Knockout-Zellen oder Gewebe sein. Idealerweise sollten diese Kontrollversuche nicht reinigen jedes Protein-RNA-Komplexen, und sollte daher kein Signal auf dem SDS-PAGE-Gel und keine nachweisbaren Produkte nach PCR-Amplifikation zu geben. Hochdurchsatz-Sequenzierung dieser Kontrolle Bibliotheken zurückgeben sollte nur sehr wenige eindeutige Sequenzen. Knockdown-Zellen sind nicht als Ablaufsteuerung empfohlen, da die resultierenden Sequenzen noch zu vernetzen Standorte des gleichen Proteins, das aus Knockdown-Zellen in kleineren Mengen gereinigt entsprechen.

Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine Kontamination mit PCR-Produkten aus früheren Experimenten zu vermeiden. Der beste Weg, um dieses Problem zu minimieren, ist räumlich getrennt Pre-und Post-PCR-Schritte. Idealerweise sollte die Analyse der PCR-Produkte und alle nachfolgenden Schritte in einem separaten Raum durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte jedes Mitglied der Labor seinen eigenen Satz von Puffern und anderen Reagenzien. Auf diese Weise können Kontaminationsquellen leichter identifiziert werden.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Die Autoren danken allen Mitgliedern der Ule, Luscombe und Zupan Labors für die Diskussion und experimentelle Mitarbeit. Wir danken James Hadfield und Nik Matthews für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Wir möchten darauf hinweisen, dass der iClip hier beschriebene Verfahren teilt mehrere Schritte mit dem Original-CLIP-Protokoll von Kirk Jensen und JU im Labor von Robert Darnell entwickelt. Diese Arbeit wurde von der European Research Council gewähren 206726-CLIP zur JU und eine langfristige Human Frontiers Science Program Stipendium für JK unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Comments

71 Comments

  1. Hi,

    First I would like to say this latest method is really neat. I also like Julian's comment at the end of the video when he said with a big smirk, "You have to perform each of the 64 steps with 100% accuracy". :D That is epic.

    On a more serious note, I am just wondering if anyone can suggest what sort of primer I should use if I want to start by cloning my insert into TOPO vector instead of doing nextGen sequencing. Any help is appreciated.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 3:47 AM
  2. Hi Paul, thanks for your fun comment! TOPO cloning dŒsn²17;t require any specific primer, so you could use the one described in the protocol. Unless you wish to do something specific, such as concatemerization of sequences before inserting them into vector. Feel free to post more questions! Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 11, 2011 - 4:19 PM
  3. For more iCLIP questions and answers, use the following Googledoc: http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 11:28 AM
  4. Hi Jernej,
    Is it possible to use a 3' linker with a phosphorylated 5' end instead of a pre-adenylated 5' end and adding some ATP during the 3' linker ligation step? Thanks. Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 10:13 PM
  5. Yes, just follow the protocol as described in Konig et al, NSMB ²010 (PMID ²0601959). More on Googledoc.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 14, 2011 - 3:48 AM
  6. Hi Jernej,

    Sorry to keep bombarding you with questions. In the supplementary section of your NSMB ²010 paper, shrimp alkaline phosphatase was used to desphosphorylate 3' ends. My understanding is that SAP can only desphosphorylate 5' ends. I am wondering if you had dephosphorylated 3' ends step using PNK before using SAP to dephosphorylate 5' ends.

    Quote from Konig et al, NSMB ²010: "For dephosphorylation of 3²4²; ends, Dynabeads were resuspended in ² µl 10&#²15; Shrimp alkaline phosphatase buffer (Promega), 17.5 µl H²O and 0.1 µl Shrimp alkaline
    phosphatase (Promega) and incubated at 37°C for 10 min with intermittent shaking (10 sec at 700 rpm followed by ²0 sec pause)."

    Thank you again for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 4:04 AM
  7. We did use SAP in the NSMB protocol - it dŒsn't work as well as PNK on the 3' ends. We couldn't use PNK at the time, because PNK carryover into ligation reaction would create problems in the presence of ATP. In jove protocol, ligation reaction lacks ATP, therefore we can use PNK to dephosphorylate the 3' ends.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 6:30 PM
  8. Hi Jernej,

    On 3.² it says add ²ml Turbo DNAse into the 1.5 ml tube. I am wondering if that amount is correct.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 11:45 PM
  9. Hello Paul,
    you are right, it should be two micro liters. Sorry for that, I will try to have it changed,
    Julian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 6:56 AM
  10. Hi Jernej, great protocol! Just a precision, the L3 oligo is a pre-adenylated DNA or RNA oligo? Not clear as the original Clip and iClip uses RNA...

    Thanks a bunch,

    Marco

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 3:58 PM
  11. Hi Marco. It's a DNA oligo. Best, Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 4:02 PM
  12. Hi Jernej,

    I am wondering if the 3²P-ATP batch that you normally use in your lab for step 6.1 always has close to a 100% reported radioactivity. What is the lowest percentage of remaining 3²P that you can usually still get away with? I can still get some decent signal when using 3²P-ATP that has ~50-60% remaining radioactivity but my bands on the films are not as intense as the one that I see in your publications. I am trying to work out the best schedule for ordering some 3²P-ATP and starting my experiments. Thanks again.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 11:32 PM
  13. We don't use ATP if it's more than two weeks old, thus we have >50% radioactivity. But signal intensity also depends on the efficiency of crosslinking and IP,and amount of protein expression in the cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2011 - 4:23 AM
  14. Hi Jernej,
    Thank you for the protocol. What results if I reduce the cell samples to 100-1000 (not 10*6-7 cells) ? Thanks for your reply.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 12:24 AM
  15. That would be challenging. If you have an abundant protein that cross-links well to RNA, then it might be possible. So try running the radioactive protein-RNA complex on the gel - if you good signal after overnight exposure, then it's doable.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 4:52 AM
  16. Hi, Jernej !
    Thank you for the reply. I have another questions: How stable if the RNA-RNA and RNA-Protein photocrosslinking? How to degrade these proteins or remove the photocrosslinking? Thank you a lots.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 6:36 AM
  17. Hi Jernej,

    I again have some more questions. Do you still expose the nitrocellulose membrane at -80C when using phosphoimager instead of a film? I'm also wondering what exposure time your lab uses when using a phosphorimager screen.

    Secondly, I am wondering how many libraries containing different barcodes you can run together in a single flow cells.

    Thank you again Jernej. This protocol has been extremely useful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:49 PM
  18. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  19. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  20. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  21. Hi Jernej,

    In regards to one of the FAQs from Google docs.

    - When analysing PCR products, I see a band corresponding to the size of primer dimers, especially in the sample that was cut low from cDNA gel.

    Yes, it is common to see this band in the sample that was cut low from cDNA gel, and sometimes also in other samples. This is due to contamination from short cDNAs that only contain the sequence of RT primer. If this primer dimer is the dominant product on gel, we advise against sequencing the corresponding sample.

    I seem to be getting this short cDNA contamination all the time. Do you have any advice on how I could try to minimise the contamination? Have you ever isolated fragments of correct-size cDNA from a TBE-urea gel and sent only the isolated fragment for sequencing when you have short cDNA contaminations? Do you think that will work? I think that the concentration of L3 linker that I had used might have been too much. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 7:45 PM
  22. There are several possible reasons for this. Maybe one aspect of the protocol is not working, and therefore you are not producing any specific cDNA. If you have no cDNA input, then with enough cycles, you can amplify the primer-primer from any part of the gel. If you are using mammalian cells, try to get the protocol working first with hnRNP C or TIA with Santa cruz antibodies that we used in recent publications. Otherwise, using too much L3 can be a problem.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 23, 2011 - 4:35 AM
  23. Very useful protocol. I have two questions.

    1. For dephosphorylation of RNA 3'ends, pH 6.5 PNK buffer is used, rather than the pH 7.6 buffer, provided by NEB. Have you compared these two conditions internally?
    ². In the protocol, the final PCR product is not isolated and quantitated before submitting for the sequencing. Are there any potential problems of doing these two steps? Can I isolate the PCR product and re-PCR using the same primers to get more product (for Illumina Hiseq)? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 3:40 PM
  24. You can find more related answers in Googledoc http://goo.gl/4tSci, but short answers are also below:

    1. We haven²17;t compared conditions, but increased phophatase activity of PNK at lower pH has been reported in literature, you can read more in the Pubmed ID 1184²1²0.

    ². The PCR product needs to be quantified. We use both qPCR and bioanalyser. Normally, the products of the first PCR should look clean on the gel, otherwise it is a sign of a library that is of low complexity, and is unlikely to generate informative data. Therefore we advise against re-PCR, but it can be done as the last resource.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 4:56 PM
  25. Hi Jernej,

    I noticed you use +/- 10 multiplexed libraries; I was wondering if you knew how many are necessary for a successful run (i.e. to provide sufficient distribution for cluster identification)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:20 PM
  26. The way the primers are designed here, no multiplexing is necessary, because the first three nucleotides in the primer sequence are random (part of randomer = NNN).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:28 PM
  27. I appreciate your experiment. I have some qeustions.

    In this protocol, what dŒs barcode do high-throughout squencing?

    I don't understand function of barcode



    Reply
    Posted by: seung kuk P.
    May 23, 2012 - 6:45 AM
  28. Hi,
    this might be a really naive question but I'm wondering at the UV cross linking step, when you say you irradiate once, dŒ's this mean 1 min?

    Thank you!
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    June 18, 2012 - 1:19 PM
  29. Hello, Thank you for this helpful technique, I just have a question. My experiments protocols are: 1. UV-crosslink RNA-protein; ². Isolate the RNA-protein complex by immunopricitation; 3. Isolate the binding RNA. 3²P-labeling the binding RNA. 4. Analysis the RNA by microarray.
    Because I do not need to sequence the RNA, and I only want to isolate the binding RNA for microarray analysis after UV-crosslink RNA-protein, so I wonder whether I need to do the step 5-7 in your protocols or I could skip from step 4 to step 8 in your protocol?

    Thanks very much, I look forward to your kind reply!

    Sean

    Reply
    Posted by: xiaoyun w.
    July 22, 2012 - 9:09 PM
  30. It is unlikely you will have enough cDNA for microarray hybridisation without some kind of amplification. You can try using steps 4-8, but you could also amplify in other ways.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2012 - 6:03 AM
  31. Hi Jernej,

    Is there any published article on how to analyse iCLIP's high-throughput sequencing data? I have just got my sequencing results back following steps in your protocol. I want to make sure I check with you before digging into the data. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 1, 2012 - 10:15 PM
  32. The article is not yet published, but is in preparation by Tomaz Curk ( http://www.fri.uni-lj.si/en/tomaz-curk/), who made a public server: http://icount.biolab.si/. You can contact Tomaz at tomaz.curk@fri.uni-lj.si for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2012 - 5:47 AM
  33. Hi,
    it is so powerful technique! But I cannot IP any protein follow protocol. Is there any difference in affinity between different antibodies and their antigen? Could you give me some advice? Maybe we could decrease concentration of SDS or sodium deoxycholate?
    Thanks, I look forward to your kind reply!
    Min

    Reply
    Posted by: Min S.
    August 5, 2012 - 11:04 PM
  34. Hi Min, you can find advice on IP googledoc http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 3:35 AM
  35. Hi Jernej,

    With the barcoding system, I am just wondering if the three random nucleotides are there for indexing purpose during Illumina sequencing run but it's not necessary for splitting the different libraries later on. For RC1, the sequencing results will be something like NNNGGTTNN.... During analysis, do you usually trim the 3-bp from the 5'-end of the results and split the different replicates after the trimming step? I have just realised this was slightly different to the barcoding system used in your NSMB paper. -paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 9:41 PM
  36. Hi Paul! You can find the answer under the topic of "Use of random barcode in data analysis" in http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2012 - 7:58 AM
  37. Hi Jernej,

    I started optimising CLIP couple of months ago and I'm at the stage that I'm convinced that I can efficiently cross link RNA to my protein (checked it by specific qRT PCR). I'm lucky because I don't need to fiddle with the IP since I've optimised before and works fine. But just to double check, after IP and western blotting a smear and a lower amount of original kDa protein is a good sing for cross linking yes?
    So my problems started at the RNase A step, I don't see any changes in size/appearance on WB after treatment... I'm convinced that my protein creates a massive complex (couple of 100 kDa) and it is because my target RNA is 10 kb to start with and there are at least 3 proteins binding to it. I'm working with a RNA virus, that's the explanation for it. I think the reason I don't see any change in kDA is because the complex dŒsn't even enter the gel to start up with. Although I used the given buffer which should break any membrane apart but the proteins are still there possibly protecting the RNA. Did you ever come across similar problems and would you have any suggestions? Also, I understand that the RNase trimming is necessary for the efficient RT step but is it a problem if the RNA is too long? What is too long? DŒs this depend on the RT enzyme used I recon or is this also important for the sequencing?

    I would greatly appreciate yur help because I'm stuck...

    Thank you,
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    October 10, 2012 - 7:38 AM
  38. Hi Zsofi,

    For partial RNAse digestion we use RNase I (step 3). We use two different concentrations: a lower one that makes fragments with a mean between 50-100 bp and a higher concentration that fragments RNA to around 10bp. The lower one is used for preparing libraries, the higher one is used for analytical reasons.

    The RNAse step is important to (1) allow the protein RNA complex enter the Gel (²) to narrow down the crosslink site to a fragment with a size compatible with high throughput sequencing (maximum around 300 bp). So you definitely need to optimize this step for your experiments.

    If the complex you are studying is not covalently linked it should fall apart during the denaturing Gel run. Only a small fraction of your complex will have all the proteins of your complex crosslinked to the RNA at the same time since crosslinking is a very inefficient step. Therefore with the higher RNAse concentration you should be able to see a radioactive signal at the size of the protein you are studying.

    I hope that helps, best regards,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    October 11, 2012 - 9:49 AM
  39. Hi Julian,

    I have had some trouble with the RNase step when nuclease-ing the total lysate... In my troubleshooting efforts I read that RNase I is inhibited by 0.1% SDS, which is the concentration used in your lysis buffer. It dŒsn't seem that you guys have any problem though...do you think this is due to using an excess of RNase I or what? Just curiously confused. Thanks,

    sam

    Reply
    Posted by: Sam F.
    February 5, 2013 - 6:00 PM
  40. Hi Sam,

    in our experience the inhibition of RNase I by SDS is not an issue. You just optimize the concentration of RNase I to obtain the desired fragmentation. If you have problems doing that with your buffer conditions, you could also do the RNase digestion on the beads instead of in the lysate.

    Best,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 6, 2013 - 6:19 AM
  41. Thanks for the quick reply Julian. Your recommendation to do the "on bead" digestion is exactly what I have done and it seems to be working fine. Cheers

    Posted by: Sam F.
    February 6, 2013 - 10:12 AM
  42. Hi,

    I was wondering how many minutes have you irradiated the cells in case of HNRNP C?

    Reply
    Posted by: Niaz M.
    November 26, 2012 - 6:29 PM
  43. Hi Niaz,
    we are normally not measuring time of irradiation but the Energy per square centimeter:
    Step 1.²: ... Irradiate once with 150 mJ/cm² at ²54 nm.
    In our Stratalinker this takes 50s. However time of irradiation is not very informative here since it changes with the age or quality of the lamps, etc.
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    November 27, 2012 - 6:20 AM
  44. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  45. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  46. Hi Lisa,

    it is correct that the ends of P3 and P5 primers are the same. This is because of Illumina's primer design for their high throughput sequencing platform. When you look at the 3' end of the Rclip primers (after the Bamhi cleavage site) you can see that they are actually complementary to the 3'end of the L3 adapter.

    Cheers,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    December 18, 2012 - 10:05 AM
  47. I got it !!!
    Thank you :)

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 1:11 PM
  48. Hi
    Thanks for the protocol. I have one question that has been bothering me, though. Both the RNA ligase and PNK buffers will expose the antibody column to relatively high dithiothreitol (DTT) concentrations (10 mM and 5 mM respectively). Why dŒsn't this destroy the column by reducing the disulphide bonds holding the heavy and light antibody chains together? Have you ever tried to improve the immunoprecipitation step by attempting to minimize the DTT concentration as much as possible or is this not an issue. Any assistance would be greatly appreciated. Thanks - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 3, 2013 - 2:13 PM
  49. Hi Greg, we haven't seen an effect of the DTT in the buffers on the IP efficiency, it seems that the concentration is not high enough to reduce the IgG - however, it is worth testing this the first time you do IP, since it is plausible that this will vary dependent on the source of your buffers (company used for PNK and ligase), or antibodies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2013 - 2:45 AM
  50. Hi Jernej,
    Thanks for the reply. The antibody I am using is definitely sensitive to the level of DTT found in the PNK buffer and I need to limit the over-all exposure of the column to DTT as much as possible. As a result, rather than using PNK as the 3' phosphatase, I would like to use an alkaline phosphatase. I noticed that in your ²010 NSMB paper you are using Shrimp Alkaline Phosphatase and in your ²009 Methods paper you use FAST AP. Did you find that the Shrimp phosphatase is significantly better ?

    Thanks again - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 8, 2013 - 3:52 PM
  51. Hi Greg, we don't have any evidence to suggest that one is better than the other for the on-bead reaction. At the time we were using SAP in the lab generally since it can be heat-inactivated, so therefore we also used it for on-bead (even though here you can't heat-inactivate it on beads). So you can go ahead with either one.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:29 AM
  52. I should also add that even though we didn't compare FAST AP and SAP, we did compare SAP with PNK, and we had a lot better results with PNK. It seems that SAP is not efficient as a 3' phosphatase. So it may be better for you to determine the minimal DTT amount in the buffer that is compatible with your antibody, and then continue using it with PNK and ligase. If you use fresh DTT, 1mM is likely to be sufficient both for PNK and RNA ligase.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:39 AM
  53. Thanks, I really appreciate the advice.
    -Greg

    Posted by: Greg C.
    February 9, 2013 - 9:03 AM
  54. Hi, thanks for the awesome video. I have two questions related to the reagents:
    1. What concentration is the PEG400? (it only says 4 ul in the protocol).
    ². Under "Reverse transcription", step 6, what is the pH of the TE buffer you use? Is it pH 8?
    Thank you very much for your help. -QT

    Reply
    Posted by: Qiumin T.
    February 7, 2013 - 1:22 PM
  55. Hi QT,
    (1) we are using PEG400 from Sigma (²0²398). It is a viscous liquid.
    (²) Yes, the it is pH 8
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 7, 2013 - 4:56 PM
  56. Thank you so much Julian. I have another question. Could you recommend a protocol for doing iCLIP with mouse brain tissue? Do you know whether the tissue prep steps from this protocol ( http://ago.rockefeller.edu/Ago_HITS_CLIP_Protocol_June_²009.pdf) will work well for iCLIP as well?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2013 - 5:52 PM
  57. This protocol should be fine. We also recently published a bookchapter about the iCLIP protocol which contains information on tissue samples and lots of other useful info and background:
    http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.100²/97835²764458².ch10/summary

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 14, 2013 - 5:19 AM
  58. The pre-publication version of the book chapter is available here: http://www².mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/jule/publications/Konig_wiley.pdf.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2013 - 1:54 PM
  59. I enjoyed reading about your updated iCLIP protocol in the book Tag-based Next Generation Sequencing from Wiley. I would be grateful for more details about the amount and activity of the 3²-P that you use to radioalabel the RNA. In both the book chapter and the JoVE article I see only volumes, not activities.

    In the figure for step 9, the radiolabel on the 5' end of the RNA is missing, but shouldn't it still be there? At what point in the protocol can we be reasonably sure that we are dealing with unlabeled material?

    Also, have you ever explored non-radioactive approaches to labeling, or is the sensitivity of these methods too low for the purposes of this protocol?

    Thanks!

    John

    Reply
    Posted by: John S.
    June 17, 2013 - 9:23 AM
  60. Dear John,

    with the current protocol most of the radioactivity is gone after the gel purification of the cDNA. You can increase this effect by treating the samples with RNAse after the reverse transcription (The radioactive RNA fragments then running much faster then the cDNAs in the gel). We are currently working on a protocol where we fragment the RNA by alkaline hydrolysis, which will be available soon (We want to avoid using too much RNAse at our desks).

    In addition you should always measure your samples with a Geiger counter. If your final PCRs are still hot, then you should decrease the fraction of beads that go into the labeling reaction.

    Best wishes,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    June 19, 2013 - 11:52 AM
  61. Hi,
    I have a question which relies on your experience with the data generated with CLIP:
    because of the UV irradiation the protein crosslinks to the RNA which even after proteinase K treatment presents an obstruction to the reverse transcriptase which therefore either skips or adds random nucleotide(s). So my question is that how long the deletions/insertions can be? Is it only one nucleotide or can also be 20?

    Thank you very much!!!

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    August 8, 2013 - 12:06 PM
  62. We see that >80% of cDNAs truncate at the crosslink site, and the mutations are quite rare in the remaining sequences. All we know about crosslink-induced mutations has been published here: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22863408.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2013 - 12:15 PM
  63. Thanks for your protocol. I have a question about the IgG background signal in the p32 labeled Western Blot. I used mouse IgG1 isotype as a control. I did not crosslink the IgG to the beads, so IgG1 stays around 50 and 25 KDa region. I do observe some radioactivity band around 50 kDa. Do you notice this in your experiments as well? Since it is close to my protein region, can you give me some suggestions to avoid this?

    Sincerely,
    Mei

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 9, 2013 - 1:42 PM
  64. We don't get a signal in control IP. Most likely this is an RBP that non-specifically binds under your conditions. It is important to wash with high-salt buffer, and rotate the tubes for ±5min during these washes. Also, diluting the lysate before IP may help. Standard IP optimisations, basically.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2013 - 2:24 PM
  65. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:29 AM
  66. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:57 AM
  67. Hi,
    I have 2 more questions. In this protocol you did not remove 5' phosphate of the RNA, can you still label the 5' side with P32 by PNK later? Another question, is it possible to just p32 label the RNA, cut the band, extract, degrade the protein and add 3' linker for RT later?

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:06 PM
  68. Normal PNK has phosphatase activity, so it can replace the 5' phosphate. The original CLIP protocol from Ule et al, Science 2003 added 3' linker after RNA extraction, but as explained in Ule et al, Methods 2005., the efficiency and purity of the protocol increases if linker is ligated on beads.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2013 - 2:15 PM
  69. Thanks for this amazing protocol and your rapid and very helpful exchange here in this site.

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:26 PM
  70. Hello, thank you for this wonderful protocol.
    I have a question:
    -I get positive Radioactive signal at the right size of positive CTRL used in this protocol in the NOT UV samples, it looks exactly as I was using high RNAse condition. why?
    I am phosphorylating the protein? is it possible?
    thank you

    Reply
    Posted by: jessica c.
    February 27, 2016 - 8:45 PM
  71. Hi Jessica, you are right, if you see signal in the non-UV control, this means that the protein is getting phosphorylated in some other way. If it has a kinase domain it may even phosphorylate itself. Or maybe some kinase is getting co-purified? You could check for this by omitting PNK from the phosphorylation reaction.

    Reply
    Posted by: Jernej U.
    March 16, 2016 - 11:07 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats